Name: Laterale Root inducibile di sistema in Arabidopsis E mais (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-14T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Impara il sistema di induzione di radici laterali in Arabidopsis e mais per studiare lo sviluppo radicale. Questo metodo in vitro consente l'induzione sincrona e l'analisi citologica delle radici.

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Gli autori ringraziano Davy Opdenacker per l'assistenza tecnica e la fotografia. Ringraziamo enormemente la dottoressa Annick Bleys per gli utili suggerimenti per migliorare il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal programma Interuniversity Attraction Poles Programme IUAP P7/29 'MARS' dell'Ufficio federale belga per le politiche scientifiche, dalla sovvenzione FWO G027313N e dall'Agenzia per l'innovazione attraverso la scienza e la tecnologia, IWT (IR).

1. Arabidopsis Lris protocollo Nota: Il testo fa riferimento a &quot;piccoli&quot; o &quot;grandi&quot; esperimenti scala. Esperimenti su scala ridotta, come l&#39;analisi linea marcatore e colorazione istologica 6, 14, richiedono solo un paio di esempi. Esperimenti su vasta scala, come quantitativa real-time qRT-PCR, microarray 9-11 o RNA sequencing, richiedono una maggiore quantità di campioni. In quanto tale, un importo pari a ~ 1000 piantine per campione è stato utilizzato da Vanneste et al. 11 per eseguire esperimenti di microarray dopo segmento radice dissezione. GIORNO 1 <ol><li> Sterilizzazione di Arabidopsis Seeds Nota: selezionare una delle seguenti procedure per la sterilizzazione del seme. Uno di essi è adatto per le prossime fasi del protocollo. Sterilizzazione a gas (1.1.2) presenta due vantaggi principali rispetto sterilizzazione liquida (1.1.1): ci vuole meno tempo quando si maneggia una grande intorpiditoer di semi, poiché nessuna pipettaggio deve verificarsi per i singoli campioni; ei semi sterilizzati possono essere conservati per un periodo più lungo. Tuttavia, esso richiede un essiccatore e accurato trattamento. <ol><li> Sterilizzazione liquido <ol><li> Versare il numero desiderato di semi in tubi di micro-centrifuga. Utilizzare fino a 20 mg (~ 800 semi) in una provetta da 1,5 ml o 40 mg (~ 1600 semi) in 2 ml provette micro-centrifuga. </li><li> Aggiungere 1 ml di etanolo al 70%. Invertire o scuotere delicatamente per 2 minuti. </li><li> Sostituire l&#39;etanolo al 70% con 1 ml di soluzione di sterilizzazione per 15 min. (Preparare la soluzione di sterilizzazione fresco: 3,85 ml di ipoclorito di sodio (NaOCl) stock (12%) (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo fumi cappa), 5 ml Tween 20, fino a 10 ml con acqua invertire i tubi diverse volte per assicurarsi che tutti i semi arrivano. in contatto con la soluzione. </li><li> In una cappa a flusso laminare, sostituire la soluzione di sterilizzazione con 1 ml di acqua distillata sterile e sciacquare i semi 5 volte per 5 min da ripetutily sostituzione con 1 ml di acqua distillata sterile fresca. </li></ol></li><li> Sterilizzazione Gas <ol><li> Versare il numero desiderato di semi in un tubo da centrifuga micro-2 ml. Utilizzare singoli tubi quando si lavora con più linee indipendenti, e disporli aperti in una scatola tubi micro-centrifuga di plastica o di supporto. Se il numero di semi in un tubo supera 500 (12,5 mg), suddividere i semi al numero appropriato di provette per assicurare sterilizzazione. Assicurarsi che i tappi di tubi adiacenti non coprono l&#39;un l&#39;altro. Montare insieme il coperchio della scatola sul fondo, in quanto deve essere nell&#39;essiccatore anche per la sterilizzazione. </li><li> Posizionare la scatola nella ciotola di un essiccatore, insieme a un bicchiere di vetro (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo dei fumi cappa). </li><li> Riempire il bicchiere con 100 ml di 12% NaOCl (ATTENZIONE: Utilizzare cappa). Mettere il coperchio sulla essiccatore, ma lasciare una piccola apertura in cui è collocato il bicchiere. </li><li> Aggiungere 3 ml di acido cloridrico 37% (fumigante) (CAUZIONE: Usa fume hood) al bicchiere attraverso la piccola apertura e chiudere rapidamente un essiccatore. La volontà bolla soluzione per qualche tempo a causa di Cl formazione 2 -gas. Lasciare il sistema chiuso O / N (o almeno 8 ore). </li><li> Togliere il coperchio del essiccatore. Estrarre la scatola e coprire con il coperchio per evitare la contaminazione durante il trasporto. </li><li> Mettere la scatola in un armadio flusso laminare, togliere il coperchio e lasciare i semi per circa 1 ora a temperatura ambiente per permettere la fuoriuscita di gas. Nota: I semi possono essere secca in tubi di micro-centrifuga chiusi conservati in modo sicuro fino a 2 settimane a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Laterale induzione Root in Arabidopsis <ol><li> Laterale Root inibizione (NPA Treatment) <ol><li> Preparare il terreno di coltura per la crescita in vitro. Il terreno contiene metà forza Murashige e Skoog miscela di sale 15, 0,1 g / L mio-inositolo, 10 g / L di saccarosio, ed è tamponata con 0,5g / L 2- (N-morfolino) Acido etansolfonico (MES). </li><li> Regolare il pH a 5,7 con 1 M KOH. Aggiungere 8 g / L di agar pianta tessuto e il mezzo autoclave per 20 minuti a 121 ° C. </li><li> Preparare una soluzione madre 25 mm di NPA in dimetilsolfossido (DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). In una cappa a flusso laminare, raffreddare il mezzo autoclavato fino a circa 65 ° C (che è la temperatura a cui la bottiglia può essere tenuto a mano), e aggiungere 25 soluzione madre NPA mM per ottenere una concentrazione finale di 10 pM NPA. </li><li> Omogeneizzare su oltre agitando delicatamente il flacone per 10 secondi. Versare 50 ml di terreno per ogni piatto quadrato di Petri (12 cm x 12 cm). Nota: In caso di esperimenti su larga scala, applicare una rete di nylon (20 micron) per assicurare un facile trasferimento. Preparare una maglia (9 cm x 9 cm) per la sterilizzazione in autoclave (Figura 1A). Quando autoclave, applicare la rete al mezzo di crescita con una pinzetta sterile (Figura 1B). Spingere delicatamente la maglia al mezzo di crescita con una sterilized drigalsky per assicurarsi che sia in buon contatto con il mezzo di crescita (Figura 1B) (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili). </li><li> Seminare i semi sui NPA piastre. Nota: Nel caso in cui è previsto un esperimento su larga scala, seminare 2 file densi e ben allineati di 50 semi di facilitare il prelievo (vedi 1.2.2.3). <ol><li> In caso di sterilizzazione liquido, seminare i semi su NPA-lastre con una pipetta 200 l. Tagliare 3 - 4 mm dalla fine delle punte di pipettaggio in condizioni sterili (o prima della sterilizzazione delle punte) per poter pipettare i semi. Pipettare su e giù un paio di volte a ri-sospendere i semi, poi pipettare acqua circa 150 microlitri sterile con 10 - 20 semi e aspettare che il sedimento semi sul fondo della punta. (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili) Nota: Toccando l&#39;agar o mesh delicatamente con la punta, una goccia d&#39;acqua con un seme sarà rilasciato da esso (Figura 1C). </li> &lt;li&gt; In caso di sterilizzazione a gas, seminare i semi con autoclave toothpicks.Pinch la stuzzicadenti nel agar prima di prendere i semi per garantire una superficie adesiva. Raccogliete la semi uno a uno con lo stuzzicadenti e distribuire i semi sulle piastre (Figura 1D). In alternativa, aggiungere acqua sterile per i semi, e di seminare come descritto in 1.2.1.5.1 (ATTENZIONE: Il lavoro in condizioni sterili). </li></ol></li><li> Sigillare le piastre con nastro adesivo traspirante e memorizzarli piastre a 4 ° C al buio per almeno 2 giorni e massimo una settimana. Questo è necessario per stratificazione e garantisce sincronizzati e germinazione più efficiente. Nota: In alternativa, i semi possono essere stratificati prima della semina, immerse in acqua distillata in tubi micro-centrifuga, che richiede meno spazio frigorifero. In questo caso, conservare le provette per almeno una settimana a 4 ° C, e spostare le piastre al mobile crescita subito dopo la semina (vedi 1.2.1.7). GIORNO 3 </li&gt; <li> Spostare le piastre al mobile crescita (luce continua (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) per 5 giorni (2 giorni di germinazione e 3 giorni di crescita) in posizione quasi verticale (80 a 90 °) per assicurare la crescita delle radici, e non nel mezzo. GIORNO 8 </li></ol></li><li> Laterale Root induzione (NAA Treatment) <ol><li> Preparare lo stesso terreno di coltura come descritto in 1.2.1.1 e 1.2.1.2. Preparare una soluzione 50 mM magazzino di NAA in DMSO (ATTENZIONE: Indossare guanti). Raffreddare il terreno autoclavato fino a 65 ° C e aggiungere la soluzione NAA al mezzo per ottenere una concentrazione finale di 10 mM NAA (NOTA: Il lavoro in condizioni sterili). <ol><li> Omogeneizzare su oltre agitando delicatamente il flacone per 10 secondi. Versare 50 ml di terreno per ogni piatto quadrato di Petri (12 cm x 12 cm). </li></ol></li><li> Trasferire le piantine dalle piastre contenenti terreno di coltura supplementato con 10 micron NPA a quelli supsere realizzata con 10 micron NAA. <ol><li> Agganciare le braccia di pinzette ricurve sotto i cotiledoni della piantina e rimuoverla delicatamente dalla piastra. Trasferire solo piantine le cui radici sono cresciuti completamente in contatto con il mezzo NPA-crescita e preferibilmente verso il basso. </li><li> Skim la radice nel medio di crescita della superficie-NAA che contiene oltre una piccola distanza. Assicurarsi che le radici delle piante sono in buon contatto con il mezzo di crescita. Se necessario, premere il radice delicatamente sulla superficie terreno di coltura con le pinzette. Nota: Nel caso di un grande esperimento, rimuovere tutti piantine che non sono in contatto con la rete e trasferimento sollevando la mesh ai due angoli superiori con pinzette. Assicurarsi che la maglia è in buon contatto con il mezzo-NAA contenente schiumando maglia sulla superficie agar su una piccola distanza (Figura 1E). </li></ol></li><li> Sigillare le nuove piastre con nastro adesivo traspirante e metterli nel quadro di crescita (conluce continuo (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) in posizione verticale per il tempo desiderato dopo induzione fino al campionamento. Nota: Nel caso di un grande esperimento, utilizzare un bisturi per tagliare i segmenti radice tutti in una volta direttamente sulla maglia e campionare raschiando delicatamente la superficie della mesh. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Lris mais protocollo <ol><li> Stratificazione di mais kernel <ol><li> Incubare i chicchi di mais a 4 ° C al buio per almeno 1 settimana. Nota: Questo protocollo è stato sviluppato utilizzando la linea inbred di mais B73. </li></ol></li><li> Sterilizzazione di mais kernel GIORNO 1 Nota: Anche se piante di mais non devono essere coltivate in condizioni di sterilità, si consiglia di sterilizzare i chicchi di mais e di lavorare con materiale sterile per prevenire la crescita di funghi nel rotolo di cartasistema. <ol><li> Mettere il numero necessario di chicchi di mais in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di sterilizzazione (6% NaOCl in acqua) (ATTENZIONE: l&#39;utilizzo cappa). </li><li> Aggiungi un ancoretta magnetica e posizionare il bicchiere su un agitatore magnetico a bassa velocità di agitazione (circa 250 giri al minuto) a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Risciacquare cinque volte per 5 min, sostituendo la soluzione con 100 ml di acqua fresca sterile. </li></ol></li><li> La semina mais kernel <ol><li> Indossare guanti per ridurre il rischio di contaminazione, e prendere un rotolo di carta assorbente. </li><li> Strappare due tratti di mano un tovagliolo di carta con una lunghezza totale di due fogli (circa 92 centimetri x 24 cm) e metterli uno sopra l&#39;altro su una superficie pulita (Figura 2A). </li><li> Piegare i fogli raddoppiare la lunghezza (circa 92 cm x 12 cm) (Figura 2A). </li><li> Utilizzare le pinzette per distribuire 10 kernel a circa 2 cm dalla parte superiore su tegli intera lunghezza della carta, mantenendo un&#39;intercapedine di 8 cm tra ogni kernel e 8 cm connessione alle due estremità (Figura 2B). Assicurarsi che la radichetta del kernel sia rivolta verso il basso e verso la carta (Figura 2B). </li><li> Rotolare delicatamente la carta su tutta la lunghezza, pur mantenendo i semi in sede (Figura 2B). Per facilitare il rotolamento, è facoltativo spruzzare prima la carta con acqua sterile. </li><li> Mettere i rotoli di carta in tubi di vetro sterilizzati di circa 6 cm di diametro e 14 cm di altezza (per esempio, 250 ml provette centrifuga) e metterli in un rack (Figura 2C). </li></ol></li><li> Laterale induzione Root in mais <ol><li> Preparare una soluzione al 50 NPA mM magazzino (disciolto in DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). </li><li> Per ogni tubo, fare una soluzione al 50 micron NPA aggiungendo 125 microlitri della soluzione madre 50 NPA mM a 125 ml di acqua sterile, in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Mescolare bene eversare 125 ml di soluzione 50 mM NPA sopra il rotolo di carta nel tubo. Il rotolo di carta in grado di assorbire la soluzione e diventare completamente assorbito. Nota: Quando si utilizzano rotoli di carta e tubi con altre dimensioni, regolare il volume di conseguenza. Il liquido dovrebbe raggiungere a metà strada del tubo per assicurare l&#39;assorbimento sufficiente. </li><li> Collocare il sistema rotolo di carta in un armadio di crescita per tre giorni (27 ° C, luce continua, il 70% di umidità relativa). Assicurarsi che i rotoli di carta rimangono impregnati con l&#39;aggiunta extra di 50 micron soluzione NPA, dal momento che la soluzione evapora nel tempo (Figura 2D). GIORNO 4 </li><li> Preparare una soluzione al 50 NAA mM magazzino (disciolto in DMSO) (ATTENZIONE: Indossare guanti). </li><li> Per ogni tubo, preparare una soluzione NAA 50 micron con l&#39;aggiunta di 125 microlitri dal magazzino 50 NAA mM a 125 ml di acqua sterile in un bicchiere di vetro sterilizzati. </li><li> Premere delicatamente la maggior parte della rimanente soluzione di NPA dai rotoli di carta e posizionare ilm di acqua sterile per 5 minuti per lavare fuori (ATTENZIONE: Indossare guanti). Spremere delicatamente la maggior parte dell&#39;acqua dai rotoli di carta. Ripetere questa operazione di lavaggio per tre volte. </li><li> Mescolare bene e versare la soluzione NAA 50 micron sui rotoli di carta nei tubi. Assicurarsi che siano completamente immersi. </li><li> Posizionare il sistema rotolo di carta nel gabinetto crescita (27 ° C, luce continua, 70% di umidità relativa) per la durata desiderata dopo induzione. </li></ol></li><li> Laterale induzione Root in accidentale Corona Roots of Maize Nota: Il Lris come descritto sopra induce radici laterali nella radice primaria. Tuttavia, nel mais e altre monocotiledoni, la radice primaria e le radici seminali embrionali, insieme con le loro radici laterali, sono principalmente importante durante lo sviluppo piantina. In una fase successiva della crescita delle piante, le radici avventizie postembrionali sorgono sullo stelo e anche sviluppare radici laterali per formare un nuovo sistema di radice 16. Il Lris può anche essere utilizzatod per indurre radici laterali su queste post-embrionali radici avventizie corona seguendo alcuni piccoli aggiustamenti alla Lris sulla radice primaria embrionale. <ol><li> Per rendere i rotoli di carta, creare un sandwich di carte con rispettivamente due strati di mano tovagliolo di carta sul lato esterno, e due strati di carta all&#39;interno di germinazione. Posizionare i kernel sterilizzati (vedere i passi 2,1-2,2) tra i due fogli di carta germinazione. Carta germinazione, rispetto alla carta asciugamani, sarà meno incline ad essere penetrato da peli radicali e radici laterali, che renderà l&#39;apertura del rotoli di carta più facile in seguito. D&#39;altra parte, i due strati esterni di asciugamano di carta saranno facilitare l&#39;assorbimento del liquido. </li><li> Inserire i rulli in 700 ml di tubi di vetro e versare acqua sterile senza NPA su di loro. Assicurarsi che siano completamente immersi. </li><li> Germinare i chicchi sterilizzati nell&#39;armadio di crescita (vedi punto 2.4.9). </li><li> Crescere le piante fino alle radici avventizie coronainiziare ad emergere (6 giorni per B73). Assicurarsi che i rotoli di carta sono tenute umido in ogni momento con l&#39;aggiunta di acqua sterile quando necessario. </li><li> Trasferimento a una soluzione 25 mM NPA per 4 giorni (vedi i punti 2.4.1 a 2.4.4), seguita da una simile induzione di apertura laterale radice sostituendo la soluzione con una soluzione NPA NAA 50 pM dopo una fase di lavaggio (vedi passo 2.4 0,5 a 2.4.9). </li></ol></li></ol>

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<li>Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+root+formation+in+rice+%28Oryza+Sativa.+L.%29%3A+differential+effects+of+indole-3-acetic+acid+and+indole-3-butyric+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Growth+Regul%22%5BJournal%5D)">Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid.</a> Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).</li>
<li>Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auxins+differentially+regulate+root+system+architecture+and+cell+cycle+protein+levels+in+maize+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings.</a> J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).</li>
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<li>Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+mechanisms+controlling+uptake+and+accumulation+of+2%2C4-dichlorophenoxy+acetic+acid%2C+naphthalene-1-acetic+acid%2C+and+indole-3-acetic+acid+in+suspension-cultured+tobacco+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells.</a> Planta. 198, 532-541 (1996).</li>
<li>Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgenomics%3A+genome-scale%2C+cell-specific+monitoring+of+multiple+gene+regulation+tiers%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers.</a> Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Nel protocollo Arabidopsis Lris, è importante trasferire solo le piantine che sono cresciuti completamente in contatto con il terreno di coltura contenente NPA. Questo assicura che laterale iniziazione radice è bloccato su tutta la lunghezza della radice. Al fine di prevenire il ferimento di piantine durante il trasferimento, le braccia delle pinze curve possono essere agganciati sotto i cotiledoni della piantina. Al trasferimento, assicurarsi che le radici di piantine sono in contatto sufficiente con il terren...

Il sistema radicale è cruciale per la crescita delle piante, in quanto garantisce l&#39;ancoraggio e l&#39;assorbimento di acqua e nutrienti dal terreno. Poiché l&#39;espansione di un sistema radicale si basa principalmente sulla produzione di radici laterali, la loro iniziazione e formazione sono stati ampiamente studiati. Radici laterali sono iniziati in uno specifico sottogruppo di cellule pericycle, chiamate cellule fondatore 1. Nella maggior parte delle dicotiledoni, come Arabidopsis thaliana, queste cellule si trovano ai poli protoxylem 2, mentre in monocotiledoni, come il mais, si trovano ai poli floema 3. Fondatore cellule sono caratterizzati da un aumento della risposta auxina 4, seguita dalla espressione di specifici geni del ciclo cellulare (ad esempio, CYCLIN B1; 1 / CYCB1; 1), dopo di che subiscono un primo giro di asimmetrici divisioni anticlinali 5. Dopo una serie di divisioni anticlinali e periclinal coordinati, un primordio radice laterale è formata che finalmente emergerà come unradici laterali utonomous. La posizione e la tempistica di apertura laterale root non sono comunque prevedibile, poiché questi eventi sono né abbondanti né sincronizzato. Questo impedisce l&#39;utilizzo di approcci molecolari, come trascrittomica per studiare questo processo. Per affrontare questo, una laterale Root inducibile System (Lris) è stato sviluppato 6, 7. In questo sistema, piantine vengono prima trattati con acido N -1-naphthylphthalamic (NPA), che inibisce il trasporto e l&#39;accumulo di auxina, bloccando di conseguenza laterali iniziazione radice 8. Con successiva cessione delle piantina di terreno contenente l&#39;auxina sintetico acido acetico 1-naftalene (NAA), l&#39;intero strato pericycle risponde ai livelli di auxina elevati così massicciamente che inducono alla radice l&#39;avvio divisioni cellulari laterali 6. Come tale, questo sistema porta a veloci, sincroni ed estese radici laterali iniziazioni, che consente un facile prelievo di campioni di radice arricchito da una determinata fase di ritardolo sviluppo delle radici ral. Successivamente, questi campioni possono essere utilizzati per determinare profili di espressione a livello di genoma durante la formazione delle radici laterali. Il Lris ha prodotto conoscenze già significativo circa iniziazione laterale radici in Arabidopsis e mais 9-13, ma la necessità di applicare questo sistema per altre specie di piante diventa più evidente quanto più genomi sono in sequenza e non vi è un interesse crescente per trasferire la conoscenza a economico importante specie. Qui, sono indicati i protocolli dettagliati della Arabidopsis e mais LRISs. Successivamente, un esempio di utilizzo del sistema è fornito, illustrando come trascrittomica dati ricavati dal mais Lris possono essere utilizzati per identificare omologhi funzionali che hanno una funzione conservata durante l&#39;inizio radice laterale attraverso diverse specie vegetali. Infine, le linee guida per ottimizzare il Lris sono proposti per altre specie vegetali.

<table><tbody><tr><td>ARABIDOPSIS LRIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seeds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis seeds</td><td></td><td></td><td>Col-0 ecotype</td></tr><tr><td>Gas sterilizzazione dei semi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-centrifuga provette 1,5 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 125.215</td><td>Eppendorf microprovette 3810X, PCR clean</td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga 2 ml</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>0030 120.094</td><td>Provette per microcentrifuga Eppendorf Safe-Lock</td></tr><tr><td>acido cloridrico</td><td>Merck KGaA</td><td>1.003.171.000</td><td>37% (fumante) per analisi EMSURE ACS,ISO,Reag. Essiccatore</td></tr><tr><td>in vetro</td> Ph Eu <td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>Contenitore</td></tr> in <tr><td>vetro</td><td></td><td></td><td></td></tr> Pyrex per <tr><td>provette per microcentrifuga in plastica scatola o supporto</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach sterilizzazione di semi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Chem-Lab nv</td><td>CL00.0505.1000</td><td>Etanolo, abs. 100% a.r. diluito al 70%</td></tr><tr><td>ipoclorito di sodio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>acqua</td><td></td><td></td><td></td> sterile</tr><tr><td><forte>Terreno di crescita</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miscela di sali di Murashige e Skoog</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M0221-0050</td><td></td></tr><tr><td>mio-inositolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (MES)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>saccarosio</td><td>VWR, Internation LLC</td><td>27483.294</td><td>D(+)-saccarosio Ph. Eur.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck KGaA</td><td>1050211000</td><td>pellet per analisi (max. 0,002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Coltura di tessuti vegetali Agar</td><td>LabM Limited</td><td>MC029</td><td></td></tr><tr><td><forte>Induzione laterale della radice chimica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido N-1-naftilftalamico (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie BV</td><td>n. N0926.0250</td><td>10 &micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>Acido acetico 1-naftalene (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>n. N0903.0050</td><td>10 &micro; M (Arabidopsis)</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Realizzazione di una rete per rete di nylon transfer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Prosep byba</td><td></td><td>Rete di nylon sintetico 20 &; m</td></tr><tr><td>Semina e manipolazione delle piantine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastre per piastre di Petri quadrate</td><td>GOSSELIN</td><td>BP124-05</td><td>12 x 12 cm</td></tr><tr><td>50 ml tubi DURAN</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>CLS430304</td><td>Corning&nbsp; Provette da centrifuga da 50 ml</td></tr><tr><td>drigalski</td><td>Carl Roth</td><td>K732.1</td><td></td></tr><tr><td>pipetta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tagliata puntali per pipette</td><td>Daslab</td><td>162001X</td><td>Universal 200, tagliare 5 mm di punta prima dell'autoclavaggio</td></tr><tr><td>nastro traspirante&nbsp;</td><td>3M Deutschland GmbH</td><td>n. di cat. 1530-1</td><td></td></tr><tr><td>pinzetta</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinzetta Dumont tipo a nr 5; Pinzetta Dumont tipo e nr 7</td></tr><tr><td><forte>Condizioni di crescita</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crescita camera</td><td></td><td></td><td>21 &deg; C, luce continua</td></tr><tr><td><forte>Materiali</forte></td><td><forte>Azienda</forte></td><td><forte>Catalogo</forte></td><td><forte>Commenti</forte></td></tr><tr><td><forte>MAIS LRIS</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Semi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chicchi di</td><td></td><td></td> mais <td>B-73</td></tr><tr><td>Bleach sterilizzazione dei chicchi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>agitatore magnetico per becher</td><td></td><td></td><td></td>di vetro</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fiers nv/sa</td><td>C267.1</td><td></td></tr><tr><td>ipoclorito di sodio (NaOCl)</td><td>Carl Roth</td><td>9062.3</td><td>12%</td></tr> <tr><td>sterile acqua</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Induzione laterale della radice chimica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-1-acido naftilftalamico (NPA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>n. N0926.0250</td><td>50 &micro; M (radice primaria di mais), 25 &micro; M (radice avventizia di mais)acido</td></tr> <tr><td>acetico 1-naftalene (NAA)</td><td>DUCHEFA Biochemie B.V.</td><td>N0903.0050</td><td>50 &micro; M (mais)</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>494429-1L</td><td></td></tr><tr><td>Semina e manipolazione delle piantine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>asciugamani di carta</td><td>Kimberly-Clark Professional*</td><td>6681</td><td>SCOTT Asciugamani - Rotolo / Bianco; dimensioni del foglio (24 x 46 cm)</td></tr><tr><td>carta per germinazione dei semi</td><td>Anchor Paper Company</td><td></td><td>10 X 15 38# carta per la germinazione dei semi</td></tr><tr><td>pinzetta</td><td>Fiers nv/sa</td><td>K342.1; K344.1</td><td>Pinzetta Dumont tipo a nr 5; Pinzette Dumont tipo e nr 7</td></tr><tr><td>provette da 250 ml (centrifuga)</td><td>SCHOTT DURAN</td><td>2160136</td><td>circa 5,6 cm di diametro e 14,7 cm di altezza.</td></tr><tr><td>Provette da 700 ml</td><td>DURAN GROUP</td><td>213994609</td><td>cilindri, tubo a piede tondo, D 60&nbsp; x 250</td></tr><tr><td>rack</td><td></td><td></td><td>per tubi di mais,</td></tr><tr><td>acqua</td><td></td><td></td><td></td> sterile</tr> fatta in casa<tr><td><forte>Condizioni di crescita</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>armadio</td><td></td><td></td> di crescita <td>27 gradi C, luce continua, 70% di umidità relativa</td></tr></tbody></table>

laterale root inducibile di sistema in<em&gt; arabidopsis</em&gt; e mais

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lo sviluppo laterale delle radici contribuisce in modo significativo all'apparato radicale, e quindi è fondamentale per la crescita delle piante. Lo studio dell'iniziazione laterale della radice è tuttavia noioso, perché avviene solo in poche cellule all'interno della radice e in modo imprevedibile. Per aggirare questo problema, è stato sviluppato un sistema inducibile alla radice laterale (LRIS). Trattando le piantine consecutivamente con un inibitore del trasporto dell'auxina e un'auxina sintetica, l'inizio della radice laterale altamente controllato avviene in modo sincrono nella radice primaria, consentendo un abbondante campionamento di uno stadio di sviluppo desiderato. Il LRIS è stato sviluppato per la prima volta per l'Arabidopsis thaliana, ma può essere applicato anche ad altre piante. Di conseguenza, è stato adattato per l'uso nel mais (Zea mays). Viene fornita una panoramica dettagliata delle diverse fasi del LRIS in entrambi gli impianti. La combinazione di questo sistema con la trascrittomica comparativa ha permesso di identificare omologhi funzionali dei geni di inizio della radice laterale di Arabidopsis in altre specie, come illustrato qui per la ciclina B1; 1 (CYCB1; 1) gene del ciclo cellulare nel mais. Infine, vengono discussi i principi che devono essere presi in considerazione quando si sviluppa un LRIS per altre specie vegetali.

Applicazione del Lris per eseguire Trascrittomica comparativi del processo laterale Root Iniziazione Un&#39;applicazione della Lris è il confronto e correlazione dei profili di espressione genica durante la formazione delle radici laterali in specie diverse. Trascrittomica comparata approcci creare la possibilità di individuare i geni ortologhi coinvolti nel processo di sviluppo delle radici laterali in divers...

Il Lateral Root Inducible System (LRIS) consente l'induzione sincrona delle radici laterali ed è presentato per Arabidopsis thaliana e mais.

Laterale Root inducibile di sistema in<em&gt; Arabidopsis</em&gt; E mais

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

L'obiettivo generale del sistema inducibile di radici laterali è quello di indurre in modo sincrono l'inizio delle radici laterali nelle piante mediante trattamenti ormonali. Le radici delle piante sono nascoste e sono note per essere estremamente difficili da studiare. Abbiamo sviluppato un sistema in vitro che consente di studiare il processo di iniziazione delle radici laterali a livello citologico, istologico e molecolare.Generalmente, i ricercatori alle prime armi con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà poiché le piante non hanno sviluppato un adeguato contatto con il mezzo, impedendo un'induzione omogenea delle radici laterali. Una dimostrazione visiva di questo metodo aiuta a mostrare i passaggi critici da considerare per garantire un'induzione uniforme. Sebbene questo sistema sia stato inizialmente sviluppato su una piccola pianta come Arabidopsis, può essere applicato anche ad altri sistemi, come mais, riso o orzo.Per iniziare, applicare una maglia di nylon da 20 micron su un mezzo di crescita supplementato con NPA utilizzando un paio di pinzette sterili. Spingere delicatamente la maglia sul mezzo di crescita usando un drigalski per assicurarsi che sia a contatto ottimale con il mezzo. Successivamente, premere un bastoncino sterile nell'agar per creare una superficie appiccicosa sul bastoncino.Utilizzare lo stuzzicadenti per distribuire uniformemente un lotto di semi sterilizzati con gas sulle piastre preparate. Sigillare le piastre con nastro adesivo traspirante e conservarle a quattro gradi Celsius al buio per almeno due giorni e al massimo una settimana. Questo passaggio è necessario per la stratificazione e garantisce una germinazione sincronizzata ed efficiente.Al terzo giorno, trasferire le piastre nella stanza di crescita per due giorni di germinazione, seguiti da tre giorni di crescita a un angolo compreso tra 80 e 90 gradi. All'ottavo giorno, identificare le radici che sono cresciute completamente a contatto con la rete e, al contrario, quelle che non sono a contatto con la rete stessa. Rimuovere tutte le piantine le cui radici non sono a contatto con la rete.Trasferire le reti contenenti le piantine in piastre aggiunte con 10 micromolari di NAA. Una volta sulla piastra, passare delicatamente la rete sulla superficie del mezzo, se necessario, per assicurare un buon contatto con il mezzo di crescita. Per garantire un'induzione omogenea in tutte le piantine, è importante scartare le piantine che non sono cresciute a contatto con la rete su mezzo aggiunto con NPA e passare correttamente la rete, se necessario, su mezzo aggiunto con NAA.Sigillare le piastre nuove con del nastro traspirante e posizionarle in camera di crescita in posizione verticale per il tempo desiderato dopo l'induzione. Quando si è pronti per raccogliere i campioni, utilizzare un bisturi per tagliare i segmenti radicali tutti insieme direttamente sulla maglia e prelevarli raschiando delicatamente la superficie della maglia. Mostreremo ora alcuni passaggi del sistema inducibile di radici laterali nel mais.Iniziare sterilizzando i chicchi di mais posizionando il numero necessario di chicchi in un becher di vetro sterile. Successivamente, aggiungere 100 millilitri di ipoclorito di sodio al 6% in acqua al becher e inserire una barretta magnetica. Posizionare il becher su un agitatore magnetico e agitare a bassa velocità per cinque minuti a temperatura ambiente.Rimuovere delicatamente la soluzione di candeggina. Sostituirla con 100 millilitri di acqua sterile fresca e sciacquare i semi per cinque minuti. Ripetere questo passaggio cinque volte.Indossare un paio di guanti e strappare due strisce di carta assorbente per le mani, ponendole una sopra l'altra su una superficie pulita. Poi, piegare i fogli in due lungo la lunghezza. Utilizzare pinzette per distribuire 10 semi a circa due centimetri dall'estremità superiore, lungo tutta la lunghezza della carta, mantenendo una distanza intermedia di otto centimetri tra ciascun seme e otto centimetri liberi a entrambe le estremità.Assicurarsi che il radicale del seme sia rivolto verso il basso e in direzione della carta. Arrotolare delicatamente la carta lungo tutta la sua lunghezza, mantenendo i semi in posizione. Se necessario, spruzzare la carta con acqua sterile può facilitare questo passaggio.Inserire i rotoli in provette di vetro sterilizzate e posizionare le provette aggiuntive nel portaprovette. Versare 125 millilitri di una soluzione di NPA 50 micromolare sul rotolo di carta nella provetta. Il rotolo di carta assorbirà la soluzione e si bagnerà completamente.Posizionare il sistema a rotolo di carta in un armadio di crescita per tre giorni. Assicurarsi che i rotoli di carta rimangano inzuppati durante l'incubazione aggiungendo ulteriore soluzione di NPA secondo necessità. Per garantire un'induzione omogenea dell'avvio delle radici laterali, è importante verificare che i rotoli di carta rimangano umidi nella soluzione di NPA, ma che le radici non siano sommerse nel liquido stesso.Dopo tre giorni su NPA, la piantina di mais presenta un piccolo germoglio e una radice lunga circa due-tre centimetri. Al quarto giorno, espellere delicatamente la maggior parte della soluzione di NPA residua dai rotoli di carta e immergerli in acqua sterile fino a quando non saranno saturi. Dopo circa cinque minuti, espellere delicatamente la maggior parte dell'acqua dai rotoli di carta.Ripetere il passaggio di lavaggio tre volte. Dopo l'ultimo risciacquo, eliminare la maggior parte dell'acqua comprimendo delicatamente e riposizionare il materiale nel tubo. Versare una soluzione di NAA 50 micromolare sui rotoli di carta nei tubi fino a quando non risultano completamente inzuppati.Successivamente, posizionare il sistema con rotolo di carta nell'armadio di crescita per il periodo desiderato dopo l'induzione. In confronto ai semenziali della linea marcatrice della risposta all'auxina pDR5-GUS che non sono cresciuti in presenza di NAA o che hanno cresciuto per un'ora in presenza di NAA, i semenziali cresciuti per due ore in presenza di NAA mostrano una risposta all'auxina, che rappresenta uno dei primi eventi che innescano l'iniziazione delle radici laterali. Queste divisioni cellulari iniziano a spostarsi verso l'alto a partire dall'apice circa dopo due ore e aumentano con un'esposizione prolungata a NAA.Utilizzando la linea marcata con il marcatore del ciclo cellulare pCYCB1;1-Gus, le prime divisioni cellulari che portano alla formazione delle radici laterali possono essere osservate a partire da circa sei ore dopo l'inizio del trattamento con NAA. Microarray e rt-PCR quantitativa possono essere utilizzati per valutare l'espressione di vari geni in diverse regioni delle radici di Arabidopsis e mais durante l'induzione delle radici laterali. In entrambe le specie, Arabidopsis e mais, quando le piante crescono per un periodo più lungo, le divisioni indotte daranno origine allo sviluppo e all'allungamento delle radici laterali.Come prova di concetto per il sistema nel mais, ecco delle piantine cresciute in diverse condizioni a scopo comparativo. Le piantine cresciute per 10 giorni in acqua presentano radici laterali che non si sono iniziate in modo sincrono e sono ampiamente distanziate lungo l'asse. Le piantine cresciute per 10 giorni in presenza di NPA non presentano affatto radici laterali.Piante giovani cresciute per tre giorni su NPA, seguite da un trattamento con NAA, mostrano un'induzione massiccia e sincronizzata di radici laterali. In questo video vi abbiamo mostrato come allestire un sistema inducibile per radici laterali che si è rivelato fondamentale nella scoperta di nuove conoscenze di base sul processo di ramificazione radicale. Vi abbiamo mostrato come funziona per Arabidopsis e mais, ma può essere facilmente adattato ad altre specie vegetali a scelta.In bocca al lupo.

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