Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di seguire i processi enzimatici in tempo reale mediante la polarizzazione nucleare dinamica, la risonanza magnetica nucleare potenziata. La risonanza magnetica allo stato liquido potenziata dalla polarizzazione nucleare dinamica, DNP, può aiutare a rispondere a domande chiave: come determinare, ad esempio, i tassi di trasformazione enzimatica di una coppia di molecole in cellula o in vivo senza dover alterare in alcun modo questa coppia di molecole. L'installazione della nostra apparecchiatura DNP di dissoluzione nel nostro laboratorio e l'arrivo qui del Dr.Riccardo Balzan, PhD presso il Laboratorio Arnaud Comment di Losanna, è un grande passo avanti per la nostra ricerca.

Il DNP aumenta significativamente la sensibilità degli esperimenti che possiamo eseguire sui nostri spettrometri NMR da 500 megahertz. Questa apparecchiatura DNP è stata la prima ad essere installata in Francia e vorrei ricordare che, per rendere funzionale questa apparecchiatura, sono stati coinvolti tutti i membri del nostro team NMR e vorrei menzionare in particolare Gildas Bertho, il nostro ingegnere di ricerca, e Fatiha Kateb, il nostro maître de conferences. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la quantificazione diretta e in tempo reale del substrato e dei suoi derivati endogeni con una risoluzione temporale di secondi.

Per la soluzione polarizzante, preparare due millilitri di una soluzione di piruvato di sodio marcato con carbonio 13 a 1,12 molari, drogata con 33 millimolari di radicale TEMPO in un volume di due a uno di acqua deuterata in etanolo deuterato per le osservazioni del carbonio 13. Abbassare la temperatura del criostato a polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, attraverso la procedura di raffreddamento facendo clic sul pulsante di raffreddamento sull'interfaccia del software del criostato. Raccogliere l'elio liquido nel criostato DNP attraverso la procedura di riempimento.

Fare clic sul pulsante di riempimento sull'interfaccia del software del criostato. Quindi inserire 300 microlitri della soluzione polarizzante ottimizzata nel contenitore del campione fornito con il polarizzatore DNP. Congelare il contenitore del campione con il campione all'interno immergendolo delicatamente in un bagno di azoto liquido.

Eliminare l'azoto liquido che può essere presente nel contenitore del campione dopo la procedura di congelamento estraendo il contenitore del campione dal bagno di azoto liquido e ruotandolo a testa in giù. Successivamente, inserire il campione nel criostato inserendo prima il contenitore del campione nel portacampioni. Quindi posizionare il portacampione nell'inserto principale del criostato prima di inserire la guida d'onda del microonde nel portacampioni.

Abbassare la temperatura del criostato avviando la procedura di raffreddamento one Kelvin. Fare clic sul pulsante di raffreddamento Kelvin sull'interfaccia del software del criostato. Accendere la sorgente a microonde e irradiare il campione facendo clic sul pulsante microonde sull'interfaccia del software del criostato.

Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della console NMR dalla bobina dello spettrometro ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi e tirandolo. Collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina NMR del criostato. Quindi inserire il connettore maschio del cavo della console NMR nel connettore femmina della bobina NMR del criostato, prestando attenzione al pin di orientamento.

Spingere con decisione e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Misurare il segnale termico NMR allo stato solido nel sito del criostato utilizzando una semplice sequenza di acquisizione di impulsi con impulsi non calibrati e a basso angolo di inversione ripetuti a un intervallo di t uguale a cinque minuti. Dopo aver impostato la misurazione, scrivere zg nella riga di comando del software e premere invio sulla tastiera.

Dopo aver avviato la procedura di polarizzazione, misurare il segnale NMR potenziato DNP allo stato solido con la stessa procedura e le stesse condizioni utilizzate per la misurazione del segnale termico. Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della console NMR dalla bobina NMR del criostato ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi e tirandolo. Quindi collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina dello spettrometro.

Inserire il connettore maschio del cavo della console NMR nel connettore femmina della bobina dello spettrometro, prestando attenzione al pin di orientamento. Spingere con decisione e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Preparare di fresco una soluzione di LDH muscolare di coniglio a un'unità per millilitro in tampone di reazione con 20 microgrammi per millilitro di albumina sierica bovina.

Quindi mescolare 478 microlitri di tampone di reazione, 2 microlitri di soluzione LDH e 20 microlitri di acqua deuterata per consentire la stabilizzazione del campo dello spettrometro o il blocco. Quindi posizionare il volume di soluzione da 500 microlitri in una provetta NMR da 5 millimetri. Collegare il tubo di trasferimento a un dispositivo di iniezione automatizzato e personalizzato che separa la soluzione iperpolarizzata dal gas elio utilizzato per il trasferimento.

Il dispositivo eroga automaticamente 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata nella provetta del campione. Prima della dissoluzione, posizionare la provetta NMR da cinque millimetri contenente 500 microlitri di campione nell'isocentro dello spettrometro NMR da 11,74 tesla. Inserire 5 millilitri di acqua deuterata nell'inserto di dissoluzione della caldaia.

Pressurizzare e riscaldare l'acqua deuterata per mezzo del filo resistivo fino a raggiungere una temperatura di circa 180-200 gradi Celsius facendo clic sul pulsante di preparazione del riscaldatore sull'interfaccia del software del criostato. Fare clic sul pulsante Operazioni SS sull'interfaccia del software del criostato. Quindi rimuovere la guida del microonde dall'inserto di dissoluzione.

Far scorrere l'inserto di dissoluzione verso il basso nel portacampioni. L'inserto di dissoluzione deve raggiungere il fondo del portacampioni e deve essere spinto con decisione per stabilire un collegamento a tenuta stagna con il contenitore del campione per evitare che l'acqua deuterata penetri nel criostato. Premere il grilletto dell'hardware per iniziare la sequenza di dissoluzione, una sequenza temporizzata predeterminata di operazioni delle valvole pneumatiche.

Subito dopo la dissoluzione, il dispositivo di iniezione mescola 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata con il campione inserito nello spettrometro NMR. Dopo la dissoluzione, misurare il segnale iperpolarizzato NMR dal campione nello spettrometro con una serie di sequenze di acquisizione di impulsi con angolo di inversione di 10 gradi distanziate di 1,5 secondi per seguire la progressione della magnetizzazione del substrato e del prodotto. Dopo aver impostato la misurazione, scrivere zg nella riga di comando del software e premere invio.

Una volta che la magnetizzazione è completamente rilassata, misurare il segnale termico NMR con una serie di sequenze di acquisizione di impulsi con angolo di inversione di 90 gradi distanziate di circa tre minuti, corrispondenti a circa 3T1. Dopo aver impostato la misurazione, scrivere zg nella riga di comando del software e premere il tasto Invio. Qui l'andamento temporale degli spettri ottenuti da impulsi ripetuti con angolo di inversione di 10 gradi mostra la sensibilità e la risoluzione temporale della tecnica.

Dopo l'identificazione del picco del substrato del piruvato e del prodotto lattato, la quantificazione viene eseguita attraverso l'integrazione del segnale dei metaboliti. L'attività enzimatica è determinata dall'andamento temporale del segnale del prodotto mediante l'adattamento con un modello lineare. Per convalidare la misura, la stessa quantità viene valutata dalla velocità di reazione iniziale, dal rapporto tra i segnali del prodotto e del substrato.

Una volta padroneggiata, una misurazione completa dell'attività enzimatica può essere eseguita in circa due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come produrre un substrato altamente polarizzato per NMR, iniettarlo in una soluzione contenente un enzima e seguire l'attività enzimatica utilizzando NMR potenziato con DNP. Quando si tenta questa procedura, è importante preparare accuratamente la soluzione enzimatica con enzima fresco e cosubstrati ed evitare bolle d'aria nella provetta del campione.

Con lo sviluppo della risonanza magnetica potenziata del DNP allo stato liquido, i ricercatori possono ora esplorare l'assorbimento del substrato e la sua trasformazione enzimatica all'interno di vari tipi di cellule misurando il tasso di formazione del prodotto. Non dimenticare che lavorare con apparecchiature criogeniche e campi magnetici elevati può essere estremamente pericoloso. Durante l'esecuzione di queste misurazioni è necessario adottare sempre precauzioni, come indossare protezioni personali contro i criogeni e verificare l'assenza di oggetti magnetici.

A differenza della NMR classica, la NMR basata sulla DNP di dissoluzione è limitata a una finestra temporale sperimentale di minuti al massimo, a seconda del substrato e dello stato attuale di vita. Questo ostacola il superamento di una spettroscopia D. Dissoluzione DNP NMR necessita di sviluppo per portarlo al livello di versatilità della classica NMR multidimensionale.