Name: Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Scopri come valutare il rimodellamento vascolare materno durante la gravidanza nel topo usando metodi stereologici e immunistochimica. Questa tecnica fornisce una lettura quantitativa robusta per studiare le arterie spiralate deciduali.

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Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Colucci per le utili discussioni. Questo lavoro è stato finanziato da The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], dal Centre for Trophoblast Research e dalla British Heart Foundation.

Tutte le procedure descritte in questo manoscritto sono in conformità con le normative UK Home Office e sono approvati dalla Ethical Review Panel Cambridge. 1. Raccolta dei campioni <ol><li> Impostare accoppiamenti cronometrate con 8-12 settimane vecchia femmina C57BL / 6 topi con maschi adulti (fino a 2 femmine per ogni maschio) nel pomeriggio. Verificare la presenza di tappi vaginali come segno di copulazione prime ore del mattino nei giorni seguenti. La presenza di un plug nella mattina marchi gd0.5. </li><li> Su gd9.5, eutanasia dell&#39;animale da dislocazione cervicale e aprire la cavità addominale. Si noti che l&#39;eutanasia da CO 2 può causare vasodilatazione. </li><li> Utilizzare il filo interdentale per legare delicatamente le arterie uterine (Figura 1, frecce tratteggiate). Legare il filo intorno alle arterie sulla punta di ogni corno uterino, prossimale alle ovaie, così come intorno alla cervice. Nota: Non rompere i vasi in quanto ciò potrebbe causare arterie crollate. </li> &lt;li&gt; sezionare il utero rapidamente utilizzando forbici dissezione, ablazione del tutto utero distale ai tre punti legatura sulla punta delle corna uterine e la cervice. </li><li> Posizionare l&#39;utero su un pezzo di polistirene preparato in modo che entrambe le corna sono allineati lungo il medesimo asse lungo in direzioni opposte dalla cervice. Allungare delicatamente e pin in posizione 25 con 2-3 aghi G. </li><li> Immergere il polistirolo in un tubo da 50 ml preparati. Top fino a 50 ml con formalina al 10%. Fix per 5-6 ore a temperatura ambiente. </li><li> Scartare la soluzione di formalina e sostituire con 50 ml 1x tampone fosfato salino (PBS) per 5 min. </li><li> Accise le due corna uterine prossimale al punto legatura a ciascuna estremità prossimale e al collo dell&#39;utero, nel centro, tagliare l&#39;eventuale eccesso di grasso intorno ai siti di impianto e lavare due volte in PBS per 5 minuti per rimuovere le tracce di formalina. </li><li> Conservare i campioni in etanolo al 70% a 4 ° C (per due settimane) fino all&#39;elaborazione. ATTENZIONE: EthAnol è altamente infiammabile. </li><li> Utilizzare un sistema di trattamento automatizzato utilizzando i parametri indicati in tabella 1. Incorporare le corna singolarmente in paraffina modo che possano essere tagliati lungo il piano perpendicolare all&#39;asse lungo dell&#39;utero. Questo assicura che l&#39;area massima di ogni sito implantologico verrà esposta per analisi nel mezzo del blocco (Figura 2A). OPTIONAL: Questo è un punto di tempo comodo per randomizzazione dei blocchi se lo si desidera. </li><li> Utilizzando un microtomo, tagliare sezioni seriali di 7 micron di spessore dai blocchi. Macchia una sezione ad ogni intervallo di 49 micron con ematossilina e eosina (H &amp; E, vedere paragrafo 2.1). Conservare le restanti sezioni a temperatura ambiente per SMA colorazione e altre applicazioni a valle. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> Soluzione </td><td style="width:43px;"> Orario<html></td><td style="width:97px;"> Temperatura </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70% etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100% di etanolo </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Xilene </td><td> 1 ora </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> Paraffina </td><td> 1 ora </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Impostazioni per la lavorazione dei tessuti automatizzata Panoramica di regolazione usate per la lavorazione di tessuto uterino 2. SterValutazione eological <ol><li> H &amp; E colorazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack scorrevole in un bagno di xilene 100% per 10 min a temperatura ambiente. ATTENZIONE: xilene è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Questo lavoro deve essere condotto in una cappa aspirante, utilizzando i dispositivi di protezione individuale (DPI). </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in 50% Gill Nessuna soluzione ematossilina 3, diluita con acqua purificata, per 5 min. ATTENZIONE: ematossilina è nociva per ingestione e contatto per gli occhi. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Lavare i vetrini in una vaschetta di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> Immergere i vetrini in 1% soluzione di acido / alcol (1% di acido cloridrico al 10 M in etanolo 70%) per 10 sece lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente. </li><li> Immergere i vetrini in soluzione eosina per 30 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente per 10 minuti. </li><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, sequenzialmente immergere i vetrini in bagni contenenti 70% di etanolo, 95% di etanolo e 100% etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio. </li></ol></li><li> Valutazione stereologica della nave Dimensioni e Rimodellamento Stato <ol><li> Per ogni sito di impianto, determinare in quali sezioni sono vicini al punto di midsagittal. L&#39;attaccamento corioallantoidea tra il feto e la placenta in via di sviluppo costituisce un buon indicatore del punto midsagittal. </li><li> Selezionare 3 sezioni a 49 micron intervalli vicine al punto midsagittal per l&#39;analisi. Scansione diapositive selezionate. Per evitare incvene Luding, che hanno dimostrato di essere più perifericamente situato nei siti di impianto 16, limitare l&#39;analisi sul centrale 2/4 di ogni sito d&#39;impianto (Figura 2A). </li><li> Per valutare dimensione del lume, disegnare intorno all&#39;interno dei vasi e registrare l&#39;area di questa forma. Per la dimensione totale del vaso, disegnare attorno alla parete esterna del recipiente, comprese le cellule endoteliali, e leucociti periciti intramurali. Nota: Il rapporto tra dimensione totale nave a lume è un proxy per lo stato ristrutturazione di una nave. Come i vasi bobina attraverso il piano che la sezione è stato tagliato lungo, vi possono essere più sezioni della stessa arteria una diapositiva. Evitare di misurare la stessa arteria più volte. </li><li> Registrare le misure delle 5 navi in ​​ciascun sito di impianto con le più grandi e più rotondi lumen. Misurare ogni sito di impianto in triplicato (tre sezioni distanziati 49 micron l&#39;uno dall&#39;altro). La media di questi 15 misurazioni represeNTS il diametro medio dei vasi più grandi. </li><li> Per evitare overrepresentation dei vasi grandi in alcuni campioni, misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. </li></ol></li></ol> 3. qualitativa valutazione utilizzando immunoistochimica <ol><li> Deparaffinizzazione e reidratazione <ol><li> Deparaffinare sezioni immergendo diapositive montate in un rack heatproof scivolare in un bagno di xilene 100% per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenenti xilene pulita per altri 10 min. </li><li> Sequenziale immergere i vetrini in bagni contenenti etanolo al 100%, 95% etanolo e 70% e acqua purificata per 5 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Antigen Retrieval <ol><li> Preparare un 10 mM tampone citrato di sodio in acqua depurata e regolare a pH 6 con 10 M di acido cloridrico. </li><li> Riempire un contenitore resistente al calore che può contenere 600 ml con 400 ml di sodio citrato e luogo di buffer in una pentola a pressione interna contenente wat sufficienteer a sommergere la metà del contenitore. Liberamente fissare il coperchio della pentola a pressione e calore fino a ebollizione. </li><li> Porre il vetrino cremagliera nel buffer citrato di sodio e fissare saldamente il coperchio della pentola a pressione. Una volta pressurizzato, far bollire per 3 minuti. </li><li> Depressurizzare la pentola a pressione e rimuovere il contenitore interno. Lasciare raffreddare i vetrini nel tampone citrato di sodio per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in un bagno contenente acqua purificata per 5 min. </li><li> Circondare la sezioni usando una penna barriera idrofobica. </li><li> Lavare i vetrini immergendo in PBS per 5 min. </li></ol></li><li> Blocco endogena perossidasi e legame non specifico <ol><li> Incubare sezioni con 3% di perossido di idrogeno diluito in acqua purificata in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. ATTENZIONE: Il perossido di idrogeno è altamente irritante per gli occhi, la pelle e per ingestione. Indossare appropriati DPI. </li><li> Toccare off soluzione di perossido d&#39;idrogeno in eccesso e lavare slides due volte immergendo in soluzione fisiologica tamponata Tris (TBS) per 2 minuti ciascuna. </li><li> Incubare sezioni con il mouse immunoglobulina bloccando reagente dal mouse sul corredo del mouse preparato secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per 2 minuti ciascuna. </li></ol></li><li> Immunolocalizzazione di actina del muscolo liscio <ol><li> Preparare la soluzione diluente anticorpale (fornito nel kit) e incubare con sezioni per 5 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Diluire 1: actina muscolo liscio 100 topo anti-umano (DAKO m0851) in soluzione diluente. Diluire il mouse IgG2a controllo isotipico in soluzione diluente, assicurando che la concentrazione finale immunoglobulina è equivalente in entrambe le soluzioni. </li><li> Toccare off soluzione diluente e coprire le sezioni in eccesso sia con soluzioni di controllo degli anticorpi o isotipo diluiti. Incubare in una camera umidificata per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini due volte in TBS per2 min ciascuno. </li><li> Diluire anticorpo secondario anti-topo biotinilato e incubare sezioni per 10 minuti a temperatura ambiente, o secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare i vetrini una volta con TBS e PBS per 2 min, rispettivamente. </li><li> Preparare la soluzione 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) in base alle istruzioni del produttore. Coprire sezioni con soluzione DAB e incubare fino a 4 min, assicurando a monitorare le sezioni al fine di evitare lo sviluppo del colore in eccesso. ATTENZIONE: DAB è infiammabile e un sospetto cancerogeno che è tossico attraverso il contatto e l&#39;inalazione. Indossare un apposito DPI durante la manipolazione. </li><li> Immergere i vetrini in acqua depurata una volta raggiunta l&#39;intensità desiderata di colorazione. </li><li> Controcolorare con il 50% di Gill n ° 3 ematossilina per 20 secondi e lavare in una vasca di colorazione sotto acqua corrente fino a quando l&#39;acqua è pulita. </li></ol></li><li> Disidratazione e montaggio <ol><li> All&#39;interno di una cappa aspirante, in sequenza immergere i vetrini in bagni contenenti il ​​70% ethAnol, etanolo al 95% e il 100% di etanolo per 5 minuti ciascuna. </li><li> Immergere i vetrini in bagno contenente xilene per 10 min. </li><li> Mount coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene-. Essiccare orizzontalmente e completamente in una cappa aspirante prima visualizzare i vetrini al microscopio </li></ol></li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentata è progettato per fornire un metodo riproducibile che per valutare le modifiche vascolari che sono necessarie per gravidanza. Critico per il successo di questa valutazione è la qualità delle sezioni di tessuto. Sia determinare con precisione l&#39;età gestazionale dei siti di impianto, così come affidabile legando le arterie uterine sono passi cruciali. Le variazioni di parametri quali il tempo di fissazione, protocollo tessuto-processing, ecc possono influire sul risultato. Per una valutazione stereologica imparziale, è importante misurare lo stesso numero di navi in ​​ciascun sito di impianto. Si raccomanda di misurare 5 navi per sito di impianto e ogni sito di impianto in triplice copia. La media di queste misurazioni 15 rappresenta la dimensione media delle 5 più grandi vasi. A seguito dei dati da Rag2 alymphoid - / - IL2RG - / - mice mostrate qui, abbiamo trovato questo protOcol utile per una serie di modelli di inadeguata funzione immunitaria materna, tra cui una delle cellule NK inibiti 14. Difetti di rimodellamento arterioso hanno anche dimostrato in modelli di alterata trofoblasto dell&#39;invasione 18 e le tecniche qui descritte possono essere utili per valutare la vascolarizzazione in questi casi. Abbiamo ottimizzato e validato questo protocollo per la ricerca di deciduali rimodellamento vascolare a metà della gestazione nel topo, ma è anche ipotizzabile, ad adeguare il protocollo di lavorare in altri sistemi modello (ad esempio ratti) o anche in altri organi. Mentre troviamo che il rimodellamento NK-dipendente può essere robustamente valutata a gd9.5, esso può essere modificato per altri momenti, come gd12.5, quando il sistema vascolare materno è completamente ristrutturato. A questo punto di tempo, trofoblasto endovascolare invasione è profondo 16 e questo punto di tempo potrebbe essere più adatto per le indagini del ruolo di trofoblasto per cambiamenti vascolari. Se si desiderano ulteriori letture quantitativi,gli investigatori possono anche aumentare il numero di sezioni colorate per la SMA e valutare la percentuale di navi parzialmente ristrutturato all&#39;interno di ogni sito dell&#39;impianto. Un limite di questo protocollo è la natura descrittiva degli esami istologici. Saggi funzionali, tuttavia, sono solo lentamente diventando disponibili (come ecocolordoppler 19). Queste tecniche richiedono competenze tecniche e costi molto più elevati per l&#39;acquisizione e la manutenzione delle apparecchiature, ma hanno il vantaggio di fornire una lettura longitudinale in vivo per l&#39;effetto delle variazioni osservabili istologicamente. Un possibile svantaggio di tutti gli esami stereologici è la soggettività degli investigatori. A tal fine, con due esaminatori indipendenti che analizzano tutti i campioni in modo indipendente può contribuire ad evitare questo problema. Mentre il protocollo descritto qui fornisce una visione in quanto sangue può raggiungere l&#39;interfaccia feto-materna, può essere vantaggioso combinare con il complapproccio ementary di valutare la quantità totale di sangue in un dato momento nel sistema vascolare attraverso la plastica getta 16. La forza di questo protocollo è che combina due approcci indipendenti. Cambiamento vascolare viene prima quantitativamente valutata stereologia e il risultato viene poi convalidato qualitativa, utilizzando l&#39;immunoistochimica. L&#39;affidabilità dei risultati può essere ulteriormente rafforzata dalla randomizzazione dei campioni. I campioni preparati per questo protocollo può essere facilmente utilizzato per studiare anche altri parametri di gravidanza, come decidualisation, lo sviluppo dell&#39;aggregato linfoide mesometrial di gravidanza (MLAP) o immunolocalizzazione di cellule di interesse, di valutare con rigore un fenotipo gravidanza a midgestation. Rimodellamento arteriosa è un passaggio fondamentale per le gravidanze senza complicazioni nelle donne e il fallimento di questi cambiamenti è alla base delle grandi sindromi ostetriche (GOS), vale a dire pre-eclampsia, restrizione della crescita fetale enati morti. Vi presentiamo qui le tecniche per valutare attentamente un fenotipo gravidanza in modelli murini che imitano alcune caratteristiche della fisiopatologia del GOS.

Lo scambio di sostanze nutritive, gas e prodotti di scarto durante la gestazione eutherian è mediato dalla placenta. Nel tratto riproduttivo femminile, le arterie uterine sono i principali condotti di sangue verso l&#39;utero. Dopo l&#39;impianto, questi ramo in vasi specializzati chiamati arterie spirali che avvolgono attraverso le basale decidua verso l&#39;unità fetoplacentare. Diametro e l&#39;elasticità di queste arterie spirali, che sono circondate da leucociti, in particolare uterina natural killer (Unk), le cellule, dettare il volume e la velocità di sangue a disposizione alla placenta 1,2. Modificazioni emodinamiche corretti come risultato di rimodellamento delle arterie spirali sono fondamentali per il successo della gravidanza. Mentre i meccanismi sottostanti differiscono in dettaglio tra umano e murino gravidanza, il risultato finale del processo di rimodellamento in entrambe le specie è dilatato, alta conduttanza vascolare che perde il suo strato di muscolatura liscia. Nei topi, l&#39;interferone Zio derivato dalle cellule (IFN-) γ è necessario per indurre questi cambiamenti a intorno a metà della gestazione 3-5. I topi che mancano sia le cellule NK o componenti della via di segnalazione di IFN-γ non riescono a subire questi cambiamenti e questo è associato ad una ridotta crescita fetale 6,7, sottolineando l&#39;importanza di un adeguato apporto di sangue per l&#39;unità fetoplacentare. Durante la prima gravidanza umana, l&#39;invasione interstiziale ed endovascolare di trofoblasto extravilloso e la loro interazione con le cellule unk sono importanti per indurre alterazioni vascolari e di promuovere la crescita del feto 8-10. Lo Zio cellule possono orchestrare invasione trofoblasto umano attraverso chemochine e citochine 11, come granulociti e macrofagi - fattore stimolante le colonie (GM-CSF) 12. Shallow invasione trofoblasto è associato con ridotte rimodellamento arteriosa e complicazioni durante la gravidanza come la pre-eclampsia 9. Questo protocollo si basa sul lavoro pionieristico di Anne Croy che ha descritto l&#39;importanteruolo del sistema immunitario e in particolare NK-IFN-γ derivato per il successo rimodellamento vascolare attraverso immunoistochimica e di trasferimento eleganti esperimenti 5,13. Qui si descrive un modo veloce ed economico per valutare lo stato di rimodellamento delle arterie a spirale. Anche se il nostro laboratorio valuta regolarmente presente a metà della gestazione (giorno di gestazione (GD) 9.5) 14, il processo di rimodellamento avviene tra gd8.5 e 12,5 15. L&#39;avvento di scanner per diapositive automatizzati ha notevolmente facilitato la valutazione delle aree nave e lume dalle sezioni e abbiamo trovato che questo è un approccio più riproducibile di misurare i diametri dei vasi. L&#39;aggiunta di rilevazione immunoistochimica di SMA consente una semplice validazione dei risultati ottenuti dalla valutazione stereologica. Come per tutte le tecniche di stereologici, si raccomanda di eseguire la valutazione come un esperimento in cieco da almeno due esaminatori. A tal fine, un passo randomizzazione può essere introdotto quando serialmente tagliareting i campioni in modo che gli investigatori valutare le diapositive non sanno da quale gruppo sperimentale i campioni provengono. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire uno strumento affidabile per valutare attentamente la ristrutturazione delle arterie spirali nei topi con genotipi materni e paterni definiti, nel contesto di modelli murini per le complicazioni legate alla gravidanza. I risultati sottolineano la dipendenza da cellule Zio di questo processo, che è essenziale per la normale crescita fetale.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 topi (8-12 settimane)</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filo</td><td></td><td></td><td></td>interdentale</tr><tr><td>Polistirene</td><td></td><td></td><td>Utilizzato per tenere i tessuti in posizione</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione diritte</td><td>EMS</td><td>72940</td><td></td></tr><tr><td>25 G aghi</td><td>BD&nbsp;</td><td>300600</td><td>Utilizzato per tenere in posizione</td></tr><tr><td>i tessuti Provette coniche da 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formalina, tamponata neutra, 10%</td> <td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P3813-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Sigma</td><td>327204-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X/0250/17</td><td></td></tr><tr><td>Processatore automatizzato di tessuti</td><td>Sakura</td><td>6032</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Rack per vetrini</td><td>Sigma</td><td>Z710989</td><td></td></tr><tr><td>Barattolo Coplin</td><td>Sigma</td><td>S5891</td><td></td></tr><tr><td>Acqua</td><td></td><td></td><td></td>purificata</tr><tr><td>Soluzione di ematossilina, Gill n. 3</td><td>Sigma</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Eosina Y</td><td>Sigma</td><td>HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Cappa</td><td></td><td></td><td></td>aspirante</tr><tr><td>Mezzi di montaggio a base di xilene</td><td>VWR</td><td>361254D</td><td></td></tr><tr><td>Scanner per vetrini</td><td>Hamamatsu</td><td>NanoZoomer</td><td></td></tr><tr><td>Software per scanner per vetrini</td><td>Hamamatsu</td><td>Visualizzatore</td><td></td>NDP</tr><tr><td>Citrato di sodio tribasico diidrato</td><td>Sigma</td><td>32320</td><td>Preparare 10 mM di soluzione e regolare il pH a 6</td></tr><tr><td>Pentola</td><td></td><td></td> a pressione <td>Utilizzato per il recupero dell'antigene</td></tr><tr><td>Piastra</td><td></td><td></td> riscaldante <td>Utilizzato per il recupero dell'antigene</td></tr><tr><td>Penna barriera idrofobica</td><td>Vettore</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1800/15</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata Tris</td><td>Sigma</td><td>T6664-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Kit mouse su mouse</td><td>Vector</td><td>BMK-2202</td><td>Riduce significativamente lo sfondo</td></tr><tr><td>Actina muscolare liscia anti-umana del topo</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td>Reagisce in modo incrociato con</td></tr><tr><td>il controllo dell'isotipo IgG2a</td> del topo <td>DAKO</td><td>X0943</td><td></td></tr><tr><td>Camera umidificata</td><td>Sigma</td><td>H6644</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di 3,3'-Diaminobenzidina</td><td>Sigma</td><td>D4293-5SET</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>H/1050/PB17</td><td></td></tr></tbody></table>

valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

La placenta media lo scambio di fattori come gas e sostanze nutritive tra madre e feto e ha esigenze specifiche per l'apporto di sangue dalla circolazione materna. Il sistema vascolare uterino materno deve adattarsi a questa domanda temporanea e il successo di questo processo di rimodellamento arterioso ha implicazioni per la crescita fetale. Le cellule del sistema immunitario materno, in particolare le cellule natural killer (NK), svolgono un ruolo fondamentale in questo processo. Qui descriviamo un metodo per valutare il grado di rimodellamento delle arterie spirali materne durante la gravidanza del topo. Le sezioni di tessuto colorate con ematossilina ed eosina vengono scansionate e le dimensioni dei vasi analizzate. Come metodo di validazione complementare, presentiamo anche una valutazione qualitativa per il successo del processo di rimodellamento mediante rilevazione immunoistochimica dell'actina della muscolatura liscia (SMA), che normalmente scompare dall'interno del mezzo vascolare arterioso a metà gestazione. Insieme, questi metodi consentono di determinare un parametro importante del fenotipo della gravidanza. Questi risultati possono essere combinati con altri endpoint della gravidanza del topo per fornire informazioni sui meccanismi alla base delle complicanze legate alla gravidanza.

Rag2 - / - IL2RG - / - mice mancano tutti i linfociti maturi, comprese le cellule NK 17, e le loro arterie uterine non riescono a subire i cambiamenti vascolari osservati in di tipo selvatico congenic C57BL / 6 (WT) topo intorno a metà della gestazione 5,14. Come risultato di questo ridotto rimodellamento Rag2 - / - IL2RG - / - topi mostrano aree significativamente più piccole luminali di superficie, indicativi dei vasi globale più piccoli che possono essere visualizzati su sezioni H &amp; E-colorati e quantificate stereologically (Figura 2). Inoltre, lo spessore della parete relativa (vaso rapporto lumen) è maggiore nelle arterie spirali in questi topi, suggerendo ridotto apporto di sangue e di velocità del sangue superiori. Questa valutazione quantitativa è stata confermata con la rilevazione immunoistochimica della SMA. E &#39;caratteristico per topi WT a perdere la maggior parte della SMA nei media vascolaredelle arterie a spirale entro la metà di gestazione. Se questo processo cellule NK-driven non avviene, SMA rimane in media dei vasi e può essere facilmente rilevato immunoistochimiche come anelli intorno ai vasi sanguigni (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> Figura 1: utero mouse a gd9.5, riassunto schematico disegno che mostra le posizioni relative della corna uterine, cervice uterina (blu) e principali arterie uterine (rosso).. Indicati sono l&#39;asse delle corna uterine (frecce) ed i punti di legatura (frecce tratteggiate). Le sezioni per immunoistochimica sono tagliate lungo il piano di vista. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> Figura 2:. Valutazione stereologica di rimodellamento arterioso a metà della gestazione (A) Esempio assessment di luminale e superfici totali delle navi su sezioni H &amp; E macchiato dalle femmine WT nella centralissima 2/4 delle basalis decidua (delimitata dalla nera verticale linee tratteggiate) a gd9.5. Nelle navi in ​​alto ingrandimento, la linea rossa tratteggiata delimita un&#39;area totale nave, linea gialla tratteggiata delimita un&#39;area lumen. Bar = 500 micron (a sinistra), 50 micron (a destra). L&#39;asse lungo dell&#39;utero è una linea orizzontale in questo orientamento. (B) Quantificazione delle aree luminali (pannello di sinistra) e rapporto di area luminale all&#39;area nave totale (pannello di destra) da WT (C57BL / 6) e Rag2 - / - IL2RG - / - topi (su C57BL / 6 background). Ogni punto di dati rappresenta la media di 15 misurazioni (5 misure per sezione, 3 sezioni per ogni sito dell&#39;impianto). Barre rappresentano in media, n = 11-13 siti di impianto da 4 gravidanze per gruppo; p-value da una a due code, spaiato test di Mann-Whitney. WT: tipo selvatico. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3:. Rilevazione immunoistochimica di actina muscolo liscio nelle basale decidua Rappresentante SMA colorazione su WT (in alto) e Rag2 - / - IL2RG - / - mice (su C57BL / 6 sfondo, fondo) a gd9.5. Bar = 100 micron. WT: tipo selvatico.

Questo protocollo descrive una tecnica per valutare i cambiamenti nel sistema vascolare materno durante la gravidanza nei topi. Utilizzando metodi stereologici, il rimodellamento delle arterie spirali deciduali viene valutato quantitativamente e i risultati confermati qualitativamente utilizzando l'immunoistochimica.

Valutazione della materna vascolare rimodellamento durante la gravidanza in utero mouse

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le modificazioni vascolari materne necessarie per una normale crescita fetale e placentare durante la gravidanza nel topo. Pertanto, questo metodo è utile per caratterizzare con attenzione l'adattamento vascolare materno che si verifica durante la gravidanza, adattamento che potrebbe avere significative implicazioni per la crescita fetale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un'analisi stereologica solida e riproducibile, che può essere convalidata mediante la visualizzazione dell'actina del muscolo liscio vascolare residuo tramite immunohistochimica.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché l'orientamento corretto del tessuto uterino durante la preparazione, che cambia notevolmente nel corso della gestazione, è essenziale per il successo della procedura. Al giorno di gestazione 9,5, passare con attenzione un filo interdentale sotto un corno uterino di un topo C57 Black 6 incinta accoppiata in data nota, in prossimità dell'ovaio, ed eseguire un legamento delicato ma stretto del filo per occludere l'arteria uterina. Ripetere il legamento sotto l'altro corno e attorno alla cervice per impedire il collasso delle arterie.Quindi escidere rapidamente l'intero utero distalmente ai tre punti di legatura situati alla punta delle corna e al collo dell'utero. Posizionare l'utero su un pezzo di polistirene con entrambe le corna uterine allineate lungo lo stesso asse longitudinale, in direzioni opposte rispetto al collo dell'utero. Successivamente, stirare delicatamente il tessuto utilizzando due o tre aghi da 25 gauge per fissarlo in posizione.Immergere il polistirene in un tubo conico da 50 millilitri e fissare il tessuto uterino con fino a 50 millilitri di formalina al 10% a temperatura ambiente. Il tessuto uterino è molto delicato e deve essere manipolato con cura prima della fissazione per evitare danni o lacerazioni. Dopo cinque-sei ore, sostituire la formalina con 50 millilitri di PBS per un lavaggio di cinque minuti.Quindi dissezionare i corni uterini in prossimità dei punti di legatura alle due estremità e in prossimità del punto di legatura cervicale al centro. Rimuovere eventuali accumuli di grasso dagli impianti embrionali. Successivamente lavare l'utero altre due volte in PBS per cinque minuti ciascuna per eliminare eventuali tracce residue di formalina e conservare il tessuto in etanolo al 70% a quattro gradi Celsius utilizzando un sistema automatico di elaborazione con i parametri impostati come indicato nella tabella.Incorporare individualmente le corna in paraffina in modo che possano essere sezionate lungo il piano perpendicolare all'asse lungo dell'utero. È essenziale incorporare tutti i campioni nella stessa orientazione, poiché ciò garantirà un profilo trasversale uniforme nei diversi siti di impianto dopo il sezionamento. Dopo aver ottenuto sezioni seriali di sette micron di spessore al microtomo, colorare una sezione ogni 49 micron con ematina ed eosina e conservare le sezioni a temperatura ambiente per ulteriori analisi successive.Per valutare le dimensioni del vaso e lo stato di rimodellamento del tessuto per ciascun sito di impianto, selezionare tre sezioni a intervalli di 49 micron che siano vicine al punto medio sagittale. Dopo aver scansionato le diapositive selezionate, limitare le analisi alle due quarti centrali di ciascun sito di impianto per evitare di includere le vene. Per valutare le dimensioni della luz, selezionare un'area di interesse intorno all'interno dei vasi e registrare l'area della regione per ottenere la dimensione totale del vaso.Tracciare una regione di interesse attorno alla parete esterna del vaso, includendo le cellule endoteliali, i parassiti e i leucociti intramurali. Infine, avendo cura di non misurare più volte la stessa arteria, registrare le misurazioni in triplice copia dai cinque vasi in ciascun sito di impianto con le luci più grandi e più rotonde, come risultato del ridotto rimodellamento mostrato dai topi immunodeficienti Rag due con knockout della catena gamma del recettore IL due. Questi animali mostrano anche aree superficiali luminari significativamente più piccole, indicative di vasi complessivamente più piccoli, che possono essere visualizzati mediante colorazione ematossilina-eosina come mostrato qui per i topi di tipo selvatico e quantificati stereologicamente.Inoltre, il rapporto relativo tra vaso e lume è più elevato nelle arterie spirali di questi topi, suggerendo un apporto ematico ridotto e una maggiore velocità del flusso ematico nei topi immunodepressi. La valutazione quantitativa di questo esperimento rappresentativo è stata confermata mediante rilevamento immunohistochimico dell'actina dei muscoli lisci, la maggior parte della quale viene persa dalla tonaca media delle arterie spirali di tipo selvaggio a metà della gestazione. Se questo processo mediato dalle cellule NK non avviene, tuttavia, l'actina dei muscoli lisci permane nella tonaca media dei vasi, dove può essere rilevata come anelli di colorazione bruna attorno ai vasi sanguigni. Una volta che le sezioni sono state completamente preparate, le misurazioni e la validazione mediante immunohistochimica possono essere ragionevolmente completate nell'arco di pochi giorni, riducendo così il numero di animali necessari.Questo protocollo può essere combinato con altre tecniche come la citometria a flusso per studiare le popolazioni di leucociti materni o la funzione immunitaria. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare gli adattamenti vascolari materni che si verificano durante la maggior parte della gravidanza.

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