Name: Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Scopri come generare delezioni monoalleliche con CRISPR/Cas9 nelle cellule staminali embrionali di topo per studiare la funzione degli enhancer. Questo metodo permette di analizzare la regolazione trascrizionale genica in modo specifico per allele.

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Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Mitchell per le utili discussioni. Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institutes of Health Research, dalla Canada Foundation for Innovation e dal Ministero della Ricerca e dell'Innovazione dell'Ontario (sovvenzioni operative e infrastrutturali detenute da JAM).

<ol><li>Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+a+long-range+cis-regulatory+module+causes+complete+loss+of+limb-specific+Shh+expression+and+truncation+of+the+mouse+limb%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb.</a> Development. 132 (4), 797-803 (2005).</li>
<li>Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+gene+control+and+genetic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range gene control and genetic disease.</a> Adv Genet. 61, 339-388 (2008).</li>
<li>Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+views+of+distant-acting+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic views of distant-acting enhancers.</a> Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).</li>
<li>Maurano, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+localization+of+common+disease-associated+variation+in+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA.</a> Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+the+cis-regulatory+sequences+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome.</a> Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).</li>
<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+identification+in+mouse+embryonic+stem+cells+using+integrative+modeling+of+chromatin+and+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features.</a> BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).</li>
<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+off-target+effects+of+CRISPR%2FCas-derived+RNA-guided+endonucleases+and+nickases%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases.</a> Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).</li>
<li>Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-scale+genome-modified+mice+using+gRNA+and+CAS9+endonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease.</a> Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).</li>
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<li>Amano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+dynamics+at+the+Shh+locus%3A+limb+bud-specific+differential+regulation+of+competence+and+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription.</a> Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+reveals+a+distal+super-enhancer+required+for+Sox2+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells.</a> PLoS One. 9 (12), e114485(2014).</li>
<li>Canver, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+genomic+deletion+efficiency+mediated+by+clustered+regularly+interspaced+palindromic+repeats+%28CRISPR%29%2FCas9+nuclease+system+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).</li>
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<li>Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+synthesis+of+the+mouse+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome.</a> Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).</li>
<li>Ding, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+efficiency+of+human+pluripotent+stem+cell+genome+editing+through+replacing+TALENs+with+CRISPRs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs.</a> Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+quantitative+PCR+for+the+analysis+of+cytokine+mRNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels.</a> Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).</li>
<li>Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+effects+of+position+and+type+of+single+mismatch+on+single+base+primer+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension.</a> J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).</li>
<li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li>
</ol>

Gli autori hanno letto le politiche di Giove sul conflitto di interessi e non hanno conflitti di rivelare.

tecnologia di editing genoma mediata CRISPR / Cas9 fornisce un metodo semplice, veloce e poco costoso per la modifica del genoma. Il metodo descritto qui per generare e analizzare l&#39;eliminazione enhancer monoallelic per la caratterizzazione funzionale potenziatore sfrutta SNPs nelle cellule di topo F1. I vantaggi di questo tipo di approccio sono: 1) le eliminazioni enhancer monoallelic non producono effetti confondenti che si verificano quando un esaltatore di critica viene eliminato da entrambi gli alleli, cioè...

Elementi regolatori trascrizionali sono fondamentali per la messa a punto spazio-temporale dell&#39;espressione genica durante lo sviluppo 1 e la modifica di questi elementi può portare a malattia a causa di espressione genica aberranti 2. Molte regioni associate alla malattia identificati da studi di associazione genome wide sono nelle regioni non codificanti e hanno caratteristiche di esaltatori trascrizionale 3-4. Identificare esaltatori e abbinandoli con i geni che regolano è complicato in quanto sono spesso trovano diversi kilobases lontano dai geni che regolano e possono essere attivati ​​in maniera tessuto-specifica 5-6. Previsioni Enhancer sono comunemente basate su segni modificazione degli istoni, complessi mediatore-cohesin e vincolante di trascrizione specifici per tipo di cellula fattori 7-10. Convalida di esaltatori previsti è più spesso fatto attraverso un saggio basato vettore in cui l&#39;enhancer attiva espressione di un gene reporter 11-12. Questi dati forniscono vinformazioni aluable circa il potenziale normativo di sequenze enhancer putativi, ma non rivelano la loro funzione nel loro contesto genomico endogena o identificare i geni che regolano. la modifica del genoma serve come un potente strumento per studiare la funzione di elementi regolatori trascrizionali nel loro contesto endogena di analisi perdita-di-funzione. I recenti progressi nella modifica del genoma, cioè il / Cas9 sistema di editing genoma CRISPR, facilitano la ricerca della funzione del genoma. Il sistema / Cas9 CRISPR è facile da usare e adattabile per molti sistemi biologici. La proteina Cas9 si rivolge ad un sito specifico nel genoma da un RNA guida (gRNA) 13. Il complesso SpCas9 / gRNA esegue la scansione del genoma per il suo obiettivo di sequenza genomica che deve essere 5 &#39;ad una sequenza protospacer motivo adiacente (PAM), NGG 14-15. appaiamento delle basi del gRNA al suo obiettivo, a 20 nucleotidi (nt) sequenza complementare al gRNA, attiva SpCas9 attività nucleasi con un conseguente Doublpausa e filamento (DSB) 3 bp a monte della sequenza PAM. Specificità è ottenuto attraverso l&#39;accoppiamento base completa nella regione seme gRNA, il 6-12 nt adiacente al PAM; Al contrario, disallineamenti 5 &#39;del seme di solito sono tollerati 16-17. La DSB introdotta può essere riparato entro la fine non omologa unirsi (NHEJ) riparazione del DNA o di omologia riparazione diretta (HDR) mechanisms.NHEJ riparazione del DNA spesso crea inserzione / delezione (indels) di pochi bp al sito di destinazione che possono disturbare l&#39;open reading frame (ORF) di un gene. Per generare delezioni grandi nel genoma due gRNAs, che fiancheggiano la regione di interesse, può essere utilizzato 18-19. Questo approccio è particolarmente utile per lo studio di esaltatori di trascrizione raggruppati in regioni di controllo locus o super-stimolatori che sono più grandi di esaltatori convenzionali 9,18,20-22. Eliminazioni monoallelic sono un modello valido per lo studio -Regolamento cis di trascrizione. Il chang osservatae nel livello di trascrizione dopo la cancellazione monoallelic di un potenziatore correlato al ruolo di detta enhancer nella regolazione genica senza gli effetti confondenti che possono verificarsi quando la trascrizione di entrambi gli alleli è influenzata potenzialmente influenzare il fitness cellulare. Valutare ridotta espressione è difficile ma senza la capacità di distinguere la eliminato dal tipo di allele selvatico. Inoltre, genotipizzazione delezioni in ogni allele senza la capacità di distinguere i due alleli è impegnativo, soprattutto per le grandi delezioni di&gt; 10 kb a 1 Mb 23 in cui è difficile per amplificare l&#39;intera regione di tipo selvatico mediante PCR. L&#39;uso di cellule ES F1 generati dal passaggio a Mus musculus 129 con Mus castaneus permette ai due alleli per essere differenziati mediante PCR allele-specifica 18,24. Il genoma ibrido in queste cellule facilita allele specifico di screening cancellazione e analisi di espressione. In media c&#39;è un SNP ogni 125 bp tra questi due genomi, Fornendo flessibilità nella progettazione di primer per l&#39;espressione e la genotipizzazione analisi. La presenza di uno SNP può influenzare la temperatura di innesco di fusione (T m) e destinazione specificità amplificazione real-time PCR quantitativa (qPCR) consentendo la discriminazione dei due alleli 25. Inoltre un disadattamento all&#39;interno all&#39;estremità 3 &#39;del primer influenza notevolmente la capacità della DNA polimerasi di estendere dal primer impedendo amplificazione del bersaglio indesiderato allele 26. Descritto nella seguente protocollo è l&#39;uso di cellule ES F1 per l&#39;allele specifico delezioni enhancer di maggiore di 1 KB e la successiva analisi di espressione utilizzando il / Cas9 sistema di editing genoma CRISPR (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53552/53552fig1.jpg" /> Figura 1. eliminazione Enhancer usando CRISPR / Cas9 per studiare cis -REGlamento di espressione genica. cellule (A) F1 ES generati da un incrocio tra Mus musculus 129 e Mus castaneus sono utilizzati per consentire l&#39;eliminazione allele specifico. (B) Due RNA guida (gRNA) vengono utilizzati per indurre una grande delezione Cas9-mediata della regione enhancer. (C) Set di primer sono utilizzati per identificare grande mono e bi-delezioni alleliche. I primer di colore arancione sono i primer all&#39;interno, i primer viola sono i primer esterni ei primer verde sono i primer fiancheggianti gRNA. (D) Le variazioni di espressione genica sono monitorati utilizzando allele-specifica qPCR. RFU denota unità di fluorescenza relativa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53552/53552fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>NEB</td><td>M0530S</td><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà utilizzata nell'assemblaggio del gRNA</td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611L</td><td></td></tr><tr><td>gRNA_Cloning Vector Addgene</td><td></td><td>41824</td><td>Una sequenza target viene clonata in questo vettore per creare il plasmide gRNA</td></tr><tr><td>pCas9_GFP</td><td>Addgene</td><td>44719</td><td>SpCas9 ottimizzato per il codone e EGFP plasmide di co-espressione</td></tr><tr><td>AflII</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System 100 &micro; L Kit</td><td>Life Technologies</td><td>MPK10096</td><td>Tecnologia di trasfezione Microporator</td></tr><tr><td>prepGEM</td><td>ZyGEM</td><td>PT10500</td><td>reagente per estrazione di DNA genomico</td></tr><tr><td>Nucleo Spin Gel & Pulizia PCR</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.5</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit plasmidico ad alta velocità</td><td>Geneaid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>Maxi Plasmid Free Endotossin&nbsp;</td><td>Geneaid</td><td>PME25</td><td></td></tr><tr><td>SYBR select mix per CFX</td><td>Life Technologies</td><td>4472942</td><td>reagente qPCR</td></tr><tr><td>Kit di sintesi iScript cDNA</td><td>Bio-rad</td><td>170-8891</td><td>Reagente a trascrizione inversa</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina con EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>PBS senza Ca/Mg2+</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Bioshop</td><td>EDT111.500</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>13630080</td><td></td></tr><tr><td>BSA frazione V (7,5%)</td><td>Life Technologies</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&alpha; celle competenti</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FBS ES qualificato</td><td></td><td>FBS è sottoposto a un test preliminare in cellule ES di topo per la pluripotenza</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11960069</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin/Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvato</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>Non essenziale aminoacido</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924</td><td></td></tr><tr><td>Nastro sigillante</td><td>Sarstedt</td><td>95.1994</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell LX</td><td>Biocision</td><td>BCS-405</td><td>contenitore per il congelamento cellulare senza alcool</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Biovision</td><td>1748-5</td><td>Inibitore per colture cellulari F1 ES</td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Invivogen</td><td>inh-pd32</td><td>Inibitore per colture cellulari F1 ES</td></tr><tr><td>LIF</td><td>Chemicon</td><td>ESG1107</td><td>Inibitore per colture cellulari F1 ES</td></tr></tbody></table>

generazione crispr / cas9 mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Gli enhancer controllano l'identità cellulare regolando l'espressione genica tessuto-specifica in modo indipendente dalla posizione e dall'orientamento. Questi potenziatori sono spesso localizzati distalmente dal gene regolato nelle regioni intergeniche o anche all'interno del corpo di un altro gene. La natura indipendente dalla posizione dell'attività dell'enhancer rende difficile abbinare gli enhancer con i geni che regolano. La delezione di una regione enhancer fornisce una prova diretta dell'attività dell'enhancer ed è il gold standard per rivelare il ruolo di un enhancer nella trascrizione genica endogena. I metodi convenzionali di delezione basati sulla ricombinazione omologa sono stati superati dai recenti progressi nella tecnologia di editing del genoma che consente modifiche rapide e localizzate con precisione ai genomi di numerosi organismi modello. L'editing genomico mediato da CRISPR/Cas9 può essere utilizzato per manipolare il genoma in molti tipi di cellule e organismi in modo rapido ed economico, grazie alla facilità con cui Cas9 può essere mirato al genoma da un RNA guida da un plasmide di espressione su misura. La delezione omozigote di elementi essenziali di regolazione genica potrebbe portare alla letalità o alterare il fenotipo cellulare, mentre la delezione monoallelica di potenziatori trascrizionali consente lo studio della cis-regolazione dell'espressione genica senza questo problema di confusione. Qui viene presentato un protocollo per la delezione mediata da CRISPR/Cas9 in cellule staminali embrionali (ES) di topo F1 (Mus musculus129 x Mus castaneus). La delezione, lo screening e l'analisi dell'espressione monoallelica sono facilitati dai polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) tra i due alleli che si verificano in media ogni 125 bp in queste cellule.

Il protocollo qui descritto utilizza cellule ES F1 per studiare -Regolamento cis dell&#39;espressione genica in cellule enhancer cancellato monoallelic generati utilizzando CRISPR / modifica del genoma Cas9 (Figura 1). Il gRNA e la progettazione di primer allele-specifica per la genotipizzazione e dell&#39;espressione genica sono i fattori chiave di questo approccio. Ogni set di primer allele-specifica deve essere convalidato da qPCR per confermare allele specif...

La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare una delezione mediata da CRISPR/Cas9 specifica per allele per studiare la regolazione della trascrizione genica nelle cellule staminali embrionali del topo. Il principale vantaggio di questa tecnica, che impiega un genoma ibrido per generare e analizzare delezioni monoallele, consiste nel fatto che elimina la necessità di analizzare delezioni potenziate monoallele che potrebbero non essere vitali.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica funzionale. Ad esempio, quale gene viene regolato da un enhancer specifico e quanto quel gene dipende da un singolo enhancer per la propria attività. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla pluripotenza delle cellule staminali, può essere applicato anche ad altri sistemi.Ad esempio, può aiutarci a comprendere come le cellule staminali modifichino il loro destino per diventare neuroni, cellule del sangue o muscolari. Dopo aver progettato, costruito e confermato la sequenza dell'RNA guida, o gRNA, da utilizzare, prepararsi a trasfettare i plasmidi privi di endotossine nelle cellule staminali embrionali. Utilizzando una centrifuga, raccogliere in pellet 1×10⁶ cellule staminali embrionali F1 generate dall'incrocio tra Mus musculus 129 e Mus castaneus in un tubo da 1,5 millilitri a 300×g per cinque minuti.Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e aggiungere 100 microlitri del tampone di risospensione fornito dal produttore del kit. Per l'eliminazione della regione di DNA bersaglio, aggiungere cinque microgrammi ciascuno dei plasmidi P Cas9 GFP 5-primo e 3-primo gRNA. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente.Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Successivamente, utilizzare la punta pipettatrice elettronica del microporatore per aspirare 100 microlitri della miscela di elettroporazione, avendo cura di non introdurre aria nella punta. Quindi, inserire la pipetta nel dispositivo di trasfezione.Selezionare il protocollo appropriato e premere avvio. Mentre l'elettroporazione è in corso, osservare la punta. Con l'impostazione corretta, dovrebbero fuoriuscire piccole bolle dall'elettrodo del tubo.Una scintilla indica la presenza di una bolla d'aria e interferirà con la trasfezione. In tal caso, l'elettroporazione deve essere ripetuta con un nuovo lotto di cellule. Dopo l'elettroporazione, espellere le cellule trasfettate in una piastra da dieci centimetri rivestita di gelatina e contenente dieci millilitri di mezzo per cellule ES.Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, utilizzare un citometro a flusso per ordinare e isolare le cellule ES positive per cast nine GFP. Successivamente, seminare da 1 a 1,5 volte 10 alla quarta cellule positive per GFP in una piastra da 10 centimetri, rivestita con gelatina e contenente 10 millilitri di mezzo per cellule ES.La semina a questa bassa densità faciliterà la selezione di singole colonie di cellule staminali embrionali. Dopo quattro o cinque giorni, utilizzare un microscopio per identificare singole colonie di cellule staminali embrionali di forma sferica. Trasferire ciascuna colonia, mediante pipetta, in una singola pozzetta di una piastra a 96 pozzette pretrattata con gelatina e contenente 30 microlitri di tripsom.Dopo aver prelevato e dissociato tutte le colonie nel mezzo, coltivare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore a biossido di carbonio fino a quando la maggior parte delle pozzette non raggiunge una confluenza superiore al 70%. Ciò richiede solitamente circa due giorni. Quando le cellule sono pronte per essere suddivise, rimuovere il mezzo e aggiungere 30 microlitri di tripsom.Incubare le cellule per cinque minuti. Successivamente, aggiungere a ciascun pozzetto 180 microlitri di mezzo per cellule ES per neutralizzare la tripsina. Aspirare e dispensare più volte per ottenere una sospensione di cellule singole.Da ogni pozzetto, trasferire 70 microlitri in ciascuna delle tre piastre a 96 pozzetti rivestite con gelatina contenenti 130 microlitri di mezzo per cellule staminali embrionali (ES) in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius. Quando le piastre raggiungono una confluenza del 70-85%, utilizzarle per eseguire il genotipaggio e l'analisi dell'espressione di ciascuna linea, come descritto nelle sezioni seguenti.Congelare le colture cellulari come descritto nel documento allegato. In questo caso, verranno progettati quattro set di primer per analizzare le linee cellulari alla ricerca della delezione desiderata. Tali primer comprendono: primer interni, primer esterni e primer adiacenti alla sequenza bersaglio della gRNA, per entrambi i siti bersaglio della gRNA in posizione 5' e 3'.Cominciare visitando il sito web mostrato qui per ottenere la traccia del polimorfismo a singolo nucleotide, o snip, corrispondente ai genotipi 129 e Cas. Questo indirizza alla pagina web CRISPR del Mitchell Lab. Lì, fare clic sul link fornito.Il sito reindirizzerà al browser del genoma UCSC contenente la traccia che visualizza le variazioni tra i genomi 129 e Cas nell'assemblaggio del genoma del topo MM-9. Successivamente, inserire le coordinate della regione da eliminare e fare clic su "go". Eseguire lo zoom su una regione di circa 500 paia di basi nel mezzo dell'eliminazione desiderata, contenente più di tre variazioni.La progettazione di primer specifici per allelo può risultare complessa se i polimorfismi sono scarsi. Se non è possibile progettare primer assolutamente specifici per l'allele, si possono utilizzare primer moderatamente specifici. Ricordarsi semplicemente di confrontare i valori di CT tra le linee cellulari con delezione e quelle senza delezione durante l'analisi dei risultati di qPCR.Ora, fare clic su Visualizza nella barra superiore. Dal menu a discesa, selezionare DNA. Verrà visualizzata la pagina Ottieni DNA nella finestra.Nelle opzioni di formattazione della sequenza, selezionare maiuscolo completo, quindi fare clic su "Ottieni DNA" per visualizzare la sequenza bersaglio in formato maiuscolo. Copiare questa sequenza e incollarla in un documento di Word. Successivamente, confrontare la sequenza con la traccia del polimorfismo 129 cast e evidenziare le posizioni del polimorfismo, contrassegnando i polimorfismi 129 con lettere minuscole.Una volta completata la sequenza 129, copiarla per creare due sequenze nel formato fast day. Una per 129 e una per Cas. Nella sequenza di cast, sostituire la base corretta in ogni posizione di taglio, indicando il taglio con una lettera minuscola.Successivamente, etichettare la sequenza con il relativo genoma, 129 o Cas. Quindi, nel browser, inserire l'indirizzo di Primer3Plus. Nell'area appropriata, incollare la sequenza 129 con la sostituzione effettuata.Utilizzare le impostazioni predefinite per progettare i primer. Per progettare i primer specifici dell'allele interni, fare clic sul menu a discesa a destra di "Task" e selezionare "Primer List", quindi fare clic su "Pick Primers". Si aprirà una nuova pagina che mostra un elenco di primer forward e reverse.Selezionare la casella per scegliere un primer diretto o inverso che abbia una snip segnata da una lettera minuscola all'estremità 3-prime o entro quattro basi dall'estremità 3-prime. Si noti che i primer con una snip all'estremità 3-prime mostrano una maggiore specificità per l'allele durante la qPCR. Fare clic su Invia al Gestore Primer3 in fondo allo schermo.Si aprirà una nuova pagina che mostra il primer selezionato. Per selezionare il secondo primer, tornare alla pagina dell'elenco dei primer e fare clic sul pulsante indietro per ritornare alla pagina principale. Nel menu a tendina dell'attività, selezionare Rilevamento.La pagina principale verrà aggiornata e apparirà in basso una casella per la sequenza del primer sinistro e una per quella del primer destro. Incollare la prima sequenza del primer nella casella appropriata. Successivamente, passare alla scheda Impostazioni generali situata accanto alla scheda Principale e modificare l'impostazione relativa all'intervallo dimensionale del prodotto da 80 a 200 paia di basi.Fare clic su "Scegli primers": verrà aperta una pagina che mostra cinque possibili coppie di primers per la prima sequenza di primer. Selezionare un set di primers dall'elenco delle coppie di primers attivando le caselle a sinistra dei primers e fare clic su "Invia al gestore Primer3" in fondo alla schermata. Questi saranno i primers specifici per l'allele interno 129.Ripetere questi passaggi per progettare primer per l'allele cast. Successivamente, applicare questa tecnica alla progettazione di primer esterni specifici per allele e primer non specifici per allele. Infine, testare la specificità dei primer per allele mediante qPCR come descritto nel documento allegato.Estrarre il DNA genomico dalla piastra a 96 pozzetti preparata in precedenza. Centrifugare brevemente la piastra per far depositare qualsiasi condensa sul fondo dei pozzetti. Questo DNA verrà utilizzato come stampo per lo screening delle delezioni.Successivamente, su una piastra a 384 pozzetti, eseguire la qPCR in duplicato per ciascun clone. Utilizzare una PCR a due passaggi seguita da un'analisi della curva di denaturazione con rilevamento. Al termine della corsa, verificare innanzitutto l'amplificazione di ciascun allele con i primer specifici per l'allele interno.Nessun amplificazione di un allele o differenze di valore CT superiori a cinque cicli tra gli alleli indicano che queste linee cellulari portano una delezione eterozigote. L'assenza di amplificazione di entrambi gli alleli indica che portano una delezione omozigote. Successivamente, verificare l'amplificazione di ciascun allele utilizzando i primer specifici per l'allele esterno.Se l'eliminazione bersaglio è superiore a un KB, l'amplificazione con primer esterni avverrà solo se è presente un'eliminazione. Un valore CT compreso tra 22 e 28 conferma l'eliminazione. Per eliminazioni bersaglio inferiori a un KB, confermare la dimensione dell'amplificone mediante elettroforesi.Una piastra a 96 pozzetti contenente cloni di delezione è stata analizzata mediante qPCR utilizzando primer interni specifici per allele. Le barre grigie rappresentano l'amplificazione ottenuta con primer specifici per Cas, mentre le barre nere rappresentano l'amplificazione ottenuta con primer specifici per 129. Un valore basso di CT o l'assenza di amplificazione con i primer interni indica la delezione della sequenza bersaglio.I cloni con una delezione su uno o entrambi gli alleli vengono quindi analizzati mediante primer esterni. L'amplificazione ottenuta con i primer esterni conferma la delezione. I cloni con delezione monoallelica vengono sottoposti a screening utilizzando primer che delimitano le regioni bersaglio della gRNA, al fine di confermare l'assenza di inserzioni o delezioni, definite indel, sull'allele non eliminato.Vengono utilizzate solo linee monoclonali monoalleliche prive di indel di grandi dimensioni nei siti bersaglio dell'allele non eliminato per l'analisi dell'espressione successiva. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi ottenuti da linee derivate da 129 o da eliminazione Cas SCR. L'elemento SCR è un enhancer specifico per Sox2 recentemente descritto nelle cellule staminali embrionali.I barri rossi rappresentano l'espressione dell'allele Sox2 Cas, e i barri blu rappresentano l'amplificazione dell'allele Sox2 129. Come si può osservare in questa figura, l'eliminazione dell'SCR sull'allele 129 o Cas ha ridotto l'espressione di Sox2 in CIS. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare una delezione di grandi dimensioni utilizzando la tecnologia CRISPR e come utilizzare primer specifici per allele per genotipizzare le proprie linee cellulari con delezione.

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