Name: Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri la polarizzazione dinamica nucleare per studiare processi enzimatici in tempo reale mediante risonanza magnetica nucleare. Questa tecnica aumenta la sensibilità degli esperimenti su spettrometri NMR a 500 MHz.

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Gli autori ringraziano Dr JJ van der Klink per l&#39;assistenza nella scelta e montaggio delle attrezzature, così come Dr F. Kateb e il dottor G. Bertho per le discussioni utili. AC è stato sostenuto dal National Science Foundation svizzero (Grant PPOOP2_157547). Noi riconosciamo il finanziamento da Parigi Sorbonne Cité (NMR @ Com, DIM Analytics, Ville de Paris, la Fondation de la Recherche Médicale (FRM ING20130526708), e il Parteneriat Hubert Curien Brancusi 32662QK. Il nostro team è parte dei programmi di Equipex Paris-en-RISONANZA e CACSICE.

NOTA: Tutte le analisi dei dati è stata effettuata utilizzando il software commerciale. 1. Preparare la soluzione polarizzante <ol><li> Preparare 2 ml di piruvato di sodio 1,12 M 13 C-marcato (Na + [CH 3 COO -CO- 13] -, substrato) soluzione drogato con 33 mM di TEMPOL radicale (4-idrossi-2,2,6,6 tetrametilpiperidin-1-oxyl, agente polarizzante) 4 a 2: 1 d 2 O / d 6 -etanolo per 13 C osservazioni. ATTENZIONE: Precauzioni d&#39;uso devono essere prese a causa della natura infiammabile del d 6 -etanolo. </li><li> Verificare che la concentrazione radicale è ottimale in termini di polarizzazione realizzato. <ol><li> Cambiare leggermente la concentrazione radicale della soluzione al punto 1.1 (ad esempio, a 30 mM o 35 mM). </li><li> Determinare iterativamente la valorizzazione a stato solido (vedi punto 3) e trovare la concentrazione radicale che porta alla valorizzazione massima. </li></ol></li></ol> 2. Polarizatione <ol><li> Abbassare la temperatura criostato DNP attraverso la procedura di ricarica. Fare clic sul pulsante &#39;Cooldown&#39; sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). </li><li> Raccogliere elio liquido nel criostato DNP attraverso la procedura di riempimento. Fare clic sul pulsante &#39;riempimento&#39; sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). </li><li> Mettere 300 microlitri della soluzione polarizzante ottimizzata dal punto 1.1 nel contenitore esempio fornito con il polarizzatore DNP. Congelare il contenitore del campione con il campione all&#39;interno immergendolo delicatamente in un bagno di azoto liquido. </li><li> Eliminare l&#39;azoto liquido che può essere presente nel contenitore del campione dopo la procedura di congelamento (Passo 2.3) estraendo il contenitore del campione dal bagno azoto liquido e ruotandolo capovolto. NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere una dissoluzione completa del campione (vedi punto 5). </li><li> Inserire il campione nel criostato. NOTA: Questo Step, composto dai seguenti sotto-fase, deve essere eseguita rapidamente (cioè, in meno di 10-20 sec) per evitare che il campione dalla fusione. <ol><li> Inserire il contenitore del campione nel supporto del campione. Inserire il supporto del campione nell&#39;inserto criostato principale. Inserire la guida d&#39;onda microonde nel supporto del campione. </li></ol></li><li> Abbassare la temperatura del criostato avviando la procedura di 1 K raffreddamento. Fare clic sul pulsante &#39;1K Cooling&#39; sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). </li><li> Accendere la sorgente di microonde acceso e irradiare il campione. Fare clic sul pulsante &#39;MW-ON&#39; sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). </li></ol> 3. a stato solido NMR Misure <ol><li> Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento console NMR dalla bobina spettrometro ruotando il connettore in senso antiorario di 90 ° e tirandolo. Collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale del criostatobobina di NMR. Inserire il connettore maschio del cavo di console NMR nel connettore femmina della bobina criostato NMR, prestando attenzione al perno di orientamento; spinga saldamente e ruotare il connettore in senso orario di 90 °. </li><li> Misurare il segnale termico NMR nello stato solido al sito criostato utilizzando una semplice sequenza di impulsi-acquisiscono con un-calibrato bassi impulsi di flip-angolari ripetute ad intervalli di T = 5 min. Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software &#39;ZG&#39; e premere il tasto della tastiera &#39;Invio&#39;. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione. </li><li> Misurare il segnale NMR DNP-enhanced. Ripetere le operazioni di passaggio 3.2 dopo l&#39;inizio del processo di DNP come descritto nella Sezione 2. </li><li> Scollegare il cavo coassiale canale di rilevamento console NMR dalla bobina NMR criostato ruotando il connettore in senso antiorario di 90 ° e tirandolo. Collegare il cavo coassiale del detecanale ction al connettore coassiale della bobina spettrometro. Inserire il connettore maschio del cavo console NMR nel connettore femmina della bobina spettrometro, prestando attenzione al perno di orientamento; spinga saldamente e ruotare il connettore in senso orario di 90 °. </li></ol> 4. Ottimizzare l&#39;omogeneità del Main Magnete Field ( &#39;spessoramento&#39;) <ol><li> Posizionare nello spettrometro una provetta contenente 500 ml di miscela di prodotti in esperimenti precedenti (cioè dopo passo 6.2). </li><li> Eseguire spettrometro NMR shimming variando la corrente nelle bobine di gradiente shimming ricerca della massima &#39;bloccare&#39; segnale di deuterio. Selezionare la bobina spessoramento relativo premendo il pulsante corrispondente sulla console NMR. <ol><li> Ruotare la manopola sulla consolle NMR per determinare la direzione di rotazione che aumenta il segnale di blocco. Continuare a ruotare fino a quando il segnale raggiunge un massimo. Selezionare un&#39;altra bobina shimming e ripetere l&#39;ONU massimizzazionefino un massimo locale per tutte le bobine spessoramento si trova. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli. Al termine, rimuovere il campione usato per la chiusura. </li></ol></li></ol> 5. Scioglimento <ol><li> Inserire 5 ml di D 2 O nella caldaia inserto dissoluzione. Pressurizzare e riscaldare il D 2 O mediante il filo resistivo fino al raggiungimento T ≈ 180-200 ° C. Fare clic sul pulsante &#39;Preparare Heater&#39; sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). </li><li> Dopo il completamento della procedura di esempio di polarizzazione (per esempio dopo 3 T DNP), pressurizzare criostato leggermente sopra pressione ambiente. Fare clic sul pulsante &#39;SS&#39; Operazioni sull&#39;interfaccia software criostato (Figura 2D). Rimuovere la guida microonde dall&#39;inserto scioglimento. </li><li> Far scorrere l&#39;inserto di dissoluzione (Figura 3B) verso il basso nel supporto del campione (Figura 3A-c). L&#39;inserto di dissoluzione deve raggiungere il fondo del supporto del campione e deve essere inserito saldamente per effettuare una connessione a tenuta con il contenitore del campione per evitare D 2 O fuoriuscita nel criostato. </li><li> Premere il grilletto hardware (Figura 3C-h) per avviare la sequenza di dissoluzione, una sequenza temporizzata predeterminato di operazioni di valvole pneumatiche. </li></ol> 6. iniezione <ol><li> Prima posto dissoluzione un tubo NMR 5 mm contenente 500 microlitri del campione (ad esempio, D 2 O per <img alt="Equation13" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation13.jpg" width="29" /> Misurazione al punto 7 o LDH soluzione dal punto 8 per misure di attività enzimatica nel passaggio 9), nel isocentro dello spettrometro 11.74 T NMR (vedi punto 4). </li><li> Subito dopo la dissoluzione (Fase 5), miscelare 500 ml di soluzione iperpolarizzato con il campione posizionato nello spettrometro NMR nel passaggio 6.1. <ol><li> Iniezione manuale: raccogliere il iperpolarizzatosoluzione al termine di un lungo tubo di trasferimento 2,5 m in un bicchiere di vetro posizionato vicino al magnete spettrometro NMR. iniettare manualmente 500 ml di soluzione hyperpolarized Nella provetta NMR attraverso un sistema capillare misura. </li><li> iniezione automatica: prima del processo di dissoluzione, collegare il tubo di trasferimento ad un dispositivo di iniezione misura automatizzato che separa la soluzione iperpolarizzato dal gas elio utilizzato per il trasferimento. Il dispositivo fornisce automaticamente 500 ml di soluzione hyperpolarized nella provetta. </li></ol></li></ol> Misura NMR 7. allo stato liquido <ol><li> Dopo la dissoluzione, misurare il segnale iperpolarizzato NMR dal campione nello spettrometro da una serie di 10 ° vibrazione angolo sequenze di impulsi acquisire distanziate di 1,5 sec per seguire la progressione della magnetizzazione del substrato (A) ed il prodotto (B). Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software &#39;ZG&#39; e premere il &amp; #39; Invio &#39;tasto della tastiera. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione. </li><li> Una volta che la magnetizzazione è completamente rilassato (cioè, dopo T = 10 T 1), misurare il segnale termico NMR da una serie di 90 ° flip angle impulsi acquisire sequenze intervallate da T = 3 T 1 ≈ 3 min. Dopo aver impostato la misura, scrivere nella riga di comando del software &#39;ZG&#39; e premere il tasto della tastiera &#39;Invio&#39;. Fare riferimento al manuale di istruzioni NMR spettrometro per ulteriori dettagli sul funzionamento dello spettrometro e la configurazione di misurazione. </li></ol> 8. Preparazione di enzimi contenenti campioni (specifico per la trasformazione piruvato-to-lattato) <ol><li> Preparare il tampone di reazione con la seguente ricetta: 50 mM nicotinammide adenin dinucleotide (NADH), etilene-acido diaminetetraacetic 1 mM (EDTA), 0.1 mM ditiotreitolo (DTT) in tampone fosfato 0,1 M, pH =7.0. </li><li> Preparare una soluzione LDH muscolo coniglio 1 U / ml preparati di fresco in tampone di reazione con 20 mg / ml di albumina sierica bovina, BSA. </li><li> Mescolare 478 microlitri tampone di reazione (punto 8.1), 20 ml D 2 O per consentire la stabilizzazione campo spettrometro ( &#39;blocco&#39;) e la soluzione di LDH 2 ml (Passo 7.2). </li><li> Posizionare il volume della soluzione 500 microlitri preparata al punto 8.3 in un tubo NMR 5 mm e posizionare il tubo nello spettrometro NMR a 500 MHz. </li></ol> 9. Completare enzimatica di reazione Tasso Procedura di misurazione <ol><li> Preparare il campione di polarizzazione (Fase 1) e polarizzare esso (Fase 2). </li><li> Eseguire shimming sullo spettrometro (Fase 4) e preparare il campione enzimatico (passo 8). </li><li> Eseguire la dissoluzione (Fase 5) e l&#39;iniezione (Passaggio 6). </li><li> Misurare una serie di segnali dal campione iperpolarizzato con 10 ° vibrazione impulsi angolari acquisizioni distanziate di 1,5 sec (passo 7). Questo passaggio consente la misurazione della iperpolarizzatodecadimento del segnale e il segnale accumulo di metaboliti. </li></ol> 10. Raccordo <ol><li> Per ogni spettro acquisito nel passo 9.4, identificare i picchi corrispondenti al substrato (A) e del prodotto (B) rispettivamente e integrarli (determinare l&#39;area dei picchi). I picchi integrali danno i segnali corso del tempo di magnetizzazione (M (A, B) (t), vedi equazione 2). </li><li> Utilizzando la soluzione dell&#39;equazione (2), determina il valore di F = (R A + k eff ) Da una semplice misura esponenziale del segnale substrato integrato nel passo 10.1. </li><li> Utilizzando il valore F = (R A + k eff ) Determinato punto 10.2, determinare k eff e R B da una misura del segnale prodotto M B (t) con la funzione ottenuta integrando l&#39;equazione (2). Fare riferimento alla sezione risultati Rappresentante (Enzymatattività IC e le misurazioni metaboliche) per i dettagli sulla correzione di modellazione reazione, montaggio e RF. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non sono in competizione gli interessi finanziari

I punti critici della dissoluzione dell&#39;esperimento DNP NMR sono: (i) il livello della polarizzazione raggiunto per il substrato, che determina la concentrazione di prodotto minima necessaria per esperimenti nonché il numero di acquisizioni di segnali che possono essere eseguite e (ii) le durate della magnetizzazione, rispetto alla durata del trasferimento polarizzazione e siti di rilevamento e al tasso di substrato trasformazione. Il sistema di iniezione del setup DNP dissoluzione qui descritto consente il trasferi...

Polarizzazione nucleare dinamica (DNP), 1,2 di una tecnica progettata per migliorare la polarizzazione di spin nucleare, vale a dire, lo squilibrio tra &#39;up&#39; e &#39;down&#39; popolazioni di spin (P = [N ↑ - ↓ N] / [N + N ↑ ↓]), è stato introdotto nel 1950. Spin nucleari come 13 C possono essere polarizzati fino a P = 10 -1 in condizioni favorevoli, tipicamente ad una temperatura dell&#39;ordine di 1 K e in un campo magnetico di 3.357 T. 3,4 Una svolta per applicazioni biologiche venuto nel primi del 2000 con lo sviluppo di scioglimento DNP che consiste nello sciogliere campioni polarizzati congelati in acqua surriscaldata pur mantenendo il livello di polarizzazione nucleare ottenuto a bassa temperatura. 5 il segnale NMR allo stato liquido è aumentata di un fattore 10 3 -10 4 rispetto ai Comunetermicamente polarizzato condizioni RT NMR. Dissoluzione DNP fornisce quindi un modo per misurare biochimico velocità di reazione non invasivo in situ in tempo reale, consentendo dinamiche monitoraggio di NMR con una risoluzione temporale di 1 sec o inferiore 6 -. 10 &#39;diventato possibile rilevare analiti in concentrazioni molto basse 11. Tra i non invasivi modalità di imaging molecolare, hyperpolarized NMR è l&#39;unica tecnica che permette contemporaneamente misurare un substrato e dei suoi metaboliti in tempo reale. Dissoluzione DNP è stato ricevuto con entusiasmo in vari settori scientifici vanno da in vitro NMR per MRI clinica 12 e le applicazioni più promettenti sono legati al monitoraggio in situ del metabolismo. 13,14 Il principale limite di scioglimento DNP è che, dopo un tempo sulla dell&#39;ordine di cinque volte il tempo di rilassamento longitudinale costante T 1, la migliorata polarezazione è perduto. È quindi necessario utilizzare molecole portanti spin nucleari espongono relativamente lungo T 1. Per estendere il lasso di tempo della valorizzazione di polarizzazione, lentamente-relax stati di spin nucleari, noti come stati longevi (LLS), può essere usato 15 -. 17 LLS sono insensibili al intra-coppia di interazione dipolo-dipolo, quindi la loro tempo di rilassamento caratteristica costante, T LLS, può essere molto più lungo di T 1. 18 Una vita di magnetizzazione di decine di minuti e fino a 1 ora potrebbe quindi essere ottenuto, 19,20 e LLS sono stati proposti sia per spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) e la risonanza magnetica. 21 I punti principali che devono essere attentamente ottimizzata per studiare tassi reazione enzimatica hyperpolarized NMR sono: (i) massimizzare la polarizzazione allo stato solido e (ii) ridurre al minimo la perdita di polarizzazione durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato dalpolarizzatore allo spettrometro NMR. Questo articolo descrive l&#39;adattamento di un sistema di apparecchi e di iniezione DNP dissoluzione su misura per studiare le reazioni enzimatiche. Le caratteristiche e le prestazioni della messa a punto saranno dimostrate con il ben noto e diffuso substrato hyperpolarized [1- 13 C] piruvato. I motivi principali di questa scelta sono, in primo luogo, la sua naturale lungo 13 C tempo di rilassamento longitudinale (T 1&gt; 50 sec a campi magnetici elevati e temperature superiori a 293 K) che permette le reazioni di monitoraggio durante alcuni minuti, e, dall&#39;altro, il suo ruolo centrale nel cancro metabolismo. 13,14 Utilizzando dissoluzione DNP NMR e di un sistema di iniezione personalizzato sviluppato, l&#39;ossidazione del piruvato catalizzata dalla lattato deidrogenasi (LDH) può essere monitorato in presenza di un pool iniziale di lattato non marcato 9,22 o senza lattato non marcato aggiunto , come mostrato qui. E &#39;stato dimostrato che il segnale lattato [1- 13 C] misurato in vivo (anche in cellule) dopo l&#39;iniezione di iperpolarizzato [1- 13 C] piruvato è principalmente dovuta ad uno scambio un&#39;etichetta veloce tra piruvato e lattato piuttosto che la produzione di lattato. 6 Presentiamo qui la produzione in tempo reale [1- 13 C] lattato dal piruvato iperpolarizzato [1- 13 C] iniettato in un tubo NMR contenente LDH ma inizialmente non lattato. Descrizione del sistema Ci sono due parti principali in una configurazione di dissoluzione DNP (Figura 1): il polarizzatore DNP e spettrometro NMR. L&#39;elemento principale del polarizzatore DNP è un criostato al raffreddamento del campione a circa 1 K in un bagno di elio pompato. Il criostato è inserito in un superconduttore magnete 3,35 T e presenta una geometria che garantisce di avere il campione polarizzante all&#39;isocentro del magnete (Figura 1). All&#39;interno del criostato, il campione (a) è circondato da una bobina NMR (b), per misurare la polarizzazione buildup, contenuta in una cavità a microonde overmoded (c). L&#39;intero campione viene mantenuto a bassa temperatura in un bagno di elio pompato (d) e irradiato con microonde attraverso la guida d&#39;onda. L&#39;intero sistema è gestito da un software su misura (Figura 2D). L&#39;hardware e le attrezzature criogeniche necessari per eseguire DNP ed il successivo scioglimento sono ancora una sfida tecnologica. Un nuovo DNP criostato 23,24 è stato sviluppato e testato per determinare le sue prestazioni criogenici e poi ottimizzata per un veloce raffreddamento, l&#39;elio hold-tempo e il consumo globale di elio minimo durante il funzionamento. Il criostato è costituito da due parti. La prima parte del criostato è dewar isolamento (Figura 2A) che possono essere grossolanamente diviso in parte superiore (a) la coda, o lo spazio campione (b), e la camera a vuoto esterna (OVC) tenuti sotto alto vuoto e l&#39;alloggiamento della schermi di radiazione (c). La seconda parte del criostato è il principalesert (Figura 2B), inserito nel dewar isolante, in cui sono gestite tutte le normative di flusso. L&#39;elio liquido proveniente dal dewar memorizzazione esterno attraverso la linea di trasferimento (a), è nella prima fase condensata nel separatore (b), una camera intermedia usato sia per tenere la parte superiore del freddo criostato e rimuovere l&#39;elio evaporato durante il trasferimento. La pressione del separatore viene abbassato di pompaggio attraverso un capillare (c) avvolto intorno alla parte superiore del criostato; il flusso di elio freddo in questo capillare viene utilizzata per raffreddare i setti (d) e gli schermi di radiazione del dewar isolamento (OVC). Il campione è posto e polarizzata nello spazio campione. Lo spazio campione è collegato al separatore attraverso un altro capillare (e), avvolto intorno alla coda dell&#39;inserto criostato principale. Questo capillare può essere aperto o chiuso tramite una valvola a spillo azionato manualmente dall&#39;esterno. Per ottenere la bassa temperatura usato per il pr DNPocess, l&#39;elio liquido devono essere raccolti nello spazio campione criostato e la sua pressione abbassata alla gamma mbar. Le operazioni necessarie per il funzionamento criostato vengono eseguite tramite un sistema di pompaggio piuttosto complesso, con tre serie di pompe, monitorati e gestiti in diversi punti con strumenti elettronici e elettromeccanici (Figura 2C). Il criostato OVC deve essere pompata ad alto vuoto dal primo sistema di pompaggio. Questo sistema è composto da una pompa turbomolecolare sostenuto da una pompa rotativa (a). L&#39;elio liquido viene trasferito dal dewar di stoccaggio (b) attraverso la linea di ingresso trasferimento criostato al separatore criostato. Il separatore ha una uscita collegata alla seconda serie di pompaggio. Questo insieme è composto da una pompa a membrana / hr 35 m 3 (c). Questa linea permette di rimuovere il gas elio bollito durante il trasferimento dal dewar e durante il raffreddamento separatore. L&#39;elio liquido raccolto nel separatore può essere trasferita allo spazio campione attraverso il tappotubi Illary descritti sopra. Per trasferire elio liquido dal separatore allo spazio campione e successivamente abbassare la pressione spazio campione a mbar gamma, un terzo sistema di pompaggio composto da 250 m 3 / hr Roots pompa sostenuto da una / hr pompa rotativa 65 m 3 (d) è collegato al criostato attraverso una valvola a farfalla manuale (e). Tutte le operazioni del sistema a vuoto sono controllati e regolati da un dispositivo elettropneumatico misura (f). Tale dispositivo controlla connessioni di linea di vuoto tra il separatore criostato (g) e lo spazio campione (h) punti, il secondo sistemi di pompaggio / terzi (c, d), una bottiglia di elio compresso (i) e l&#39;esterno. La comunicazione tra (f) e l&#39;esterno passa attraverso una valvola unidirezionale (j). Il dispositivo elettro-pneumatico (f) nonché tutti i parametri di sistema e l&#39;hardware di dissoluzione sono controllati ed azionati da un dispositivo elettronico USB interfacciato misura con un comune PC. Infine tutto il sistema, attraverso l&#39;elettronicadispositivo, è gestito da un software standalone su misura (Figura 2D) in cui le operazioni rilevanti vengono lanciate attraverso un&#39;interfaccia utilizzando i tasti software. Per gestire il campione e misurare NMR segnale accumulo allo stato solido sono utilizzati una serie di inserti (Figura 3A). Per preparare il criostato per la polarizzazione, posizionare l&#39;inserto campione principale (a), nel criostato. L&#39;inserto campione principale è provvisto di una bobina NMR (b) collocato all&#39;interno di una cavità a microonde dorato overmoded. Pre-freeze substrato contenente soluzione da polarizzato (soluzione polarizzante) alla temperatura dell&#39;azoto liquido in un contenitore idoneo campione e collocarlo nella parte inferiore fine del portacampioni vetroresina (c). Far scorrere il supporto del campione nella inserto campione principale per raggiungere la isocentro magnete. Inserire la guida d&#39;onda placcato in oro (d) nel supporto del campione. La guida d&#39;onda permette microonde generato da una sorgente di microonde esterna viaggiare con perdite minime to il campione. Il software su misura per la gestione del criostato gestisce automaticamente, dopo aver fatto clic sul pulsante corrispondente interfaccia, diverse operazioni come cooldown (la temperatura criostato si abbassa vicino alla temperatura dell&#39;elio liquido), riempiendo (criostato è riempito con elio liquido ad un livello predeterminato ), un ulteriore passaggio di raffreddamento a T ≈ 1 K (bagno di elio liquido viene pompato per raggiungere la temperatura più bassa possibile), pressurizzazione (criostato è pressurizzato pressione leggermente superiore camera al P = 10-30 mbar per consentire l&#39;apertura criostato senza rischi di contaminazione del criostato aereo) e dissoluzione (procedura automatica per sciogliere il campione DNP e trasferire la soluzione risultante iperpolarizzato al sito di misura, cioè, lo spettrometro NMR). La polarizzazione viene eseguito irradiando il campione con microonde a 94 GHz (in un campo di polarizzazione B 0 </sub&gt; = 3.35 T). Un campione è considerato completamente polarizzato dopo 3 T DNP, dove T DNP è il tempo di polarizzazione accumulo. T DNP è dello stesso ordine di grandezza del tempo di rilassamento longitudinale dei nuclei bersaglio a stato solido al campo data e temperatura. In tutti gli esperimenti il campione è stato polarizzato per più di 5 T DNP. Alla fine del tempo di polarizzazione, il campione deve essere sciolto in una soluzione RT per essere utilizzato per la misurazione dell&#39;attività enzimatica. Durante il processo di dissoluzione, 5 ml di surriscaldato D 2 O dalla caldaia dell&#39;inserto di dissoluzione (Figura 3B) sono spinte da gas elio compresso (P = 6-8 bar) per raggiungere il campione DNP-enhanced e farla sciogliere. La soluzione hyperpolarized risultante viene inserito l&#39;inserto di dissoluzione del gas elio compresso attraverso l&#39;uscita inserto di dissoluzione (Figura 3C-b </sTrong&gt;), un diametro interno del tubo di trasferimento Teflon 2 mm. Il tempo necessario per il processo di dissoluzione è di 300 msec. 23 Il tempo necessario per il trasferimento del campione dal polarizzatore DNP al sito spettrometro NMR è di circa 3 sec. Il processo di dissoluzione viene effettuata usando un inserto di dissoluzione (Figura 3B). L&#39;inserto di dissoluzione è composto da un componente elettronico-pneumatico (a), un bastone in fibra di carbonio (b) contenente tubi di collegamento tra caldaia nel gruppo pneumatico e l&#39;armadietto contenitore del campione (c), che consente l&#39;accoppiamento a tenuta con il campione contenitore e indietro alla presa. Il gruppo elettro-pneumatico (Figura 3C) è utilizzato per produrre e guidare surriscaldato D 2 O attraverso il bastone fibra di carbonio per il contenitore del campione e poi estrarre la soluzione iperpolarizzato dal criostato. Il gruppo elettro-pneumatico è composto di valvole pneumatiche (a) che controllano i collegamenti tra il coelio mpressed (P = 6-8 bar) linea (b), la caldaia (c) se il D 2 O viene iniettato attraverso la valvola (d), e l&#39;uscita (e) attraverso il bastone in fibra di carbonio (f). Il sistema è completato da un G pressione, un termometro e un filo resistivo riscaldamento in caldaia (c), un trigger (h) e una scatola di connessione (i) usato per interfacciare il sistema con il dispositivo di gestione elettronica. Il criostato DNP e lo spettrometro NMR sono collegati da una linea di trasferimento, cioè, un tubo in PTFE di 2 mm di diametro interno all&#39;interno del quale la soluzione iperpolarizzato viene spinto a elio in pressione (P = 6-8 bar) quando la dissoluzione viene attivata. La sequenza di dissoluzione è composto dai seguenti operazioni: nei primi 300 msec, surriscaldato D 2 O viene spinto al contenitore del campione per sciogliere e dissolvere la soluzione congelata iperpolarizzato. Successivamente, la soluzione iperpolarizzato viene estratta dal criostato per mezzo di prespressurizzate (P = 6-8 bar) gas elio e spinto attraverso il tubo in PTFE di diametro interno di 2 mm (Figura 3C-e) al sito di misura in cui l&#39;iniezione viene eseguita con una delle procedure descritte nella Fase 6.2.1 o Passo 6.2 .2. Il secondo componente della dissoluzione configurazione DNP NMR è spettrometro NMR. Nella configurazione descritta, lo spettrometro NMR opera ad un campo B 0 = 11.7 Tesla. Una sonda NMR 5 millimetri è utilizzato per misurare il segnale iperpolarizzato dopo la dissoluzione. Lo spettrometro NMR è gestito tramite la console NMR, utilizzati sia per a stato solido e allo stato liquido misure NMR, ed il software XWinNMR ditta fornito. Una misura tipica è composta da un impulso rigido basso flip angle (sia tarato, per liquidstate o non calibrata, per misure a stato solido) seguita da acquisizioni del segnale. Le misurazioni del segnale di polarizzazione termica allo stato solido e si DNP-derivatosegnal accumulo vengono eseguite usando la bobina misura 13 C al sito del polarizzatore DNP (Figura 3ab) accoppiato allo spettrometro NMR. In questa particolare situazione lo spettrometro NMR non effettua il bloccaggio del segnale. Quando le misurazioni a stato solido sono svolte, al fine di evitare perturbazioni significative alla polarizzazione, l&#39;intervallo di tempo tra le acquisizioni dovrebbe essere abbastanza lungo, circa più di 0,5 T DNP. L&#39;enhancement a stato solido è definito come <img alt="Equation4" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation4.jpg" width="100" /> dove <img alt="Equation5" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation5.jpg" width="31" /> è il segnale iperpolarizzato (ottenuto nel passaggio 3.3) e <img alt="Equation6" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation6.jpg" width="23" /> è il segnale a stato solido (ottenuto in equilibrio termico alla temperatura dell&#39;elio liquido pompato nel passo 3.2) (Figura 4A). Questo parametro Defines la polarizzazione massima disponibile per esperimenti NMR, prima inevitabili perdite durante il trasferimento della soluzione iperpolarizzato. La misura viene eseguita con una semplice sequenza di impulsi-acquisiscono utilizzando un basso medaglia impulso angolo non calibrato. calibrazione Pulse è comunemente saltato per le misurazioni stato solido. Una procedura analoga può essere utilizzata per determinare il potenziamento del segnale iperpolarizzato nello stato liquido. In questo caso, il campione posto nel tubo spettrometrico prima dell&#39;iniezione (passo 6.2) è composto da 500 ml di D 2 O. Dopo la dissoluzione e iniezione, ci sono due parametri importanti da monitorare. Il primo è il miglioramento iperpolarizzato nel sito spettrometro NMR, <img alt="Equation7" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation7.jpg" width="95" /> (Figura 4B), dove <img alt="Equation8" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation8.jpg" width="30" /> è il segnale subito dopo l&#39;iniezione del iper<html> soluzione polarizzata (ottenuta nel passo 7.1) e <img alt="Equation9" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation9.jpg" width="20" /> è il segnale di polarizzazione termica (ottenuto nel passo 7.2). Il secondo è il tempo di rilassamento longitudinale, T 1 (Figura 4B, riquadro), associato con il substrato ed ogni prodotto metabolico (ottenuto da segnali esponenziali montaggio ottenuti nel passo 7.1). Questi due parametri definiscono la concentrazione minima del substrato necessaria per ottenere un rapporto sufficiente segnale-rumore (SNR) e la finestra di tempo disponibile per la misura delle trasformazioni metaboliche. Il rapporto tra la polarizzazione a stato solido <img alt="Equation10" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation10.jpg" width="30" /> e polarizzazione liquidstate <img alt="Equation11" src="/files/ftp_upload/53548/53548equation11.jpg" width="29" /> dà una stima delle perdite dovute alla polarizzazione relax durante il trasferimento soluzione iperpolarizzato. Un valoreation12 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 53548 / 53548equation12.jpg &quot;width =&quot; 80 &quot;/&gt; dovrebbe essere osservata in assenza di perdite di rilassamento.

<table><tbody><tr><td>Polarizzatore DNP</td><td>Vanderklink s.a.r.l (Svizzera)</td><td></td><td>Criostato e apparecchiature elettroniche per la polarizzazione dei campioni</td></tr><tr><td>Componenti del sistema del vuoto</td><td>Edwards vacuum (Francia)</td><td>Varie</td><td> configurazioni di pompaggio turbomolecolare - configurazione di pompaggio a membrana - sistema di pompaggio roots ad alta capacità - raccordi e componenti per il vuoto </td></tr><tr><td>DNP 3.35T Magnete</td><td>Bruker (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro NMR 500 MHz</td><td>Bruker (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origine 8.0</td><td>OriginLab (USA)</td><td></td><td>Software di analisi dati</td></tr><tr><td><forte>Sostanze chimiche</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIRUVATO DI SODIO-1-13C, 99 ATOM % 13C</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>490709</td><td></td></tr><tr><td>ETANOLO-D6, ANIDRO, 99,5 ATOM % D</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>186414</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 4-idrossi-TEMPO 97%</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>176141</td><td></td></tr><tr><td>ossido di deuterio</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>nicotinamide adenina dinucleotide ridotto (NADH)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)acido</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tampone fosfato, pH&nbsp;=&nbsp; 7.0</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzima LDH in&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td>L-2500</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina, BSA</td><td>Sigma Aldrich (Francia)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scioglimento dinamica nucleare polarizzazione strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

Il limite principale di indagini NMR-based è bassa sensibilità. Questo richiede lunghi tempi di acquisizione, evitando misure NMR in tempo reale delle trasformazioni metaboliche. Iperpolarizzazione tramite dissoluzione DNP aggira parte della sensibilità emette grazie alla grande magnetizzazione nucleare fuori equilibrio derivante dal trasferimento polarizzazione di spin elettrone-to-nucleo. Il segnale alto NMR ottenuto può essere utilizzato per monitorare le reazioni chimiche in tempo reale. L&#39;aspetto negativo di hyperpolarized NMR risiede nella finestra di tempo limitato disponibile per l&#39;acquisizione del segnale, che è di solito dell&#39;ordine di spin nucleare longitudinale costante di tempo di rilassamento, T 1, o, in casi favorevoli, dell&#39;ordine della costante di tempo di rilassamento associato il singoletto-stato di nuclei accoppiati, T LLS. assorbimento cellulare di molecole endogene e tassi metabolici in grado di fornire informazioni essenziali per lo sviluppo del tumore e la risposta ai farmaci. Numerosi precedenti studi NMR hyperpolarized hanno dimostrato la pertinenza di piruvato come substrato metabolico per monitorare l&#39;attività enzimatica in vivo. Questo lavoro fornisce una descrizione dettagliata della configurazione sperimentale e metodi richiesti per lo studio delle reazioni enzimatiche, in particolare il tasso piruvato-to-lattato conversione in presenza di lattato deidrogenasi (LDH), mediante NMR iperpolarizzato.

guadagni segnale NMR utilizzando dissoluzione DNP L&#39;effetto DNP consiste nel trasferimento della elevata polarizzazione degli spin elettrone spaiato, tipicamente da molecole di radicali stabili, a nuclei NMR attivi, sotto irradiazione con microonde del campione. I radicali liberi più spesso utilizzati sono TAM (OXO63) e TEMPOL. 4 procedure di polarizzazione utilizzando TEMPOL possono essere ottimizzate da &#39;polarizzazione incrociata&#39;. 25 <p cla...

Il miglioramento della sensibilità fornito dalla polarizzazione nucleare dinamica di dissoluzione (DNP) consente di seguire i processi metabolici in tempo reale tramite NMR e MRI. Vengono discusse le caratteristiche e le prestazioni di una configurazione DNP a dissoluzione dedicata, progettata per lo studio delle reazioni enzimatiche.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è seguire in tempo reale i processi enzimatici mediante risonanza magnetica nucleare potenziata da polarizzazione nucleare dinamica. La risonanza magnetica in stato liquido potenziata dalla polarizzazione nucleare dinamica, DNP, può contribuire a rispondere a domande fondamentali: come determinare, ad esempio, le velocità di trasformazione enzimatica di una coppia di molecole in una cellula o in vivo senza dover modificare in alcun modo questa coppia di molecole. L'installazione del nostro apparato DNP a dissoluzione nel laboratorio e l'arrivo del dottor Riccardo Balzan, dottorando nel laboratorio di Arnaud Comment a Losanna, rappresentano un notevole passo avanti per la nostra ricerca.Il DNP aumenta significativamente la sensibilità degli esperimenti che possiamo eseguire sui nostri spettrometri NMR da 500 megahertz. Questo apparato DNP è stato il primo ad essere installato in Francia e vorrei sottolineare che, per rendere funzionante questo strumento, tutti i membri del nostro team NMR sono stati coinvolti; in particolare, desidero menzionare Gildas Bertho, il nostro ingegnere di ricerca, e Fatiha Kateb, la nostra maître de conférences. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la quantificazione diretta e in tempo reale del substrato e dei suoi derivati endogeni con una risoluzione temporale di pochi secondi.Per la soluzione polarizzante, preparare due millilitri di una soluzione di piruvato di sodio marcata con carbonio 13, 1,12 molare, drogata con 33 millimolari di radicale TEMPO in un rapporto di volume due a uno di acqua deuterata su etanolo deuterato per osservazioni del carbonio 13. Ridurre la temperatura del criostato per la polarizzazione nucleare dinamica, o DNP, mediante la procedura di raffreddamento cliccando sul pulsante di raffreddamento nell'interfaccia software del criostato. Raccogliere l'elio liquido nel criostato DNP attraverso la procedura di riempimento.Fare clic sul pulsante di riempimento nell'interfaccia software del criostato. Quindi posizionare 300 microlitri della soluzione polarizzante ottimizzata nel contenitore del campione fornito con il polarizzatore DNP. Congelare il contenitore del campione con il campione al suo interno immergendolo delicatamente in un bagno di azoto liquido.Eliminare l'azoto liquido che potrebbe essere presente nel contenitore del campione dopo la procedura di congelamento, estraendo il contenitore del campione dal bagno di azoto liquido e ruotandolo a testa in giù. Successivamente, inserire il campione nel criostato inserendo prima il contenitore del campione nel portacampione. Quindi posizionare il portacampione nell'inserzione principale del criostato prima di inserire la guida d'onda del microonde nel portacampione.Abbassare la temperatura del criostato avviando la procedura di raffreddamento a un Kelvin. Fare clic sul pulsante di raffreddamento a un Kelvin nell'interfaccia software del criostato. Accendere la sorgente di microonde e irradiare il campione cliccando sul pulsante delle microonde nell'interfaccia software del criostato.Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della consolle NMR dalla bobina dello spettrometro ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi ed estraendolo. Collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina NMR del criostato. Inserire quindi il connettore maschio del cavo della consolle NMR nel connettore femmina della bobina NMR del criostato, prestando attenzione al perno di orientamento.Spingere con fermezza e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Misurare il segnale termico NMR allo stato solido nel sito del criostato utilizzando una semplice sequenza di tipo pulse-acquire con impulsi a basso angolo di ribaltamento non calibrati, ripetuti a intervalli di t pari a cinque minuti. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere invio sulla tastiera.Dopo aver avviato la procedura di polarizzazione, misurare il segnale NMR potenziato tramite DNP nello stato solido utilizzando lo stesso procedimento e le stesse condizioni impiegate per la misurazione del segnale termico. Scollegare il cavo coassiale del canale di rilevamento della consolle NMR dalla bobina NMR del criostato ruotando il connettore in senso antiorario di 90 gradi ed estraendolo. Successivamente, collegare il cavo coassiale del canale di rilevamento al connettore coassiale della bobina dello spettrometro.Inserire il connettore maschio del cavo della console NMR nel connettore femmina della bobina dello spettrometro, prestando attenzione al perno di orientamento. Spingere con fermezza e ruotare il connettore in senso orario di 90 gradi. Preparare al momento una soluzione di LDH da muscolo di coniglio a un'unità per millilitro in tampone di reazione contenente 20 microgrammi per millilitro di albumina sierica bovina.Successivamente, mescolare 478 microlitri di tampone di reazione, 2 microlitri di soluzione di LDH e 20 microlitri di acqua deuterata per consentire la stabilizzazione del campo dello spettrometro, o il bloccaggio. Quindi, trasferire il volume di soluzione di 500 microlitri in una provetta NMR da 5 millimetri. Collegare il tubo di trasferimento a un dispositivo di iniezione automatico su misura che separa la soluzione iperpolarizzata dal gas elio utilizzato per il trasferimento.Il dispositivo eroga automaticamente 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata nel tubo del campione. Prima della dissoluzione, posizionare il tubo NMR da cinque millimetri contenente 500 microlitri di campione al centro isocentrico dello spettrometro NMR da 11,74 tesla. Inserire 5 millilitri di acqua deuterata nel bollitore dell'inserto di dissoluzione.Pressurizzare e riscaldare l'acqua deuterata mediante il filo resistivo fino a raggiungere una temperatura di circa 180-200 gradi Celsius, cliccando sul pulsante "prepare heater" nell'interfaccia software del criostato. Cliccare sul pulsante "SS Operations" nell'interfaccia software del criostato. Successivamente, rimuovere la guida a microonde dall'inserzione di dissoluzione.Fare scivolare l'inserto di dissoluzione all'interno del portacampioni. L'inserto di dissoluzione deve raggiungere il fondo del portacampioni e deve essere spinto con fermezza per creare un collegamento ermetico con il contenitore del campione, evitando così che l'acqua deuterata fuoriesca nel criostato. Premere il pulsante hardware per avviare la sequenza di dissoluzione, una sequenza temporizzata predeterminata di operazioni delle valvole pneumatiche.Subito dopo la dissoluzione, il dispositivo di iniezione mescola 500 microlitri di soluzione iperpolarizzata con il campione posizionato nello spettrometro NMR. Dopo la dissoluzione, misurare il segnale NMR iperpolarizzato del campione nello spettrometro mediante una serie di sequenze impulso-acquisizione con angolo di ribaltamento di 10 gradi, intervallate da 1,5 secondi, per seguire l'andamento della magnetizzazione del substrato e del prodotto. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere invio.Una volta che la magnetizzazione si è completamente rilassata, misurare il segnale termico NMR mediante una serie di sequenze impulso-acquisizione con angolo di ribaltamento di 90 gradi, separate da circa tre minuti, corrispondenti a circa 3T1. Dopo aver configurato la misurazione, digitare zg nella riga di comando del software e premere il tasto invio. Qui, l'andamento temporale degli spettri ottenuti da ripetuti impulsi con angolo di ribaltamento di 10 gradi mostra la sensibilità e la risoluzione temporale della tecnica.Dopo l'identificazione del picco del substrato piruvato e del prodotto lattato, la quantificazione viene effettuata mediante integrazione del segnale dei metaboliti. L'attività enzimatica è determinata dal profilo temporale del segnale del prodotto, adattandolo a un modello lineare. Per convalidare la misurazione, la stessa quantità viene valutata mediante la velocità iniziale della reazione, calcolata dal rapporto tra i segnali del prodotto e del substrato.Una volta acquisita padronanza, un'analisi completa dell'attività enzimatica può essere eseguita in circa due ore, se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di comprendere come produrre un substrato altamente polarizzato per NMR, iniettarlo in una soluzione contenente un enzima e seguire l'attività enzimatica mediante NMR potenziata da DNP. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale preparare con attenzione la soluzione enzimatica utilizzando enzima e cosubstrati freschi ed evitare la formazione di bolle d'aria nel tubo del campione.Con lo sviluppo della risonanza magnetica potenziata da DNP nello stato liquido, i ricercatori possono ora esplorare l'assorbimento del substrato e la sua trasformazione enzimatica all'interno di vari tipi di cellule misurando la velocità di formazione del prodotto. Non dimenticare che lavorare con apparecchiature criogeniche e campi magnetici elevati può essere estremamente pericoloso. Precauzioni, come indossare dispositivi di protezione personale contro i criogeni e verificare l'assenza di oggetti magnetici, devono essere sempre adottate durante l'esecuzione di queste misurazioni.A differenza della NMR classica, la NMR basata su DNP con dissoluzione è limitata a una finestra temporale sperimentale di pochi minuti al massimo, a seconda del substrato e dello stato fisiologico attuale. Ciò ostacola l'approccio oltre la spettroscopia monodimensionale. La NMR con DNP e dissoluzione necessita di ulteriori sviluppi per raggiungere il livello di versatilità della NMR classica multi-dimensionale.

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Un fantoccio dinamico multi-compartimento viene utilizzato per simulare alcune biologie di interesse per studi metabolici utilizzando agenti di risonanza magnetica iperpolarizzata.

L&#39;uso di un multi-comparto dinamico singolo enzima Phantom per gli Studi di hyperpolarized Risonanza Magnetica Agents

Un metodo rapido di scansione EPR (RS-EPR) nuovo paramagnetica elettronica di risonanza (EPR), è dimostrata per l'imaging 2D spaziale spettrale che è superiore alla tecnica tradizionale onda continua (CW) e apre nuove sedi per l'imaging in vivo. I risultati sono dimostrati a 250 MHz, ma la tecnica è applicabile a qualsiasi frequenza.

Rapid Scan paramagnetica elettronica Risonanza apre nuove strade per l&#39;imaging Fisiologicamente parametri importanti<em&gt; In Vivo</em

La polarizzazione nucleare dinamica con successiva dissoluzione del campione ha permesso studi in tempo reale del metabolismo nei sistemi biologici. Il [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stato utilizzato per studiare l'attività della lattato deidrogenasi in una linea cellulare di carcinoma prostatico in vitro.

hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Descriviamo qui un metodo per identificare fosforilazioni multiple di una proteina intrinsecamente disordinata mediante Spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR), utilizzando la proteina Tau come caso di studio. La Tau ricombinante viene arricchita isotopicamente e modificata in vitro da una chinasi prima dell'acquisizione e dell'analisi dei dati.

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Un protocollo per la preparazione 13C,15campioni fungini e vegetali N-etichettati per spettroscopia NMR allo stato solido multidimensionale e indagini di polarizzazione nucleare dinamica (DNP) è presentato.

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

Vi presentiamo un protocollo per misurare la dipendenza del campo magnetico del tempo di rilassamento spin-reticolo di 13composti arricchiti con C, iperpolarizzati per mezzo di polarizzazione nucleare dinamica, utilizzando una rilassantesi veloce ciclabile. In particolare, lo abbiamo dimostrato con [1-13C]pyruvate, ma il protocollo potrebbe essere esteso ad altri substrati iperpolarizzati.

Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

Qui viene fornita una descrizione dettagliata del protocollo implementato in laboratorio per l'acquisizione e l'analisi di profili di dispersione di rilassamento 15N mediante spettroscopia NMR soluzione.

15 di cui: la commissione per i N CPMG Relaxation Dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è in grado di caratterizzare la dinamica strutturale delle proteine in modo specifico per i residui. Forniamo un protocollo pratico per la registrazione di esperimenti di rilassamento NMR 15N R1 e R2 e {1H}-15N heteronuclear Overhauser effect (hetNOE), sensibili alla scala temporale da picosecondi a nanosecondi.

Esperimenti di rilassamento NMR 15N per lo studio della dinamica strutturale delle proteine da picosecondi a nanosecondi

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Scopri la polarizzazione dinamica nucleare per studiare processi enzimatici in tempo reale mediante risonanza magnetica nucleare. Questa tecnica aumenta la sensibilità degli esperimenti su spettrometri NMR a 500 MHz.

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare (Video) | JoVE Journal

Scioglimento dinamica nucleare Polarizzazione Strumentazione in tempo reale enzimatica di reazione misure di frequenza di risonanza magnetica nucleare

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