Name: Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-05T15:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Scopri la procedura di gradiente per isolare esosomi dal plasma di pazienti HIV-1 positivi. Questo metodo consente di analizzare citochine e chemochine per studiare la patogenesi dell'infezione.

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Ringraziamo le seguenti persone: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers e Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu è stata sostenuta dall'UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, dall'American Medical Association Foundation, dal CRECD Grant 8R25MD007589-10 e dal NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIMHD 8G12MD007602 e 8U54MD007588, dalla sovvenzione NIAID 1R21AI095150-01A1, dalla sovvenzione GRA della Georgia Research Alliance. VAC08. W, e Emory CFAR concedono P30 A1050409.

Uno schema generale della procedura di isolamento exosome e la purificazione è fornito nella figura 1. Sangue intero è stato ottenuto da donatori volontari sani e da persone sieropositive che non ricevono theraoy antiretrovirale che frequentano la speranza Clinica della Emory University e il Programma di Malattie Infettive di Grady Health System ad Atlanta, Georgia. Questo studio è stato approvato dai comitati etici di Emory University e Morehouse School of Medicine. Tutte le persone che hanno partecipato allo studio hanno firmato un consenso informato e. 1. Preparazione di Esosomi dal plasma del sangue <ol><li> Raccolta di sangue umano e alla trasformazione <ol><li> Raccogliere 10 ml di sangue periferico mediante prelievo venoso in provette di raccolta del sangue EDTA (contenenti 18 mg di potassio EDTA), e capovolgere delicatamente per cinque volte per mescolare. </li><li> Centrifugare le provette per il prelievo di sangue a 1000 xg per 20 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Utilizzare una pipetta sterile,te per trasferire la frazione di plasma (4-5 ml) in una provetta conica da 25 ml. Diluire il plasma con 10 ml di 1 x PBS. Eliminare cellule del sangue (globuli rossi e globuli bianchi, noto anche come PBMC) in un contenitore opportunamente marcata per i rifiuti a rischio biologico. NOTA: Nel caso di non infetti campioni di sangue del donatore, il PBMC può essere riservato per un ulteriore uso (vedi procedura IV.2, di seguito). </li><li> Conservare i campioni di plasma a 4 ° C per breve termine (2-3 giorni) o a -80 ° C per la conservazione a lungo termine. NOTA: Portare tutti i campioni di plasma congelati a 4 ° C prima di ulteriori trasformazioni. </li></ol></li><li> Preparazione di Exosome frazione di plasma <ol><li> Plasma Centrifugare a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C per rimuovere i detriti cellulari. Utilizzare una pipetta sierologica sterile per trasferire il surnatante del plasma cancellata per un 25 ml tubo ultracentrifuga pulito. Eliminare il pellet nel contenitore rischio biologico. </li><li> Centrifugare il plasma eliminato a 100.000 xg per 2hr a 4 ° C per rimuovere grandi vescicole. Rimuovere il surnatante 100.000 xg accuratamente pipettando, e gettare nei rifiuti a rischio biologico. Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1X PBS in una provetta pulita ed incubare a temperatura ambiente per 30 min, agitando delicatamente per rimuovere particelle e separati. </li><li> Lavare lo squalificato 100.000 xg pellet exosome / virus con l&#39;aggiunta di 25 ml di PBS. Capovolgere delicatamente la provetta per cinque volte per miscelare, quindi centrifugare di nuovo a 100.000 xg per 2 ore a 4 ° C. Eliminare la soluzione di lavaggio PBS nel contenitore per rifiuti biologici. </li><li> Risospendere il pellet 100.000 xg in 1 ml di 1 x PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti agitando delicatamente per rimuovere e sciogliere il precipitato. NOTA: Se non è possibile procedere direttamente al gradiente passo iodixanolo, memorizzare il pellet, contenente exosomes e particelle virali, a 4 ° C per 1-2 giorni, fino alla fase iodixanolo gradiente. </li></ol></li></ol> 2. Purificazione di Esosomi <ol><li> Generare 6% -18% velocgradienti lità di iodixanolo utilizzando una doppia camera di pendenza ex apparato. <ol><li> Preparare le soluzioni 6% e il 18% del reagente iodixanolo, forniti come una soluzione al 60% in acqua, per diluizione in PBS. Pipettare 5,5 ml della soluzione di 18% nella camera agitata e pipettare 5,5 ml della soluzione al 6% nella camera serbatoio. Accendere l&#39;agitatore, aprire il rubinetto, e consentire ogni sfumatura di fluire in una provetta da 14 ml ultracentrifuga. NOTA: o utilizzare immediatamente o conservare pendenze preparate O / N a 4 ° C prima dell&#39;uso. </li><li> Strato con cautela 1 ml di soluzione exosome / virus sulla parte superiore di ogni 11 ml di gradiente. Gradienti centrifugare a 250.000 xg per 2 ore a 4 ° C, utilizzando un secchio SW40Ti rotore oscillante. </li><li> Etichettare dodici (12) 1,5 ml microprovette. Rimuovere 1,0 ml dalla sommità del gradiente e trasferimento a tubo # 1. Trasferire i restanti frazioni 1ml a tubi 2-12 in ordine sequenziale. NOTA: la frazione più in alto sarà dunque # 1, la frazione di fondo, # 12. StORE frazioni gradiente a 4 ° C. Gli esosomi purificati, che dovrebbero essere nelle frazioni 1-3 nella parte superiore del gradiente, sono stabili per 3-4 settimane se conservato a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione Exosome <ol><li> (AChE) Attività Assay <ol><li> Preparare 100 mM substrato magazzino mescolando acetiltiocolina ioduro 28,9 mg in 1 ml di PBS 1X. Conservare substrato magazzino a -20 ° C fino a 1 mese. </li><li> Preparare indicatore di colore 10 mM magazzino mescolando benzoico 39.6mg acido e bicarbonato di sodio 15 mg in 10 ml di PBS 1X. Indicatore di colore Conservare azione a 4 ° C fino a due settimane. </li><li> Preparare reagente assay miscelando 1X PBS, substrato, e indicatore di colore in un rapporto di 100: 2: 5 (ad esempio, 10 ml 1X PBS + 200 + indicatore di colore 500 microlitri substrato microlitri). </li><li> Trasferimento da 50 ml ciascuno 1,5 ml gradiente tubo frazione (etichettata 1-12, da procedura III.3) ai pozzetti di una microtite 96 pozzettipiatto r. Preparare i pozzetti in duplicato per ciascun campione di sfumatura. </li><li> Preparare una serie di standard facendo prima un μU / ml AChE Stock 2000 in PBS. Fai undici (11) 2-diluizioni seriali di questo stock e aggiungere 50 ml di ogni diluizione di un singolo pozzo di una micropiastra, in modo che di serie # 1 = 2.000 μU / ml, # 2 = 1.000 μU / ml, # 3 = 500 μU / ml, ecc fino # 12 = 0.98 μU / ml. Le norme dodici AchE saranno quindi occupare una singola riga di una piastra di dosaggio 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 200 pl di miscela reagente dosaggio in ciascun pozzetto ed incubare 20 min (al buio) a temperatura ambiente per consentire lo sviluppo del prodotto di reazione di colore. Misurare attività AChE alla lunghezza d&#39;onda di 450 nm usando un lettore di micropiastre a fluorescenza. NOTA: La percentuale di materiale di partenza che rimane dopo la purificazione exosome è valutata dal AchE dosaggio del plasma non frazionata. </li></ol></li><li> Analisi Immunoblot <ol><li> Proteine ​​separate in frazioni gradiente 1-12 (da procedUre 2.1.3) mediante SDS-PAGE su 4-20% Tris-HCl gel prefabbricati a 100V x 1 ora. Trasferire proteine ​​nel gel ad una membrana di nitrocellulosa utilizzando una cella di trasferimento elettro-blotting secondo le istruzioni del produttore. Lasciare i trasferimenti di cancellare per 12-16 ore (O / N) a 350V. </li><li> Rimuovere la membrana dall&#39;apparecchio blotting e lavare in Tris-Buffered Saline (TBS) per 5 min. Bloccare con il 5% senza grassi del latte a TTBS (TBS con 0,1% di Tween 20) per 1 ora a temperatura ambiente agitando. </li><li> Incubare la membrana con anticorpi primari specifici per esosomi (CD9, CD45, CD63) o HIV-1 proteina del capside (p24) a 5% senza grassi del latte in agitazione a 4 ° C per 12-16 ore (O / N). Le diluizioni di anticorpi primari per immunoblots vanno da 1: 2.000 -1: 5.000. </li><li> Lavare la macchia in TTBS per 20 minuti, seguita da incubazione con una diluizione 1: 2000 di perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-IgG (anticorpo secondario), in 5% di latte scremato per 1 ora a RT. Lavare la macchia 3 volte con TTBS, 10 minuti a lavaggio. </li><li&gt; incubare la macchia con il reagente substrato luminol secondo le istruzioni del produttore, per generare un segnale chemiluminescente dalle proteine ​​HRP-etichettati rilevare il segnale chemiluminescente utilizzando un sistema di imaging elettronico con telecamera CCD. </li><li> Salvare le immagini come file TIFF che possono essere visualizzati in Adobe Photoshop. Eseguire l&#39;analisi densitometrica delle bande utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li><li> Cytokine Assay <ol><li> Prima del test di citochine, interrompono complessi immuni che di solito sono presenti nel plasma umano mediante dissociazione acida e la lisi dei esosomi di trattamento detergente. Dosaggio entrambi i campioni di plasma di partenza e preparati exosome purificati. <ol><li> Per 100 ml di plasma umano aggiungere 100 microlitri 0,33 N HCL e incubare a 37 ° C per 1 ora. Aggiungere 100 ml 0,33 N NaOH per neutralizzare plasma acidato. Aggiungere esempi di Triton X-100 sia al plasma neutralizzato e exosome purificato, per un fila concentrazione finale di 1%, a causa lisi di esosomi. </li></ol></li><li> Per questo test (una procedura basata tallone-fluorescente), usano sfere magnetiche pre-rivestite con anticorpi da parte del produttore. Utilizzare un pannello custom-designed di perline anticorpi rivestite citochine anti-umani; elencati nella Tabella 1. Agitare le biglie magnetiche rivestite di anticorpo dal kit assay citochina per 30 secondi e aggiungere 50 microlitri perline a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti da utilizzare nel dosaggio. </li><li> Preparare una serie di diluizioni di norme in tampone standard plasma (sia contenuta nel kit di analisi di citochine) come descritto nel manuale di istruzioni del kit di analisi delle citochine, per generare una curva standard a 8 punti. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X (da kit) ad ogni pozzetto e lavare le perline con una rondella tallone magnetico, come descritto nel manuale. Aggiungere 25 microlitri tampone plasma (da kit) in ogni pozzetto. Aggiungere 25 ml di standard e dei campioni a tutti i pozzetti utilizzati nel test. Aggiungere 25 ml di plasmatampone campione di pozzetti di controllo negativo. Sigillare e agitare la piastra a 700 rpm per 60 minuti a temperatura ambiente e incubare O / N a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 150 ml di tampone di lavaggio 1X in ciascun pozzetto e lavare la piastra (come al punto 3.3.4, di cui sopra). Aggiungere 25 ml di anticorpi di rilevamento in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di streptavidina (SAPE, dal kit) in ogni pozzetto, guarnizione e agitare piastra a 700 rpm per 30 minuti a RT. Lavaggi piastra Ripetere come in 3.3.4. </li><li> Aggiungere 120 ml di tampone di lettura (da kit) in ogni pozzetto e agitare su un tavolo di laboratorio agitatore a 700 rpm per 5 min a temperatura ambiente per permettere al segnale fluorescente di sviluppare. Leggere piastra sul lettore di piastre secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Al fine di tenere conto della quantità di esosomi perse durante la procedura di isolamento, utilizzare la seguente equazione: [(lettura volume originale / plasma) x 66,6 = lettura citochine regolata]. </li></ol></li></ol> 4. Assay per potenziale immunomodulante <ol><li> Preparazione del terreno di coltura con Exosome impoverito siero fetale bovino <ol><li> Centrifuga 500 ml di siero fetale bovino (FBS) a 100.000 xg per 20 ore a 4 ° C a pellet contaminare esosomi e microvescicole. Rimuovere con cautela e salvare il exosome impoverito FBS surnatante. Eliminare il pellet in rifiuti a rischio biologico. </li><li> Combina il 20% del exosome impoverito FBS surnatante con 500 ml di Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) di media. Filtrare il mezzo attraverso un filtro a membrana da 0,45 micron. </li><li> Aggiungere streptomicina (100 U / ml), penicillina (100 U / ml), L-glutammina (2 mM), soluzione salina HEPES-buffered (10 mM), e IL-2 (20 U / ml) al mezzo filtrato. </li></ol></li><li> Colture Cellulari e Exosome Esposizione <ol><li> Esporre esosomi a donatori periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) ottenute da volontari sani clinica. Sospendere PBMC inpreparato terreno di coltura e contare le cellule utilizzando un contatore di cellule / particelle (secondo il metodo convenzionale del produttore). NOTA: Il PBMC sono ottenuti durante la preparazione plasma sopra descritto (punto 1.2). </li><li> Usando il mezzo preparato dal procedimento 4.1.3, co-coltura 3.0 x 10 6 (PBMC) con 1 mg / ml di exosomes raccolti da tre (3) HIV-1 sieropositivi o da tre (3) HIV-1 sieronegativi individui in un totale volume di 1 ml in pozzetti di una piastra di coltura 12 pozzetti (con coperchio). Incubare culture per 48 ore a 37 ° C. </li><li> Preparare colture non trattate PBMC e colture trattate con Concanavalina A (Con A, 5 mg / ml) per servire come controlli negativi e positivi, rispettivamente, come descritto sopra (4.2.2). Incubare tutte le culture PBMC per 48 ore a 37 ° C. </li><li> Immediatamente prima raccolta delle cellule, preparare diluizioni dei seguenti anticorpi monoclonali coniugati a fluorocromi: Alexa Fluor 700-marcato anti-CD3 (1: 400 diluizione), allophycocyanin (APC) / cianinico 7 (Cy7) -labeled anti-CD4 (1: 400), peridinina proteina clorofilla complesso marcato anti-CD4 (1: 400), V450 marcato anti-CD8 (1: 400), biotin- etichettato anti-CD45RA (1: 1.000), ficoeritrina (PE) / Cy7-marcato anti-CD62L (1: 1.000), PE / cianina 5 (Cy5) -labeled anti-CD38 (1: 200), PE-Texas Red- marcato anti-streptavidina (1: 2.000) e PE / Cy5 marcato controllo isotipico topo IgG1K (1: 200). </li><li> Dopo il periodo di incubazione 48 ore, raccogliere il PBMC. Lavare PBMC in PBS per rimuovere esosomi e macchia le cellule mediante incubazione per 1 ora a 4 ° C con anticorpi individuali fluorocromi-tag. Analizzare il PBMC macchiata di citometria a flusso per quantificare l&#39;espressione di chemochine (come descritto 21). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , Geneva Switzerland. (2013).</li>
<li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome%3A+staging+and+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immun%22%5BJournal%5D)">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li>
<li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+CD38%2B+CD8%2B+T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4%2B+T+cell+levels%3A+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center%2C+Multicenter+AIDS+Cohort+Study%5BTitle%5D)+AND+%22+J+Acq+Immun+Def+Synd%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li>
<li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+numbers+of+primed+activated+CD8%2BCD38%2BCD45RO%2B+T+cells+predict+the+decline+of+CD4%2B+T+cells+in+HIV-1-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li>
<li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8%2B+T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4%2B+cell+count%2C+soluble+immune+activation+markers%2C+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Acq+Immun+Def+Synd%22%5BJournal%5D)">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li>
<li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li>
<li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li>
<li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8%2B+T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li>
<li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li>
<li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+%28SIV%29+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li>
<li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li>
<li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li>
<li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li>
<li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li>
<li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions%5BTitle%5D)+AND+%22Ethn.+Dis%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li>
<li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host.+Microbe%22%5BJournal%5D)">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li>
<li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li>
<li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45%2B+Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res+Hum+Retrovir%22%5BJournal%5D)">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li>
<li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4%2B+T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li>
<li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li>
<li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360(2013).</li>
<li>Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037(2012).</li>
<li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294(2013).</li>
<li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158(2015).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Attivazione cronica del sistema immunitario (CIA) e l&#39;esaurimento delle cellule T CD4 + sono due importanti caratteristiche di HIV-1. Essi sono stati istituiti come predittori di patogenesi, con CIA essere il miglior predittore. Tuttavia, i meccanismi alla base di guida attivazione immunitaria cronica sistemica e il declino delle cellule CD4 + T ancora non sono stati completamente chiariti. Noi e altri laboratori hanno sviluppato prove certe che esosomi secreti da HIV-1 le cellule infettate giocano un ruolo in entra...

L&#39;HIV-1 epidemia continua ad avere un impatto significativo in tutto il mondo. A partire dal 2013, circa 35 milioni di persone in tutto il mondo vivevano con l&#39;HIV, e 2,1 milioni di questi erano individui contagiati 1. Le strategie di prevenzione e un maggiore accesso alla terapia antiretrovirale sono stati utili nel ridurre l&#39;acquisizione complessiva di HIV. Tuttavia, singole popolazioni stanno ancora sperimentando aumenti per l&#39;acquisizione di HIV-1. Quindi, vi è la necessità di proseguire gli sforzi per affrontare questa epidemia. Uno dei più forti predittori di progressione della malattia da HIV è attivazione immunitaria cronica (CIA) 2-10. Definito da persistentemente elevati livelli di citochine rilevabili e marcatori di espressione elevati sulla superficie dei linfociti T, CIA è stato attribuito a: i) continua la produzione di cellule dendritiche di tipo I IFN 11; (ii) l&#39;attivazione immunitaria diretta guidata da proteine ​​dell&#39;HIV Tat, Nef e gp120 12; (iii) Traslocazione di proteine ​​batteriche intestinali associate a cellule immunitarie 6. Tuttavia, il meccanismo esatto (s) cronica sottostante, l&#39;attivazione immunitaria sistemica nell&#39;infezione da HIV devono ancora essere completamente chiariti. Il nostro gruppo di ricerca e altri hanno dimostrato un ruolo di esosomi HIV patogenesi 15-18. Il nostro gruppo ha stabilito che la proteina Nef è escreto dalle cellule infette in esosomi 15, e exosomal Nef (exNef) è presente nel plasma di individui affetti da HIV a livelli nanogrammi 18. Abbiamo dimostrato che astante CD4 + T-cellule esposte a exNef provocato attivazione indotta morte cellulare dipendente dal percorso CXCR4 19, 20. In alternativa, monociti / macrofagi erano refrattari all&#39;apoptosi exNef indotta, ma esposto funzioni cellulari alterati e di espressione di citochine. Esosomi Più di recente, il nostro gruppo ha dimostrato isolate dal plasma di individui affetti da HIV contengono una varietà di citochine pro-infiammatorie. Further, ingenui cellule mononucleate del sangue periferico esposti a exosomes plasmaderivati ​​da pazienti con infezione da HIV indotta espressione di CD38 sulle cellule memoria ingenuo e centrale CD4 + e CD8 + T. Ciò probabilmente contribuisce ad infiammazione sistemica e la propagazione virale tramite l&#39;attivazione delle cellule astante 21, e suggerisce che esosomi giocano un ruolo importante nella patogenesi dell&#39;HIV. Nel indagare il ruolo di esosomi nella patogenesi dell&#39;HIV, una sfida sta sviluppando tecniche per esosomi efficacemente separati da particelle di HIV, pur mantenendo il contenuto exosomal così come la loro capacità funzionale modulazione immunitaria. Diversi metodi sono stati descritti per isolare esosomi da coltura cellulare e fluidi biologici 22,23. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità (esosomi galleggiare con una densità di 1,15 - 1,19 g / ml), ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l&#39;isolamento exosome 23.Tuttavia, con infezione da HIV supernatanti di coltura cellulare e nel plasma dei pazienti contengono sia esosomi e HIV-1 particelle virali. Esosomi e HIV-1 particelle sono molto simili per dimensioni e densità. In alternativa, sfruttando l&#39;espressione di marcatori exosomal unici come CD63, CD45, CD81 e, esosomi sono stati isolati con metodi di cattura immunoaffinità 23. Questa procedura può separare il virus da esosomi. Tuttavia, l&#39;inconveniente di questa tecnica è la stretta attaccamento di anticorpi purificati esosomi, che potrebbero interferire con la valutazione del potenziale immunomodulante di esosomi in coltura. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo sviluppato una procedura per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano modificati rispetto Cantin e collaboratori 22 utilizzando iodixanolo gradienti di velocità. Esosomi sono stati trovati a segregare in bassa densità / frazioni superiori di gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali separati nel altadensità / frazioni inferiori. Particelle virali sono stati identificati da p24 ELISA e esosomi sono stati identificati utilizzando marcatori exosome AChE, CD9, CD63, CD45 e. Le frazioni a bassa densità superiori raccolti contenevano esosomi che erano negativi per la contaminazione da HIV-1 p24. La purificazione efficiente e la separazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano permette di accurato esame del contenuto di esosomi derivati ​​dal plasma umano e l&#39;indagine del loro potenziale modulatore immunitario e il valore diagnostico e prognostico di esosomi in HIV-1 patogenesi.

<table><tbody><tr><td>Provette BD Vacutainer EDTA (10ml)&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>provette top rosa</td></tr><tr><td>Lymphoprep Reagente Ficoll</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep reagente iodixanolo</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga da 14 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>provette ultratrasparenti</td></tr><tr><td>Gradient Former Modello 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di acetiocolina</td> Acido benzoico <td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetil colinesterasi</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per microtitolazione trasparente a 96 pozzetti</td><td>Partner di forniture mediche</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre SpectraMax 190</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Lettore di piastre fluorescenti</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Cella</td><td></td><td></td><td></td>di trasferimento</tr><tr><td>Tris-HCl Criterion gel prefabbricati</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD45</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Anticorpo (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo CD9 (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio pAb p24 HIV-1&nbsp;</td><td>Membrana in nitrocellulosa ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata Tris</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) coniugato HRP</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Anticorpo</td></tr> secondario <tr><td>IgG (H+L) coniugato HRP</td> capra <td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td></td></tr><tr><td>Reagente luminol Western blotting</td><td>capra Santa Cruz, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Kit di immunodosaggio delle citochine della procarta umana</td><td>Affymetrix&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Pannello di immunodosaggio personalizzato</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Lettore di immunosfere</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Contatore di particelle</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Contatore di cellule</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 marcato anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>marcato APC/Cy7 anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>marcato PerCP anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 BD Bioscience marcato con V450</td><td>(RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45RA BD Bioscience marcato</td><td>con biotina (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L Biolegend marcato con PE/Cy7</td><td>(DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD38 Biolegend marcato con PE/Cy5</td><td>(HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/ Anti-HLADR marcato con Cy7</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Anti-streptavidina marcato con rosso</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>Topo marcato con PE/Cy5 IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>Topo marcato con APC/Cy7 IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di esosomi dal plasma di hiv-1 individui positivi

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Esosomi sono piccole vescicole di dimensioni variabili da 30 nm a 100 nm che vengono rilasciati sia costitutivamente e dopo stimolazione da una varietà di tipi di cellule. Si trovano in una serie di fluidi biologici e sono noti per portare una varietà di proteine, lipidi e molecole di acido nucleico. Originariamente pensato per essere poco più di serbatoi di detriti cellulari, i ruoli di esosomi che regolano processi biologici e nelle malattie sono sempre più apprezzati. Diversi metodi sono stati descritti per isolare exosomes di terreni di coltura cellulare e fluidi biologici. A causa delle loro piccole dimensioni e bassa densità, ultracentrifugazione differenziale e / o ultrafiltrazione sono le tecniche più comunemente utilizzati per l&#39;isolamento exosome. Tuttavia, il plasma di HIV-1 individui infetti contiene sia esosomi e particelle virali HIV, che sono simili per dimensioni e densità. Così, la separazione efficiente di esosomi da particelle virali HIV nel plasma umano è statouna sfida. Per far fronte a questa limitazione, abbiamo sviluppato una procedura modificata da Cantin et. al., 2008 per la purificazione di esosomi da particelle di HIV nel plasma umano. Iodixanolo gradienti di velocità sono stati usati per separare esosomi da HIV-1 particelle nel plasma di HIV-1 individui positivi. Particelle virali sono stati identificati mediante p24 ELISA. Esosomi sono stati individuati sulla base dei marcatori exosome acetilcolinesterasi (AChE), e gli antigeni CD9, CD63, CD45 e. La nostra procedura gradiente prodotto preparativi exosome gratuitamente particelle virali. La purificazione efficiente di esosomi da plasma umano ci ha permesso di esaminare il contenuto di exosomes derivati ​​dal plasma e di indagare il loro potenziale di modulazione immunitaria e altre funzioni biologiche.

Esosomi vengono efficacemente purificati da HIV-1 plasma umano positivo. Isolato esosomi, identificate da acetilcolinesterasi (AChE), segregati in frazioni bassa densità 1-3 in cima gradienti iodixanolo, mentre le particelle virali, identificate da HIV-1 dell&#39;antigene p24 , segregata nelle frazioni ad alta densità (10-12, nella parte inferiore). La presenza di esosomi è stata ulteriormente confermata dalla individuazione di marcatori immunoblot exosome AChE, CD9, CD4...

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Durante l'infezione da HIV, sia i virus che microvescicole chiamate esosomi vengono prodotti da cellule infettate dal virus. L'obiettivo generale di questo procedimento è separare gli esosomi dalle particelle virali in campioni di plasma provenienti da pazienti infettati da HIV. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo degli esosomi, come ad esempio quali proteine o altre molecole siano presenti negli esosomi prodotti durante l'infezione da HIV.La procedura sarà dimostrata dal dottor Ming Bo Huang, docente del dipartimento di microbiologia, biochimica e immunologia e membro del gruppo HIV/AIDS presso la Moorehouse School of Medicine. Dopo aver raccolto il sangue umano e isolato il plasma secondo il protocollo indicato, aggiungere 10 millilitri di PBS 1X a 10 millilitri di plasma in un tubo da 15 millilitri. Centrifugare il campione a 10.000 ×g e a 4 °C per 30 minuti per rimuovere i detriti cellulari.Con una pipetta sierologica sterile, trasferire il surnatante di plasma chiarificato in un tubo da ultracentrifuga pulito da 25 millilitri. Successivamente, centrifugare il plasma chiarificato a 200.000 ×g e a 4 °C per due ore al fine di separare le ve

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l'analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l'isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Gli esosomi isolati al plasma possono essere utilizzati come un modo non invasivo e ripetibile per il rilevamento e il follow-up dei biomarcatori per la diagnosi precoce e la progressione della malattia. Questo video descrive il protocollo per la separazione degli esosomi dai campioni di plasma di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule, che potrebbero essere utilizzati per l'estrazione di DNA e proteine.

Isolamento degli esosomi: una tecnica per separare gli esosomi dal plasma di pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule

Il fluido biliare è una preziosa fonte di vescicole/esosomi extracellulari che contengono biomarcatori potenzialmente importanti. Questo protocollo rappresenta un metodo robusto per isolare gli esosomi dalla bile umana per ulteriori analisi, tra cui la profilazione dei miRNA.

Isolamento e Profiling di MicroRNA contenenti Esosomi da bile umana

I microRNA svolgono un ruolo regolatore importante e stanno emergendo come nuovi bersagli terapeutici per varie malattie umane. E 'stato dimostrato che i miRNA sono effettuate in lipoproteine ​​ad alta densità. Abbiamo sviluppato un metodo semplificato per isolare rapidamente HDL purificata per l'analisi miRNA dal plasma umano.

Veloce e semplificato Metodo per alta through-put Isolamento dei miRNA da altamente purificato lipoproteine ​​ad alta densità

Questo protocollo descrive l'isolamento e la quantificazione di piccoli RNA di lipoproteine ad alta densità.

Isolamento di lipoproteine ​​ad alta densità per non codificante Piccolo RNA Quantificazione

Qui, descriviamo un metodo di proteomica quantitativa utilizzando la tecnica di etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per analizzare gli effetti di HIV-1 su proteomi exosomal host. Questo protocollo può essere facilmente adattato alle cellule in diverse condizioni di stress o infezione.

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Qui, presentiamo un protocollo per purificare gli esosomi da siero con ridotta co-purificazione non-exosomal di proteine del sangue e del plasma. Il protocollo ottimizzato include ultrafiltrazione, trattamento con proteasi e cromatografia di esclusione di formato. Una maggiore purificazione di esosomi analisi a valle di vantaggi, tra cui più accurata quantificazione delle vescicole e caratterizzazione proteomica.

Digestione delle proteine, ultrafiltrazione e cromatografia di esclusione di formato per ottimizzare l'isolamento degli esosomi da siero e Plasma sanguigno umano

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Questo articolo descrive una metodologia per l'isolamento, la caratterizzazione e la quantificazione di vescicole extracellulari (EV) derivate dal plasma umano e presenta un flusso di lavoro per l'analisi label-free del proteoma EV utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem (LC-MS/MS).

Isolamento, caratterizzazione e analisi proteomica di vescicole extracellulari derivate dal plasma per la scoperta di biomarcatori cardiovascolari

Abbiamo sviluppato un vettore lentivirale che possiede, oltre alla Tat-reattiva LTR, l'Ap-risposta elemento (RRE) che possono regolare l'espressione genica giornalista in modo da HIV-1 Tat e Rev-dipendente. Il vettore consente l'individuazione specifica di replicare l'HIV nelle cellule viventi attraverso l'espressione di GFP.

Marcatura specifica di HIV-1 Cellule positive con un Rev-dipendente Vector lentivirali Esprimendo la proteina fluorescente verde

Scopri la procedura di gradiente per isolare esosomi dal plasma di pazienti HIV-1 positivi. Questo metodo consente di analizzare citochine e chemochine per studiare la patogenesi dell'infezione.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

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