Name: Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri come creare un modello organotipico tridimensionale della cavità peritoneale umana utilizzando cellule mesoteliari primarie e fibroblasti. Questo metodo permette di studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

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Ringraziamo tutti gli specializzandi e i medici curanti, in particolare il Dr. A.F. Haney (Università di Chicago, Dipartimento di Ostetricia e Ginecologia) per aver raccolto biopsie omentali. Inoltre, ringraziamo Stacey Tobin e Gail Isenberg per aver curato attentamente questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Bears Care, il beneficiario di beneficenza del Chicago Bears Football Club, del National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702 e del National Cancer Institute che concede R01 CA111882 a E.L.

Tutti i protocolli di ricerca descritti sono stati esaminati dalla University of Chicago Institutional Review Board (IRB). Il consenso informato è stato ottenuto da ogni paziente prima dell&#39;intervento chirurgico e lo studio è stato approvato dalla University of Chicago IRB. Un tipo cappa di sicurezza biologica 2 e guanti devono essere utilizzate per la manipolazione dei tessuti umani per la protezione e per ridurre il rischio di contaminazione delle cellule. 1. Isolamento e la coltura di cellule stromali primarie non trasformati <ol><li> Collezione tessuti umani e di preparazione. <ol><li> Ottenere esemplari di omento umana, 2 cm 3, rimossi durante un intervento chirurgico addominale, e immergere subito tessuto RT tampone fosfato salino (PBS) (Figura 2A). Un pezzo di omento 3 cm x 2 cm produce tipicamente 1 milione di cellule primarie umane mesoteliali (HPMC) e 200.000 fibroblasti umani primari o fibroblasti omentali normali (NOF). </li><li> Centrifugare il PBS il tessuto è stato immerso in a 0,5 xg per 3min più presto possibile dopo la raccolta (&lt;2 ore in PBS) e trasferire il tessuto fresco 20 ml PBS in una provetta conica da 50 ml. Tagliare il tessuto in 5mm 3 pezzi da tritare con bisturi in un diametro di 15 centimetri, piatto di coltura sterile (Figura 2B). </li></ol></li><li> Primaria mesothelial umano isolamento delle cellule 8 <ol><li> Per isolare HPMC, trasferire il tessuto tritato in 50 ml provette coniche e attendere 1 minuto per i pezzi solidi di galleggiare verso l&#39;alto (Figura 2C &amp; S). HPMC e globuli rossi (RBC) saranno presenti nel liquido sul fondo. Utilizzare una pipetta per rimuovere il liquido dal fondo della provetta e in un nuovo tubo conico. Spin il liquido verso il basso a 0,5 xg per 3 min e aspirare il surnatante dal pellet HPMC / RBC. <ol><li> Ripetere il processo per tre volte: aggiungere 20 ml di PBS al tessuto tritato, permettono il tessuto a salire, rimuovere il liquido dal basso con una pipetta e nella provetta HPMC / RBC, spin down, e rimuovere ilsurnatante. Dopo che tutti i giri sono stati completati e il surnatante viene aspirato, il pellet conterrà HPMC e RBC. </li></ol></li><li> Piatto tutte le cellule del pellet in un pallone 75 cm 2 in 15 ml di terreni di crescita completo (DMEM con 10% di siero fetale bovino [FBS], 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% di acidi MEM amminoacidi non essenziali [81.4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]). </li><li> Eseguire un lavaggio secondario PBS per isolare HPMCs supplementari. <ol><li> Per la PBS secondario lavare, scuotere il tessuto solido residuo a 200 rpm, 37 ° C per 10 minuti in 20 ml di PBS, quindi attendere 1 minuto per il tessuto di galleggiare verso l&#39;alto. Rimuovere il liquido dal fondo della provetta in un nuovo tubo, centrifugare a 0,5 xg per 3 min, e aspirare il surnatante. </li><li> Piatto tutto il HPMC / RBC dal PBS secondario lavare in un pallone di 75 cm separata 2 in 15 ml di terreni di crescita completa. </li></ol></li><li> Per isolare ogni rNumero residua HPMC, agitare il tessuto macinata a 200 rpm, 37 ° C ° per 10 min a 20 ml di una miscela 1: 1 0,25% tripsina mM EDTA 25: soluzione PBS in volume. Lasciare il tessuto a salire, raccogliere il liquido sul fondo della provetta in un nuovo tubo 50 ml, e spin giù a 0.5 gx 3 min. <ol><li> Aspirare il surnatante e piastra tutto il HPMC / RBC in un pallone di 75 cm 2 separata in 15 ml di terreni di crescita completa. </li></ol></li><li> Cultura le cellule piastrate a 37 ° C e 5% CO 2 in un ambiente umidificato. Mangimi cellule placcato con l&#39;aggiunta di 15 ml di media piena crescita nei giorni 3 e 5 senza rimuovere i media spesi. HPMC può essere coltivato per 5-7 giorni prima della scissione. <ol><li> Utilizzare a basso passaggio HPMC (fino a passaggio 2) in tutti gli esperimenti per ridurre al minimo dedifferenziazione e la modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo, preferibilmente con un obiettivo 20x con funzionalità di contrasto interferenza differenziali plastica o obiettivo 4-20x con capabilitie contrasto di fases (filtri di contrasto di fase sul microscopio) per l&#39;adozione di tutte le immagini delle cellule, e un obiettivo 10x () in campo chiaro per analizzare immunoistochimica 3,3&#39;-diaminobenzidina (DAB) colorazione. </li></ol></li><li> Verificare che il HPMC sono cubica ed esprimere citocheratina 8 e vimentina eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3A, C, E). </li></ol></li><li> NOF isolamento 8 <ol><li> Preparare 10 ml di uno stock di soluzione di tipo collagenasi III (10x) mediante la combinazione di un 1: 1: 1 miscela di 100x Pen-Strep: 1.500 unità di attività / ml di collagenasi di tipo III: attività 714 unità / ml di ialuronidasi in PBS. </li><li> Agitare il tessuto omento macinata, che rimane dopo l&#39;isolamento HPMC a 200 rpm, 37 ° C per 6 ore in 10 ml di soluzione di 10x collagenasi tipo III diluito nei media senza siero (DMEM con 1% vitamine MEM [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi non essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]). Tessuto digerito sarà opaco e potrebbe avere alcuni detriti fibroso (Figura 2E). </li><li> Centrifugare le cellule NOF soluzione contenente in sospensione a 0,5 xg per 3 min a RT, aspirare il supernatante e piastra il pellet in un pallone 75 cm 2 in 13 ml di terreni di crescita completa. </li><li> Rimuovere vecchi media e sostituirlo con 15 ml di fresco terreni di crescita completo dopo 24 ore. NOF può essere coltivato per 1-3 giorni prima della scissione. Nota proliferazione del NOF cesserà quando le cellule raggiungono confluenza. </li><li> Confermare che i fibroblasti umani primari sono, cellule allungate piatte ed esprimono vimentina, ma non citocheratina 8 eseguendo immunoistochimica 8 (figura 3B, D, F). Utilizzare a basso passaggio NOF per esperimenti (idealmente prima del passaggio 3) per ridurre al minimo dedifferentiation e modifica di fenotipo originale. Utilizzare un microscopio a grande campo con un obiettivo 20x con funzionalità di plastica DIC dell&#39;adozione di tutte le immagini in fase di cellule,e un obiettivo 10x in campo chiaro per analizzare immunoistochimica DAB colorazione. </li></ol></li></ol> 2. Placcatura Cultura organotipica 8 <ol><li> NOF uscita dal pallone di coltura 75 cm da risciacquo con 10 ml di PBS seguita da 3 ml di 0,25% / 25 mM EDTA tripsina per non più di 5 min. Neutralizzare tripsina con almeno 3 volte il volume del terreno di coltura completo. </li><li> Trasferire le cellule trypsinized in una provetta da 50 ml e spin down a 0.5 gx 3 min. Rimuovere il surnatante e portare le cellule back up in 5 ml di media piena crescita. Utilizzare un contatore di cellule per contare le cellule recuperate dal pallone di coltura. </li><li> Diluire le cellule nel volume appropriato di supporto piena crescita al piatto 2.000-4.000 NOF per 100 microlitri su un piatto nero, chiaro a fondo, 96 pozzetti. Aggiungere 0,5 mg / 100 ml di coda di topo collagene I alla miscela cella prima placcatura. Let cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 4 ore, o fino a quando le cellulead aderire alla superficie della piastra. </li><li> Rilasciare HPMC dal pallone di coltura usando gli stessi metodi descritti in fasi 2.1 e 2.2. Diluire le cellule nella quantità appropriata di terreni di crescita completo alla tavola 10.000-20.000 HPMC per 50 microlitri in cima al NOF già placcato con collagene I in piastre da 96 pozzetti. Lasciare le cellule siedono a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per almeno 18 ore prima di iniziare esperimenti. </li><li> La proteina fluorescente verde Cultura (GFP) esprimente le cellule tumorali dell&#39;ovaio HeyA8 nei media piena crescita. Le cellule tumorali dell&#39;ovaio HeyA8 sono fluorescente da espressione di un vettore lentivirale che esprime copepodi cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). Le cellule tumorali dell&#39;ovaio HeyA8 dovrebbe essere 80-90% confluenti il ​​giorno di utilizzo (fase di crescita logaritmica). Rilasciate le cellule dalla piastra di coltura e contare con le stesse modalità descritte nei passaggi 2.1-2.2 per le cellule primarie. </li><li> Consentire cellule di cancro ovarico di recuperare nei media piena crescita per 15-20 minuti a 37 ° C in untubo conico con coperchio sigillato liberamente. </li></ol> 3. Adesione saggio 8 <ol><li> Dopo il recupero, agglomerare le cellule di cancro ovarico, facendo girare per 3 min a 0,5 xg e poi rimuovere il surnatante e diluire le cellule nel volume adeguato di mezzi privi di siero per ottenere una concentrazione di 50.000 cellule / 100 microlitri. </li><li> Capovolgere le piastre a 96 pozzetti con / NOF colture organotipiche HPMC per rimuovere il supporto spesi, e aggiungere 100 ml di sospensione cellulare di cancro nei media senza siero in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 30 minuti a 4 ore. </li><li> Capovolgere la piastra a 96 pozzetti per rimuovere i media e le cellule non aderenti. Utilizzare una pipetta multicanale a bassa potenza da Dispensare attenzione e delicatezza 100 ml di soluzione in ciascuno bene, e invertire di nuovo piatto. Ripetere la PBS lavare una volta di più. </li><li> Inverti per rimuovere PBS e aggiungere 100 microlitri paraformaldeide 4% in ogni pozzetto. Lasciare la piastra a sedere per 20 min per fissare le cellule. Dopo 20 minuti, capovolgere la piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS. </li><li> Si noti che la fluorescenza totale di pozzetti possono essere segnalati o il numero di cellule può essere quantificata. Per la quantificazione, prima piastra una curva standard in duplicato utilizzando cellule HeyA8 ad una concentrazione di 1 milione di cellule / ml. <ol><li> Rendere la curva standard riducendo la velocità 1 milione di cellule, rimuovendo i media, e consentendo loro di sedersi in 1 ml di paraformaldeide 4% per 20 min. </li><li> Spin cellule di nuovo e portare fino in 1 ml di PBS (cellule raccontano per confermare 1.000.000 / concentrazione ml). Piatto 50.000, 40.000, 30.000, 20.000, 10.000, 5000, 1000, e 0 cellule in ciascun pozzetto in duplicato, e aggiungere PBS per un volume totale finale di 50 microlitri in ciascun pozzetto. </li></ol></li><li> Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di fluorescenza piatto (eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm), il ridimensionamento alti pozzi (50.000 in curva standard). Utilizzare la curva standard per calcolare il numero di cellule di cancro ovarico aderito alla organotypcultura ic in ciascun pozzetto (Figura 4A-C). </li></ol> 4. Proliferazione Assay 10 <ol><li> Dopo che le cellule tumorali dell&#39;ovaio recuperare (vedere i passi 2.5 e sopra 2.6), agglomerare le cellule facendo girare per 3 min a 0,5 xg e quindi diluire le cellule nel volume appropriato di 1% FBS supporti (DMEM con 1% FBS, 1% MEM vitamine [93 mg / L], 1% MEM aminoacidi essenziali [81,4 mg / L], 1% di penicillina streptomicina [Pen-Strep, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina]) per ottenere una concentrazione di 4.000 cellule / 150 ml. </li><li> Capovolgere la piastra a 96 pozzetti con i HPMC / NOF colture organotipiche di estrarre il supporto spesi, e aggiungere 150 ml di sospensione cellulare cancro nel 1% dei media FBS in ciascun pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 72 hr. </li><li> Fondo leggere la piastra di coltura su un lettore di piastre a fluorescenza una volta al giorno (di eccitazione = 488 nm, emissione = 528 nm) per valutare la relativa proliferazionedi cellule. Continuare il test per 96 ore, cambiando i media a 48 ore (Figura 5A-C). Fare attenzione a non disturbare la cultura quando si cambia supporto (invertendo il piatto è preferibile). </li></ol> 5. Invasione Assay 8 <ol><li> Prima di placcatura la cultura 3D, aggiungere 7,5 mg coda di topo collagene I in 200 l di PBS a 24 pozzetti inserto piastra di coltura (8 micron dimensione dei pori). Lasciate che la piastra di incubare O / N, quindi rimuovere con cautela la PBS con una pipetta immediatamente prima placcatura cultura organotipica HPMC / NOF sugli inserti collagene rivestite (step 2, sopra). </li><li> Preparare le cellule tumorali ovariche come al punto 3.1. Al piatto le cellule tumorali ovariche sulle colture organotipiche sugli inserti, utilizzare con cautela una pipetta per rimuovere l&#39;eccesso supporto dalla parte superiore degli inserti. Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare tumore ovarico in mezzi privi di siero in ciascun pozzetto. </li><li> Aggiungere 750 ml di media piena crescita nel pozzo sotto l&#39;inserto di indurre cellule del cancro invasion nelle culture organotipiche. Incubare la piastra a 37 ° C in 5% CO 2 in un ambiente umidificato per 24 ore. Nota: le cellule tumorali ovariche che invadono la cultura organotipica attraverserà l&#39;inserto e rimanere sul lato inferiore dell&#39;inserto. </li><li> Dopo 24 ore, cogliere l&#39;inserto con le pinze e brevemente sciacquarlo in un bicchiere di PBS, quindi spostare l&#39;inserto in un pozzo vuoto. Scrub parte superiore di ogni inserto con entrambi i lati di un batuffolo di cotone per un totale di 1 min. Introdurre rapidamente l&#39;inserto in un piatto contenente 750 ml 4% paraformaldeide in ogni pozzetto. Consentire ad ogni inserto di sedersi in paraformaldeide per 10 minuti prima di trasferire gli inserti nei pozzetti riempiti con 750 l di PBS. </li><li> Vedi le cellule invase (aderito e fissati al fondo di inserti) con un microscopio a 2,5x. Quando l&#39;intero pozzo è all&#39;interno del campo di vista, regolare l&#39;ingrandimento di 10x e prendere 5 immagini, uno vicino al centro e 1 in ciascun quadrante del pozzo, evitandoprendendo immagini troppo vicino ai bordi. Seguire lo stesso schema per ogni bene. </li><li> Utilizzare il programma del produttore per contare il numero di cellule in ogni immagine per ottenere un numero medio di cellule invase per campo in ogni pozzetto (Figura 6A-C) in base al loro protocollo. </li></ol>

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<li>Kishikawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+pattern+of+peritoneal+involvement+shown+by+in+vitro+and+in+vivo+ovarian+cancer+dissemination+models%5BTitle%5D)+AND+%22Invas.+Metast%22%5BJournal%5D)">Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models.</a> Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).</li>
<li>Casey, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+assay+to+measure+the+invasion+of+ovarian+carcinoma+cells+through+mesothelial+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).</li>
<li>Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+human+ovarian+tumor+cells+with+human+mesothelial+cells+grown+on+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix.</a> Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).</li>
<li>White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+modeling+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional modeling of ovarian cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+high+throughput+screening+using+a+primary+human+three-dimensional+organotypic+culture+predicts+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy.</a> Nature Comm. , (2015).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Met+overexpression+is+a+prognostic+factor+in+ovarian+cancer+and+an+effective+target+for+inhibition+of+peritoneal+dissemination+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion.</a> Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).</li>
<li>Kenny, H. A., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP-2+functions+as+an+early+response+protein+in+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis.</a> Cell cycle. 8, 683-688 (2009).</li>
<li>Sawada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+E-cadherin+promotes+ovarian+cancer+metastasis+via+alpha+5-integrin%2C+which+is+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target.</a> Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligand-independent+activation+of+c-Met+by+fibronectin+and+%CE%B1%285%29%CE%B2%281%29-integrin+regulates+ovarian+cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis.</a> Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un modello organotipica del microambiente peritoneale è stato istituito per valutare la funzione individuale e collettiva (s) di entrambi i componenti cellulari e innate del microambiente in ovarico diffusione del cancro. Sono disponibili i protocolli specifici per la placcatura e personalizzare la cultura organotipica 3D per indagare ovarico adesione delle cellule tumorali, la proliferazione e l&#39;invasione. Cellule primarie umane omentali mesothelial e fibroblasti sono stati isolati da pazienti e utilizzati in un pa...

Il cancro ovarico è la neoplasia ginecologica più mortale1. La maggior parte dei pazienti viene diagnosticata dopo che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale. Una volta che il cancro si è diffuso in tutta la cavità peritoneale, la chirurgia citoriduttiva e la chemioterapia spesso non sono un trattamento sufficiente per prevenire la recidiva del cancro e la chemioresistenza, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni inferiore al 30%. Le metastasi del cancro ovarico sono prevalentemente limitate alla cavità peritoneale e molti altri tipi di cancro, tra cui i tumori gastrici, pancreatici e del colon, metastatizzano negli stessi siti anatomici nella cavità peritoneale. In generale, le cellule del cancro ovarico si staccano dal carcinoma in situ nelle tube di Falloppio o nel tumore ovarico primario, viaggiano nel liquido peritoneale come cellule singole o sferoidi e si attaccano alle superfici rivestite di mesotelio dell'omento, dell'intestino e della parete addominale2. 
Il microambiente tumorale svolge un ruolo importante nella progressione della malattia e nella chemioresistenza in molti tumori3-6. La cavità peritoneale è un microambiente unico, con un monostrato di cellule mesoteliali che copre la maggior parte delle superfici (Figura 1A)7. Il rivestimento mesoteliale funge da barriera che crea una superficie a basso attrito, che tende ad essere protettiva contro l'adesione delle cellule tumorali8. Immediatamente sotto questa superficie rivestita di mesoteliale c'è uno strato costituito prevalentemente da fibroblasti e matrice extracellulare (ECM), che promuovono l'adesione e l'invasione delle cellule tumorali8. Le cellule tumorali ovariche secernono fattori che inducono cambiamenti nel rivestimento delle cellule mesoteliali che migliorano l'adesione, l'invasione e le metastasi delle cellule tumorali ovariche9,10. Le cellule tumorali ovariche aderiscono alla superficie mesoteliale tramite integrina e meccanismi mediati da CD44 (Figura 1B)11-16. 
Storicamente, sono stati sviluppati diversi modelli 3D per studiare le interazioni del cancro ovarico con il microambiente. Alcuni dei primi modelli hanno studiato l'interfaccia cancro ovarico-ECM17-21, la comunicazione cancro ovarico-cellule mesoteliali13,14,21-24, o entrambi25 (rivisti da noi 26). Niedbala et al. ha scoperto che le cellule tumorali ovariche mostrano un'adesione più rapida e salda alla ECM rispetto alle cellule mesoteliali o alla sola plastica25. Tuttavia, questi modelli non assomigliavano istologicamente al microambiente peritoneale. Pertanto, abbiamo stabilito un modello organotipico 3D per replicare più accuratamente il microambiente del cancro ovarico. Al fine di comprendere meglio il ruolo del microambiente e l'interazione tra cancro e cellule peritoneali nella disseminazione peritoneale del carcinoma ovarico, abbiamo sviluppato un modello di coltura in vitro organotipico 3D del rivestimento della cavità peritoneale (schema in Figura 1C). Il modello proposto è composto da fibroblasti umani primari e ECM, ricoperti da uno strato di cellule mesoteliali umane primarie: ogni tipo di cellula è isolato dall'omento umano. Istologicamente, questo modello assomiglia al normale rivestimento peritoneale o omentale e fornisce una superficie su cui possiamo studiare il microambiente tumorale, l'interazione tra cellule tumorali e tessuto normale e i processi di adesione, invasione e proliferazione delle cellule tumorali8.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Isolamento e coltura di cellule primarie</forti></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3001304</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba a taglio singolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di coltura da 15 cm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di vetro</td><td>?</td><td>?</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000044_3616914956</td><td></td></tr><tr><td>DMEM con L-glutammina</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>MEM Vitamine</td><td>Corning</td><td>25-020-Cl</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoacidi non essenziali</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td> a CO2 rivestito ad acqua <td>Thermo-Fisher</td><td>Forma Serie II Modello 3100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA, 1x (0,25%)</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidasi</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002592</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Palloni</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiasche 353136 T-175</td><td>BD Biosciences</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette</td><td>Rainin</td><td>P2, P10, P20, P200 e P1000</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette</td><td>Corning</td><td>Punte filtrate P2, P10, P20, P200 e P1000</td><<td></td></tr><tr><td>strong>Nome del reagente</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>2. Placcatura Contatore di cellule 3D </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>Countess</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Camera Vetrini</td><td>Invitrogen</td><td>C10313</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo I (coda di ratto)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti, fondo trasparente, BD nero</td><td> Biosciences</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Nome del reagente/ Attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>3. Saggio di adesione</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta multicanale</td><td>Eppendorf</td><td>Xplorer 300</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre</td><td>Dispositivi molecolari</td><td>Minimax</td><td></td></tr><tr><td>Nome del reagente/ Attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>5. Test di invasione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserti per colture cellulari (8um, 24 pozzetti)</td><td>BD Biosciences</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Q-tips</td><td>Microscopio</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200m</td><td></td></tr><tr><td>Cell Profiler</td><td>di pubblico dominio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 24 pozzetti</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Nome del reagente/ Attrezzatura</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>6. Anticorpi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Integrina & alfa; V&beta; 3 Anticorpi, clone LM609</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1976</td><td></td></tr><tr><td>Beta 1&nbsp;</td><td>Oncosynergy</td><td>OS2966</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 5 [CD49e]</td><td>ID Pharmingen</td><td>555615</td><td></td></tr><tr><td>Beta 4 [CD104]</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB 2058</td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione piazza precoci di cancro ovarico diffusione in una cultura organotipica della cavità peritoneale umano

Modeling the Early Steps of Ovarian Cancer Dissemination in an Organotypic Culture of the Human Peritoneal Cavity

Il modello di metastasi del cancro ovarico è notevolmente diverso da quello della maggior parte degli altri tumori epiteliali, perché raramente si diffonde ematogenamente. Invece, le cellule tumorali ovariche esfoliate dal tumore primario sono trasportate dal liquido peritoneale ai siti metastatici all'interno della cavità peritoneale. Questi siti, in particolare il peritoneo addominale e l'omento, sono organi ricoperti da una superficie rivestita di mesotelio. Per studiare i processi di disseminazione del cancro ovarico, abbiamo assemblato un complesso sistema di coltura tridimensionale che ricostruisce il rivestimento della cavità peritoneale in vitro. I fibroblasti umani primari e le cellule mesoteliali sono stati isolati dall'omento umano. I fibroblasti sono stati quindi mescolati con la matrice extracellulare e ricoperti con uno strato di cellule mesoteliali umane primarie per imitare le superfici peritoneali e omentali incontrate dalle cellule tumorali ovariche metastatizzanti. Il modello organotipico risultante è, come mostrato, utilizzato per esaminare le prime fasi della disseminazione del cancro ovarico, tra cui l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali. Questo modello è stato utilizzato in numerosi studi per studiare il ruolo del microambiente (cellulare e acellulare) nella disseminazione precoce del cancro ovarico. È stato anche adattato con successo allo screening ad alto rendimento e utilizzato per identificare e testare gli inibitori delle metastasi del cancro ovarico.

La coltura organotipica stato assemblato mescolando dapprima fibroblasti umani primari con collagene di tipo I e quindi sovrapponendo questa cultura con 5 volte il numero di cellule mesoteliali. La cultura è stata incubata per almeno 18 ore prima di cellule di cancro ovarico sono stati aggiunti per studiare l&#39;adesione, invasione o la proliferazione. Ciascun test è stato ripetuto con multiplo (n = 3-5) culture 3D ottenuti da pazienti diversi e numerosi pozzi sono stati testati in ciascuna condizione per l&#39;adesion...

Qui, presentiamo un protocollo per costruire un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale, composto da cellule mesoteliali umane primarie e fibroblasti stratificati con matrice extracellulare, come strumento per studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

The pattern of ovarian cancer metastasis is markedly different from that of most other epithelial tumors, because it rarely spreads hematogenously. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è creare un modello organotipico che imiti il microambiente peritoneale per approfondire la comprensione della biologia del cancro ovarico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del cancro ovarico, come ad esempio in che modo le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente contribuiscono alla patogenesi della malattia, e come possono essere testati potenziali inibitori di tali interazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che vengono utilizzate cellule umane primarie vere e proprie, che formano il mesotelio rivestendo le superfici della cavità peritoneale, nella co-coltura con cellule di cancro ovarico.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul carcinoma ovarico, può essere applicato anche allo studio di altri tumori che si diffondono nella cavità peritoneale, come i tumori gastrico, pancreatico e del colon. Dopo aver ottenuto un campione chirurgico umano di omento, immergere immediatamente il campione in PBS a temperatura ambiente. Entro due ore dall'immersione, trasferire l'omento in un tubo conico da 50 millilitri contenente 20 millilitri di PBS fresco; trasferire il resto de

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Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

In questo video, dimostriamo lo sviluppo di un modello tridimensionale in vitro del rivestimento della cavità peritoneale. Questa coltura organotipica può aiutare a studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione delle metastasi del cancro ovarico nel rivestimento della cavità peritoneale: un metodo per stabilire un modello 3D in vitro del rivestimento peritoneale

In questo video, stabiliamo una coltura di organi omentali ex vivo sovrapposta a cellule di cancro ovarico che esprimono GFP per studiare la colonizzazione del cancro ovarico all'interno dell'espiante omentale. Questo protocollo analizza le strutture delle cellule immunitarie all'interno dell'omento, note come macchie lattiginose che promuovono le metastasi.

Modellazione della colonizzazione cellulare del cancro ovarico dell'omento: un metodo ex vivo per stabilire la colonizzazione della macchia lattiginosa di cellule di cancro ovarico marcate in fluorescenza in espianti di omento murino

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Delineiamo un protocollo che implementa approcci sia in vivo che ex vivo per studiare la colonizzazione del cancro ovarico dei tessuti adiposi peritoneali, in particolare dell'omento. Inoltre, presentiamo un protocollo per quantificare e analizzare le strutture cellulari immunitarie nell'omento, note come macchie lattiginose, che promuovono le metastasi del adiposo peritoneale.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

Per chiarire il processo a più fasi di diffusione peritoneale del carcinoma ovarico, questo studio presenta un modello sperimentale murino di sviluppo del tumore originale e metastasi peritoneali tramite inoculazione ortotopico con queste cellule tumorali.

Modello murino sperimentale di sviluppo del tumore originale e peritoneale Metastasi<em&gt; via</em&gt; Ortotopico inoculazione con cellule dell&#39;ovaio Carcinoma

Per studiare la progressione del tumore ovarico in un modello fisiologicamente rilevanti, sferoidi multicellulari sono state coltivate in un Microdevice sotto flusso del fluido simulato. Questo modello 3D dinamica emula l'ambiente intraperitoneale con i componenti cellulari e meccanici in cui si verifica metastasi del cancro ovarico.

Modellazione Comportamento Ovarian Cancer multicellulare Spheroid in un Microdevice dinamica 3D peritoneale

Questo protocollo descrive la creazione di un modello tridimensionale (3D) ex vivo dell'interazione cellula tumorale-omento. Il modello fornisce una piattaforma per chiarire i meccanismi pro-tumorali all'interno della nicchia adiposa e per testare nuove terapie.

Un modello ex vivo di metastasi peritoneali del carcinoma ovarico con omento umano

Questo protocollo descrive in dettaglio lo sviluppo di modelli murini di carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) in vitro e in vivo. Dalla derivazione di organoidi murini delle tube di Falloppio, alla loro modificazione genetica per ricapitolare la genetica umana HGSOC e alla loro introduzione nella borsa ovarica di topi singenici per lo sviluppo in vivo di tumori.

Sviluppo di linee organoidi derivate da topi da cellule epiteliali delle tube di Falloppio per la modellazione del carcinoma ovarico sieroso di alto grado

Scopri come creare un modello organotipico tridimensionale della cavità peritoneale umana utilizzando cellule mesoteliari primarie e fibroblasti. Questo metodo permette di studiare l'adesione, l'invasione e la proliferazione delle cellule tumorali ovariche.

Modellazione Piazza precoci di cancro ovarico Diffusione in una cultura Organotipica della Cavità peritoneale umano

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