Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

L'obiettivo generale di questo esperimento è seguire in tempo reale i processi enzimatici mediante risonanza magnetica nucleare potenziata da polarizzazione nucleare dinamica. La risonanza magnetica in stato liquido potenziata dalla polarizzazione nucleare dinamica, DNP, può contribuire a rispondere a domande fondamentali: come determinare, ad esempio, le velocità di trasformazione enzimatica di una coppia di molecole in una cellula o in vivo senza dover modificare in alcun modo questa coppia di molecole. L'installazione del nostro apparato DNP a dissoluzione nel laboratorio e l'arrivo del dottor Riccardo Balzan, dottorando nel laboratorio di Arnaud Comment a Losanna, rappresentano un notevole passo avanti per la nostra ricerca.

Il DNP aumenta significativamente la sensibilità degli esperimenti che possiamo eseguire sui nostri spettrometri NMR da 500 megahertz. Questo apparato DNP è stato il primo ad essere installato in Francia e vorrei sottolineare che, per rendere funzionante questo strumento, tutti i membri del nostro team NMR sono stati coinvolti; in particolare, desidero menzionare Gildas Bertho, il nostro ingegnere di ricerca, e Fatiha Kateb, la nostra maître de conférences. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la quantificazione diretta e in tempo reale del substrato e dei suoi derivati endogeni con una risoluzione temporale di pochi secondi.

Per la soluzione polarizzante, preparare due millilitri di una soluzione di piruvato di sodio marcata con carbonio 13, 1,12 molare, drogata con 33 millimolari di radicale TEMPO in un rapporto di volume due a uno di acqua deuterata su etanolo deuterato per osservazioni del carbonio 13. Ridurre la temperatura del criostato per la polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, mediante la procedura di raffreddamento cliccando sul pulsante di raffreddamento nell'interfaccia software del criostato. Raccogliere l'elio liquido nel criostato DNP attraverso la procedura di riempimento.

Fare clic sul pulsante di riempimento nell'interfaccia software del criostato. Quindi posizionare 300 microlitri della soluzione polarizzante ottimizzata nel contenitore del campione fornito con il polarizzatore DNP. Congelare il contenitore del campione con il campione al suo interno immergendolo delicatamente in un bagno di azoto liquido.

Eliminare l'azoto liquido che potrebbe essere presente nel contenitore del campione dopo la procedura di congelamento, estraendo il contenitore del campione dal bagno di azoto liquido e ruotandolo a testa in giù. Successivamente, inserire il campione nel criostato inserendo prima il contenitore del campione nel portacampione. Quindi posizionare il portacampione nell'inserzione principale del criostato prima di inserire la guida d'onda del microonde nel portacampione.

Abbassare la temperatura del criostato avviando la procedura di raffreddamento a un Kelvin. Fare clic sul pulsante di raffreddamento a un Kelvin nell'interfaccia software del criostato. Accendere la sorgente di microonde e irradiare il campione cliccando sul pulsante delle microonde nell'interfaccia software del criostato.

Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della consolle NMR dalla bobina dello spettrometro ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi ed estraendolo. Collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina NMR del criostato. Inserire quindi il connettore maschio del cavo della consolle NMR nel connettore femmina della bobina NMR del criostato, prestando attenzione al perno di orientamento.

Spingere con fermezza e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Misurare il segnale termico NMR allo stato solido nel sito del criostato utilizzando una semplice sequenza di tipo pulse-acquire con impulsi a basso angolo di ribaltamento non calibrati, ripetuti a intervalli di t pari a cinque minuti. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere invio sulla tastiera.

Dopo aver avviato la procedura di polarizzazione, misurare il segnale NMR potenziato tramite DNP nello stato solido utilizzando lo stesso procedimento e le stesse condizioni impiegate per la misurazione del segnale termico. Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della consolle NMR dalla bobina NMR del criostato ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi ed estraendolo. Successivamente, collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina dello spettrometro.

Inserire il connettore maschio del cavo della console NMR nel connettore femmina della bobina dello spettrometro, prestando attenzione al perno di orientamento. Spingere con fermezza e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Preparare al momento una soluzione di LDH da muscolo di coniglio a un'unità per millilitro in tampone di reazione contenente 20 microgrammi per millilitro di albumina sierica bovina.

Successivamente, mescolare 478 microlitri di tampone di reazione, 2 microlitri di soluzione di LDH e 20 microlitri di acqua deuterata per consentire la stabilizzazione del campo dello spettrometro, o il bloccaggio. Quindi, trasferire il volume di soluzione di 500 microlitri in una provetta NMR da 5 millimetri. Collegare il tubo di trasferimento a un dispositivo di iniezione automatico su misura che separa la soluzione iperpolarizzata dal gas elio utilizzato per il trasferimento.

Il dispositivo eroga automaticamente 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata nel tubo del campione. Prima della dissoluzione, posizionare il tubo NMR da cinque millimetri contenente 500 microlitri di campione al centro isocentrico dello spettrometro NMR da 11,74 tesla. Inserire 5 millilitri di acqua deuterata nel bollitore dell'inserto di dissoluzione.

Pressurizzare e riscaldare l'acqua deuterata mediante il filo resistivo fino a raggiungere una temperatura di circa 180-200 gradi Celsius, cliccando sul pulsante "prepare heater" nell'interfaccia software del criostato. Cliccare sul pulsante "SS Operations" nell'interfaccia software del criostato. Successivamente, rimuovere la guida a microonde dall'inserzione di dissoluzione.

Fare scivolare l'inserto di dissoluzione all'interno del portacampioni. L'inserto di dissoluzione deve raggiungere il fondo del portacampioni e deve essere spinto con fermezza per creare un collegamento ermetico con il contenitore del campione, evitando così che l'acqua deuterata fuoriesca nel criostato. Premere il pulsante hardware per avviare la sequenza di dissoluzione, una sequenza temporizzata predeterminata di operazioni delle valvole pneumatiche.

Subito dopo la dissoluzione, il dispositivo di iniezione mescola 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata con il campione posizionato nello spettrometro NMR. Dopo la dissoluzione, misurare il segnale NMR iperpolarizzato del campione nello spettrometro mediante una serie di sequenze impulso-acquisizione con angolo di ribaltamento di 10 gradi, intervallate da 1,5 secondi, per seguire l'andamento della magnetizzazione del substrato e del prodotto. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere invio.

Una volta che la magnetizzazione si è completamente rilassata, misurare il segnale termico NMR mediante una serie di sequenze impulso-acquisizione con angolo di ribaltamento di 90 gradi, separate da circa tre minuti, corrispondenti a circa 3T1. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere il tasto invio. Qui, l'andamento temporale degli spettri ottenuti da ripetuti impulsi con angolo di ribaltamento di 10 gradi mostra la sensibilità e la risoluzione temporale della tecnica.

Dopo l'identificazione del picco del substrato piruvato e del prodotto lattato, la quantificazione viene effettuata mediante integrazione del segnale dei metaboliti. L'attività enzimatica è determinata dal profilo temporale del segnale del prodotto, adattandolo a un modello lineare. Per convalidare la misurazione, la stessa quantità viene valutata mediante la velocità iniziale della reazione, calcolata dal rapporto tra i segnali del prodotto e del substrato.

Una volta acquisita padronanza, un'analisi completa dell'attività enzimatica può essere eseguita in circa due ore, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di comprendere come produrre un substrato altamente polarizzato per NMR, iniettarlo in una soluzione contenente un enzima e seguire l'attività enzimatica mediante NMR potenziata da DNP. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale preparare con attenzione la soluzione enzimatica utilizzando enzima e cosubstrati freschi ed evitare la formazione di bolle d'aria nel tubo del campione.

Con lo sviluppo della risonanza magnetica potenziata da DNP nello stato liquido, i ricercatori possono ora esplorare l'assorbimento del substrato e la sua trasformazione enzimatica all'interno di vari tipi di cellule misurando la velocità di formazione del prodotto. Non dimenticare che lavorare con apparecchiature criogeniche e campi magnetici elevati può essere estremamente pericoloso. Precauzioni, come indossare dispositivi di protezione personale contro i criogeni e verificare l'assenza di oggetti magnetici, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di queste misurazioni.

A differenza della NMR classica, la NMR basata su DNP con dissoluzione è limitata a una finestra temporale sperimentale di pochi minuti al massimo, a seconda del substrato e dello stato fisiologico attuale. Ciò ostacola l'approccio oltre la spettroscopia monodimensionale. La NMR con DNP e dissoluzione necessita di ulteriori sviluppi per raggiungere il livello di versatilità della NMR classica multi-dimensionale.