Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di creare un modello organotipico che imiti il microambiente peritoneale per migliorare la nostra comprensione della biologia del cancro ovarico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del cancro ovarico, come ad esempio come le interazioni tra le cellule tumorali e il microambiente contribuiscono alla patogenesi della malattia e come possono essere testati potenziali inibitori di queste interazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le cellule umane primarie che formano le superfici della linea del mesotelio della cavità perale vengono utilizzate nella co-coltura di cellule di cancro ovarico.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul cancro ovarico, può anche essere applicato allo studio di altri tumori che si diffondono in tutta la cavità peritoneale, come i tumori gastrici, pancreatici e del colon. Dopo l'acquisizione di un campione chirurgico di omento umano, immergere immediatamente il campione in PBS a temperatura ambiente. Entro due ore dall'immersione, trasferire l'omento in una provetta conica da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS fresco, trasferire il restante lavaggio di PBS contenente le cellule mesoteliali umane primarie o HPMC e i globuli rossi in una nuova provetta conica da 50 millilitri e far girare le cellule.

Quindi versare il contenuto della provetta in una piastra di coltura sterile da 10 centimetri e utilizzare due bisturi per tritare il tessuto in pezzi di cinque millimetri cubi. Per isolare le cellule mesoteliali umane primarie o HPMC, trasferire i pezzi di omento in una provetta conica da 50 millilitri e attendere un minuto. Affinché i pezzi solidi galleggino verso l'alto, l'HPMC si depositerà sul fondo del tubo con i globuli rossi.

Utilizzare una pipetta per trasferire il lavaggio PBS contenente cellule mesoteliali e globuli rossi nella provetta contenente le cellule pellettate e centrifugare le cellule. Quindi aggiungere 20 millilitri di PBS fresco all'omento e raccogliere il PBS contenente HPMC e RB C3 più volte è appena dimostrato alle celle pellettate originali. Dopo la piastra di centrifuga finale, le cellule in un pallone da 75 centimetri quadrati in 15 millilitri di terreno di crescita completo.

Per isolare ulteriore HPMC dal campione di omento, agitare il tessuto solido rimanente in 20 millilitri di PBS a 200 giri/min e 37 gradi Celsius. Dopo 10 minuti, lasciare riposare il campione per un minuto per consentire al tessuto solido di salire verso la parte superiore della provetta. Quindi raccogliere l'HPMC e l'RBC dal fondo del tubo come appena dimostrato.

Ora, centrifugare le cellule di questo lavaggio secondario e piastrerle in un pallone separato di 75 centimetri quadrati in 15 millilitri di terreno di crescita completo. Per isolare l'eventuale HPMC rimasto, agitare il tessuto per altri 10 minuti, questa volta in una miscela di PBS e 10 millilitri di tripsin EDTA e placcare questi HPMC e RBC in un pallone di 75 centimetri quadrati, quindi incubare le colture a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un ambiente umidificato, alimentando le cellule piastrate con 15 millilitri di fresco, Terreno di crescita completo nei giorni tre e cinque senza rimuovere il terreno esaurito. Gli HPMC possono essere identificati dalla loro forma cuboidale e dalla loro espressione di citocheratina otto e mentone.

Per isolare i normali fibroblasti dell'omento, trattare il restante tessuto dell'omento tritato con 10 millilitri di soluzione 10 x collagenasi di tipo tre appena preparata diluita in terreno privo di siero per sei ore con agitazione alla fine del periodo di incubazione, il tessuto digerito sarà diventato opaco con la soluzione contenente alcuni detriti fibrosi, centrifugare la normale sospensione di fibroblasti dell'omento, e poi la cultura. Le cellule in 13 millilitri di terreno di crescita completo. Dopo 24 ore, sostituire il vecchio terreno con 15 millilitri di terreno di coltura fresco a crescita completa.

I fibroblasti normali dell'omento possono essere identificati dalla loro forma piatta e allungata, dalla loro espressione di vimentina e dalla loro mancanza di citocheratina che aiutano l'espressione. Per rilasciare i normali fibroblasti dell'omento dalla coltura, sciacquare il pallone di coltura con 10 millilitri di PBS, seguiti da tre millilitri di tripsina per non più di cinque minuti. Quando le cellule si sono staccate, neutralizzare la tripsina con almeno tre volte il volume del mezzo di crescita completo e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri.

Girare le celle e risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno di crescita completo. Quindi contare le cellule e diluirle a due-quattro volte 10 al terzo fibroblasto per 100 microlitri di piena crescita, concentrazione media. Quindi, aggiungere 0,5 microgrammi per 100 microlitri di collagene di coda di ratto, uno alle cellule e placcare 100 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra nera a fondo chiaro da 96 pozzetti.

Quindi trasferire la piastra in un incubatore per colture cellulari per almeno quattro ore o fino a quando le cellule aderiscono alla superficie della piastra, mentre i normali fibroblasti si stanno depositando. Staccare l'HPMC dai loro palloni di coltura e diluire queste cellule a una o due volte 10 al quarto HPMC per 50 microlitri di terreno di crescita completo. Quindi aggiungere 50 microlitri di HPMC per pozzetto ai normali fibroblasti dell'omento attaccati e rimettere la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per almeno 18 ore prima della sperimentazione.

Utilizzare il seme del giorno successivo, le cocolture 3D ORGANOTYPIC con cellule tumorali ovariche che esprimono GFP da una coltura confluente dall'80 al 90% alla diluizione appropriata per il test a valle desiderato, il peptide RGD e gli anticorpi bloccanti contro l'alfa cinque, il beta uno e l'alfa cinque. Beta tre. Le integrine inibiscono l'adesione delle cellule di cancro ovarico alla coltura organotipica, mentre il peptide RAD e gli anticorpi di controllo e beta quattro integrine non lo fanno.

Il peptide RRG D e gli anticorpi bloccanti contro l'integrina alfa cinque e beta uno inibiscono anche la proliferazione delle cellule tumorali ovariche sulla coltura organotipica, mentre il peptide RAD e gli anticorpi di controllo alfa cinque, beta tre e beta quattro integrine non lo fanno. Inoltre, il peptide RGD e gli anticorpi bloccanti contro l'integrina alfa cinque e beta uno inibiscono l'invasione della coltura 3D ORGANOTYPIC delle cellule di cancro ovarico. Mentre l'anticorpo integrina alfa cinque beta tre migliora questo processo come previsto dai dati dei saggi di aderenza e proliferazione, anche il peptide RAD e gli anticorpi di controllo e l'integrina beta quattro non hanno mostrato alcun effetto sull'invasione delle cellule tumorali.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sette-12 ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare sempre una cabina di sicurezza biologica e i dispositivi di protezione appropriati, inclusi un camice da laboratorio e guanti dopo questa procedura. Altri metodi, come i saggi di adesione, invasione e proliferazione, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande sulle interazioni delle cellule tumorali con il microambiente dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del cancro ovarico per esplorare come il microambiente influenza le interazioni delle cellule tumorali con le cellule della cavità peritoneale umana. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare le cellule primarie dalla quantità di moto umana e di come costruire una coltura organotipica del rivestimento perale.