Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare una delezione mediata da CRISPR/Cas9 specifica per allele per studiare la regolazione della trascrizione genica nelle cellule staminali embrionali del topo. Il principale vantaggio di questa tecnica, che impiega un genoma ibrido per generare e analizzare delezioni monoallele, consiste nel fatto che elimina la necessità di analizzare delezioni potenziate monoallele che potrebbero non essere vitali.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genomica funzionale. Ad esempio, quale gene viene regolato da un enhancer specifico e quanto quel gene dipende da un singolo enhancer per la propria attività. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla pluripotenza delle cellule staminali, può essere applicato anche ad altri sistemi.

Ad esempio, può aiutarci a comprendere come le cellule staminali modifichino il loro destino per diventare neuroni, cellule del sangue o muscolari. Dopo aver progettato, costruito e confermato la sequenza dell'RNA guida, o gRNA, da utilizzare, prepararsi a trasfettare i plasmidi privi di endotossine nelle cellule staminali embrionali. Utilizzando una centrifuga, raccogliere in pellet 1×10⁶ cellule staminali embrionali F1 generate dall'incrocio tra Mus musculus 129 e Mus castaneus in un tubo da 1,5 millilitri a 300×g per cinque minuti.

Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e aggiungere 100 microlitri del tampone di risospensione fornito dal produttore del kit. Per l'eliminazione della regione di DNA bersaglio, aggiungere cinque microgrammi ciascuno dei plasmidi P Cas9 GFP 5-primo e 3-primo gRNA. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente.

Evitare l'introduzione di bolle d'aria. Successivamente, utilizzare la punta pipettatrice elettronica del microporatore per aspirare 100 microlitri della miscela di elettroporazione, avendo cura di non introdurre aria nella punta. Quindi, inserire la pipetta nel dispositivo di trasfezione.

Selezionare il protocollo appropriato e premere avvio. Mentre l'elettroporazione è in corso, osservare la punta. Con l'impostazione corretta, dovrebbero fuoriuscire piccole bolle dall'elettrodo del tubo.

Una scintilla indica la presenza di una bolla d'aria e interferirà con la trasfezione. In tal caso, l'elettroporazione deve essere ripetuta con un nuovo lotto di cellule. Dopo l'elettroporazione, espellere le cellule trasfettate in una piastra da dieci centimetri rivestita di gelatina e contenente dieci millilitri di mezzo per cellule ES.

Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, utilizzare un citometro a flusso per ordinare e isolare le cellule ES positive per cast nine GFP. Successivamente, seminare da 1 a 1,5 volte 10 alla quarta cellule positive per GFP in una piastra da 10 centimetri, rivestita con gelatina e contenente 10 millilitri di mezzo per cellule ES.

La semina a questa bassa densità faciliterà la selezione di singole colonie di cellule staminali embrionali. Dopo quattro o cinque giorni, utilizzare un microscopio per identificare singole colonie di cellule staminali embrionali di forma sferica. Trasferire ciascuna colonia, mediante pipetta, in una singola pozzetta di una piastra a 96 pozzette pretrattata con gelatina e contenente 30 microlitri di tripsom.

Dopo aver prelevato e dissociato tutte le colonie nel mezzo, coltivare le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore a biossido di carbonio fino a quando la maggior parte delle pozzette non raggiunge una confluenza superiore al 70%. Ciò richiede solitamente circa due giorni. Quando le cellule sono pronte per essere suddivise, rimuovere il mezzo e aggiungere 30 microlitri di tripsom.

Incubare le cellule per cinque minuti. Successivamente, aggiungere a ciascun pozzetto 180 microlitri di mezzo per cellule ES per neutralizzare la tripsina. Aspirare e dispensare più volte per ottenere una sospensione di cellule singole.

Da ogni pozzetto, trasferire 70 microlitri in ciascuna delle tre piastre a 96 pozzetti rivestite con gelatina contenenti 130 microlitri di mezzo per cellule staminali embrionali (ES) in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius. Quando le piastre raggiungono una confluenza del 70-85%, utilizzarle per eseguire il genotipaggio e l'analisi dell'espressione di ciascuna linea, come descritto nelle sezioni seguenti.

Congelare le colture cellulari come descritto nel documento allegato. In questo caso, verranno progettati quattro set di primer per analizzare le linee cellulari alla ricerca della delezione desiderata. Tali primer comprendono: primer interni, primer esterni e primer adiacenti alla sequenza bersaglio della gRNA, per entrambi i siti bersaglio della gRNA in posizione 5' e 3'.

Cominciare visitando il sito web mostrato qui per ottenere la traccia del polimorfismo a singolo nucleotide, o snip, corrispondente ai genotipi 129 e Cas. Questo indirizza alla pagina web CRISPR del Mitchell Lab. Lì, fare clic sul link fornito.

Il sito reindirizzerà al browser del genoma UCSC contenente la traccia che visualizza le variazioni tra i genomi 129 e Cas nell'assemblaggio del genoma del topo MM-9. Successivamente, inserire le coordinate della regione da eliminare e fare clic su "go". Eseguire lo zoom su una regione di circa 500 paia di basi nel mezzo dell'eliminazione desiderata, contenente più di tre variazioni.

La progettazione di primer specifici per allelo può risultare complessa se i polimorfismi sono scarsi. Se non è possibile progettare primer assolutamente specifici per l'allele, si possono utilizzare primer moderatamente specifici. Ricordarsi semplicemente di confrontare i valori di CT tra le linee cellulari con delezione e quelle senza delezione durante l'analisi dei risultati di qPCR.

Ora, fare clic su Visualizza nella barra superiore. Dal menu a discesa, selezionare DNA. Verrà visualizzata la pagina Ottieni DNA nella finestra.

Nelle opzioni di formattazione della sequenza, selezionare maiuscolo completo, quindi fare clic su "Ottieni DNA" per visualizzare la sequenza bersaglio in formato maiuscolo. Copiare questa sequenza e incollarla in un documento di Word. Successivamente, confrontare la sequenza con la traccia del polimorfismo 129 cast e evidenziare le posizioni del polimorfismo, contrassegnando i polimorfismi 129 con lettere minuscole.

Una volta completata la sequenza 129, copiarla per creare due sequenze nel formato fast day. Una per 129 e una per Cas. Nella sequenza di cast, sostituire la base corretta in ogni posizione di taglio, indicando il taglio con una lettera minuscola.

Successivamente, etichettare la sequenza con il relativo genoma, 129 o Cas. Quindi, nel browser, inserire l'indirizzo di Primer3Plus. Nell'area appropriata, incollare la sequenza 129 con la sostituzione effettuata.

Utilizzare le impostazioni predefinite per progettare i primer. Per progettare i primer specifici dell'allele interni, fare clic sul menu a discesa a destra di "Task" e selezionare "Primer List", quindi fare clic su "Pick Primers". Si aprirà una nuova pagina che mostra un elenco di primer forward e reverse.

Selezionare la casella per scegliere un primer diretto o inverso che abbia una snip segnata da una lettera minuscola all'estremità 3-prime o entro quattro basi dall'estremità 3-prime. Si noti che i primer con una snip all'estremità 3-prime mostrano una maggiore specificità per l'allele durante la qPCR. Fare clic su Invia al Gestore Primer3 in fondo allo schermo.

Si aprirà una nuova pagina che mostra il primer selezionato. Per selezionare il secondo primer, tornare alla pagina dell'elenco dei primer e fare clic sul pulsante indietro per ritornare alla pagina principale. Nel menu a tendina dell'attività, selezionare Rilevamento.

La pagina principale verrà aggiornata e apparirà in basso una casella per la sequenza del primer sinistro e una per quella del primer destro. Incollare la prima sequenza del primer nella casella appropriata. Successivamente, passare alla scheda Impostazioni generali situata accanto alla scheda Principale e modificare l'impostazione relativa all'intervallo dimensionale del prodotto da 80 a 200 paia di basi.

Fare clic su "Scegli primers": verrà aperta una pagina che mostra cinque possibili coppie di primers per la prima sequenza di primer. Selezionare un set di primers dall'elenco delle coppie di primers attivando le caselle a sinistra dei primers e fare clic su "Invia al gestore Primer3" in fondo alla schermata. Questi saranno i primers specifici per l'allele interno 129.

Ripetere questi passaggi per progettare primer per l'allele cast. Successivamente, applicare questa tecnica alla progettazione di primer esterni specifici per allele e primer non specifici per allele. Infine, testare la specificità dei primer per allele mediante qPCR come descritto nel documento allegato.

Estrarre il DNA genomico dalla piastra a 96 pozzetti preparata in precedenza. Centrifugare brevemente la piastra per far depositare qualsiasi condensa sul fondo dei pozzetti. Questo DNA verrà utilizzato come stampo per lo screening delle delezioni.

Successivamente, su una piastra a 384 pozzetti, eseguire la qPCR in duplicato per ciascun clone. Utilizzare una PCR a due passaggi seguita da un'analisi della curva di denaturazione con rilevamento. Al termine della corsa, verificare innanzitutto l'amplificazione di ciascun allele con i primer specifici per l'allele interno.

Nessun amplificazione di un allele o differenze di valore CT superiori a cinque cicli tra gli alleli indicano che queste linee cellulari portano una delezione eterozigote. L'assenza di amplificazione di entrambi gli alleli indica che portano una delezione omozigote. Successivamente, verificare l'amplificazione di ciascun allele utilizzando i primer specifici per l'allele esterno.

Se l'eliminazione bersaglio è superiore a un KB, l'amplificazione con primer esterni avverrà solo se è presente un'eliminazione. Un valore CT compreso tra 22 e 28 conferma l'eliminazione. Per eliminazioni bersaglio inferiori a un KB, confermare la dimensione dell'amplificone mediante elettroforesi.

Una piastra a 96 pozzetti contenente cloni di delezione è stata analizzata mediante qPCR utilizzando primer interni specifici per allele. Le barre grigie rappresentano l'amplificazione ottenuta con primer specifici per Cas, mentre le barre nere rappresentano l'amplificazione ottenuta con primer specifici per 129. Un valore basso di CT o l'assenza di amplificazione con i primer interni indica la delezione della sequenza bersaglio.

I cloni con una delezione su uno o entrambi gli alleli vengono quindi analizzati mediante primer esterni. L'amplificazione ottenuta con i primer esterni conferma la delezione. I cloni con delezione monoallelica vengono sottoposti a screening utilizzando primer che delimitano le regioni bersaglio della gRNA, al fine di confermare l'assenza di inserzioni o delezioni, definite indel, sull'allele non eliminato.

Vengono utilizzate solo linee monoclonali monoalleliche prive di indel di grandi dimensioni nei siti bersaglio dell'allele non eliminato per l'analisi dell'espressione successiva. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi ottenuti da linee derivate da 129 o da eliminazione Cas SCR. L'elemento SCR è un enhancer specifico per Sox2 recentemente descritto nelle cellule staminali embrionali.

I barri rossi rappresentano l'espressione dell'allele Sox2 Cas, e i barri blu rappresentano l'amplificazione dell'allele Sox2 129. Come si può osservare in questa figura, l'eliminazione dell'SCR sull'allele 129 o Cas ha ridotto l'espressione di Sox2 in CIS. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come generare una delezione di grandi dimensioni utilizzando la tecnologia CRISPR e come utilizzare primer specifici per allele per genotipizzare le proprie linee cellulari con delezione.