Generazione CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic eliminazioni per studiare la funzione Enhancer nel topo cellule staminali embrionali
April 2nd, 2016
La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare la delezione mediata da CRISPR/Cas9 allele specifico per studiare la regolazione della trascrizione genica nelle cellule staminali embrionali di topo. Il vantaggio principale di questa tecnica, che utilizza un genoma ibrido per generare e analizzare delezioni monoalleliche. Invece, elimina la necessità di analizzare le delezioni potenziate monoalleliche che potrebbero non essere vitali.
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della genomica funzionale. Ad esempio, quale gene regola un potenziatore specifico e quanto dipende quel gene da qualsiasi potenziatore per la sua attività. Quelli questo metodo può fornire informazioni sulla pluripotenza delle cellule staminali, può essere applicato anche ad altri sistemi.
Ad esempio, può aiutarci a capire come le cellule staminali cambiano il loro destino per diventare neuroni, cellule del sangue o muscoli. Dopo aver progettato, costruito e confermato la sequenza dell'RNA guida, o gRNA, da utilizzare, preparati a trasfettare i plasmidi privi di endotossine in cellule ES. Utilizzando una centrifuga, pellettare una volta per dieci fino alla sesta cellula staminale embrionale F1 generata incrociando Mus musculus 129 con Mus castaneus in una provetta da 1,5 millilitri a 300 volte g' per cinque minuti.
Dopo la centrifuga, scartare il surnatante e aggiungere 100 microlitri di tampone di risospensione fornito dal produttore del kit. Per la delezione della regione di DNA bersaglio, aggiungere cinque microgrammi ciascuno di plasmidi di gRNA P, Cas9, GFP, 5-prime e 3-prime. Utilizzando una pipetta, mescolare delicatamente.
Evitare l'introduzione di bolle. Successivamente, utilizzare la punta della pipetta elettronica del microporatore per aspirare 100 microlitri della miscela di elettroporazione, facendo attenzione a evitare di introdurre aria nella punta. Quindi, collegare la pipetta al dispositivo di trasfezione.
Selezionare il protocollo appropriato e premere start. Mentre l'elettroporazione è in funzione, osservare la punta. Con la corretta configurazione, dovrebbero emergere minuscole bolle dall'elettrodo del tubo.
Una scintilla indica la presenza di una bolla d'aria e interferisce con la trasfezione. In tal caso, l'elettroporazione deve essere ripetuta con un nuovo lotto di cellule. Dopo l'elettroporazione, espellere le cellule trasfettate in un piatto rivestito di gelatina di dieci centimetri contenente dieci millilitri di terreno cellulare ES.
Incubare le cellule trasfettate a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica. Dopo 48 ore, utilizzare un citometro a flusso per ordinare e isolare le nove cellule ES GFP positive fuse. Quindi, somministrare da 1 a 1,5 volte 10 alla quarta cellula GFP positiva in un piatto di 10 centimetri rivestito di gelatina contenente 10 millilitri di terreno cellulare ES.
La placcatura a questa bassa densità faciliterà la raccolta di singole colonie di cellule ES. Quattro o cinque giorni dopo, utilizzare un microscopio per identificare singole colonie di cellule ES a forma di palla. Utilizzando una pipetta, trasferire ogni colonia in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti pretrattata con gelatina e contenente 30 microlitri di tripsom.
Una volta che tutte le colonie sono state raccolte e dissociate in terreno, far crescere le cellule a 37 gradi Celsius nell'incubatore di anidride carbonica fino a quando la maggior parte dei pozzetti non è confluente per oltre il 70%. Questo di solito richiede circa due giorni. Quando le cellule sono pronte per la scissione, rimuovere il terreno e aggiungere 30 microlitri di tripsom.
Incubare le cellule per cinque minuti. Quindi, a ciascun pozzetto aggiungere 180 microlitri di terreno cellulare ES per neutralizzare il tripsom. Pipettare su e giù per ottenere una sospensione a singola cellula.
Da ogni pozzetto, trasferire 70 microlitri in ciascuna delle tre piastre da 96 pozzetti rivestite di gelatina contenenti 130 microlitri di terreno cellulare ES in ciascun pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius. Quando le piastre raggiungono il 70-85% di confluenza, utilizzarle per eseguire la genotipizzazione e l'analisi dell'espressione di ciascun clone, come descritto nelle sezioni seguenti.
Congelare le scorte di cellule come descritto nel documento di accompagnamento. Qui, quattro serie di primer saranno progettate per selezionare i cloni per la delezione desiderata. Questi includono: primer interni, primer esterni e primer di fiancheggiamento del gRNA per i siti bersaglio del gRNA 5-prime e 3-prime.
Iniziare visitando il sito web mostrato qui per ottenere il polimorfismo a singolo nucleotide o traccia di snip corrispondente ai genotipi 129 e Cas. Questo indirizza alla pagina web CRISPR del Mitchell Lab. Lì, fai clic sul collegamento fornito.
Il sito reindirizzerà al browser del genoma UCSC contenente la traccia che mostra le cesoie tra i genomi 129 e Cas nell'assemblaggio del genoma del topo MM-9. Successivamente, inserisci le coordinate della regione da eliminare. e clicca su vai"Ingrandisci una regione di circa 500 coppie di basi nel mezzo della delezione desiderata contenente più di tre tagli.
La progettazione di primer specifici per allele può essere complicata se le cesoie sono scarse. Se non è possibile progettare primer allele-specifici assoluti, possono essere utilizzati primer allele-specifici moderati. Ricordarsi solo di confrontare i valori CT tra i cloni eliminati e non eliminati durante l'analisi dei risultati della qPCR.
Ora, fai clic su Visualizza"nel pannello superiore. Dal menu a discesa, selezionare DNA. Apparirà la pagina "Ottieni DNA nella finestra".
Nelle opzioni di formattazione della sequenza, scegli tutte le maiuscole, quindi fai clic su Ottieni DNA"per visualizzare la sequenza di destinazione in tutto il formato maiuscolo. Copia questa sequenza e incollala in un file di documento di Word. Quindi, confronta la sequenza con la traccia di taglio lanciata 129 ed evidenzia le posizioni di taglio e contrassegna i 129 tagli con la minuscola.
Quando hai finito con la sequenza 129, copiala per creare due sequenze formattate per il giorno veloce. Uno per 129 e uno per Cas. Nella sequenza di lancio, sostituisci la base corretta in ogni posizione di taglio, contrassegnando il taglio con una minuscola.
Quindi, etichettare la sequenza con il genoma corrispondente, 129 o Cas. Quindi, nel browser, digita l'indirizzo di Primer3Plus. Nell'area appropriata, incollare la sequenza 129 sostituita da snip.
Utilizzare le impostazioni predefinite per progettare gli inneschi. Per progettare i primer specifici per alleli interni, fare clic sul menu a discesa a destra di Attività"e selezionare Elenco primer"fare clic su Scegli primer. Si aprirà una nuova pagina che mostra un elenco di inneschi in avanti e indietro.
Seleziona la casella di selezione per scegliere un innesco in avanti o all'indietro che abbia un taglio contrassegnato da una minuscola all'estremità a 3 numeri primi o entro quattro basi dall'estremità a 3 numeri primi. Si noti che i primer che hanno un taglio all'estremità a 3 primi mostrano una maggiore specificità allelica durante la qPCR. Fare clic su Invia a Primer3 Manager"nella parte inferiore dello schermo.
Si aprirà una nuova pagina che mostra il primer selezionato. Per selezionare il secondo primer, tornare alla pagina dell'elenco dei primer e fare clic sul pulsante Indietro per tornare alla pagina principale. Nel menu a discesa dell'attività, selezionare Rilevamento.
La pagina principale si aggiornerà e in basso apparirà una casella di sequenza di primer sinistra e destra. Incollare la prima sequenza di primer nell'apposita casella. Quindi, vai alla scheda Impostazioni generali situata accanto alla scheda Principale e modifica l'impostazione per la gamma di dimensioni del prodotto da 80 a 200 paia di base.
Fai clic su Scegli primer"Si aprirà una pagina che mostra cinque possibili coppie di primer per la prima sequenza di primer. Scegli un set di primer dall'elenco delle coppie di primer selezionando le caselle a sinistra dei primer e fai clic su Invia a Primer3 Manager"nella parte inferiore dello schermo. Questi saranno i 129 primer allele-specifici interni.
Ripetere questi passaggi per progettare i primer per l'allele fuso. Quindi, applica questa tecnica alla progettazione di primer esterni specifici per allele e primer non specifici per gli alleli. Infine, testare i primer per la specificità allelica utilizzando la qPCR come descritto nel documento di accompagnamento.
Estrarre il DNA genomico dalla piastra a 96 pozzetti preparata in precedenza. Centrifugare brevemente la piastra per depositare l'eventuale condensa sul fondo del pozzetto. Questo DNA servirà come modello per lo screening della delezione.
Successivamente, su una piastra da 384 pozzetti, preformare la qPCR e duplicare per ogni clone. Utilizzare una PCR in due fasi seguita da un'analisi della curva di fusione con rilevamento. Dopo la corsa, controllare prima l'amplificazione di ciascun allele con i primer allele-specifici interni.
L'assenza di amplificazione di un allele o di differenze di valore CT superiori a cinque cicli tra gli alleli, suggerisce che questi cloni siano portatori di una delezione eterozigote. Nessuna amplificazione di entrambi gli alleli suggerisce che essi portino una delezione omozigote. Quindi, controllare l'amplificazione di ciascun allele con i primer specifici per allele esterni.
Se la delezione target è maggiore di un KB, l'amplificazione con primer esterni si verificherà solo se è presente una delezione. Un valore CT compreso tra 22 e 28 conferma l'eliminazione. Per delezioni target inferiori a un KB, confermare la dimensione dell'ampicone mediante elettroforesi.
Una piastra a 96 pozzetti di cloni di delezione è stata sottoposta a screening mediante qPCR utilizzando primer interni allele-specifici. Le barre grigie rappresentano i primer specifici per Cas e le barre nere rappresentano l'amplificazione dei primer specifici per 129. Un valore CT basso o nessuna amplificazione con primer interni indica la delezione del bersaglio.
I cloni con una delezione su uno o entrambi gli alleli vengono quindi sottoposti a screening con i primer esterni. Con i primer esterni, l'amplificazione conferma la delezione. I cloni con una delezione monoallelica vengono sottoposti a screening utilizzando primer che fiancheggiano le regioni bersaglio del gRNA per confermare l'assenza di inserzioni o delezioni, chiamate indel, sull'allele non deleto.
Nella successiva analisi dell'espressione vengono utilizzati solo cloni monoallelici senza grandi indels nei siti bersaglio sull'allele non deleto. Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi di 129 cloni eliminati o Cas SCR. L'SCR è un potenziatore specifico di Sox2 recentemente descritto nelle cellule ES.
Le barre rosse rappresentano l'espressione dell'allele Cas Sox2 e le barre blu rappresentano l'amplificazione dell'allele Sox2 129. Come si può vedere in questa figura, la delezione dell'SCR sull'allele 129 o Cas ha ridotto l'espressione di Sox2 in CIS. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare una grande delezione utilizzando la tecnologia CRISPR e utilizzare primer specifici per allele per genotipizzare i cloni eliminati.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'uso dell'eliminazione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule staminali embrionali di topo. La tecnica sfrutta un genoma ibrido per facilitare l'analisi delle delezioni monoallelici, fornendo informazioni sulla regolazione genica.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Genomica funzionale
- Regolazione della trascrizione genica
- Tecnologia CRISPR/Cas9
Contesto
- Comprendere l'attività dell'enhancer è cruciale per la regolazione genica.
- L'analisi della perdita di funzione è un approccio chiave in questo campo.
- Le cellule staminali embrionali di topo forniscono un modello per studiare la regolazione genica.
- I genomi ibridi possono aiutare nell'analisi di interazioni geniche specifiche.
Obiettivo dello studio
- Investigare il ruolo di specifici enhancer nella regolazione genica.
- Determinare la dipendenza dei geni da particolari enhancer.
- Migliorare la comprensione della pluripotenza delle cellule staminali e delle sue applicazioni.
Metodi utilizzati
- Tecnica di eliminazione mediata da CRISPR/Cas9.
- Uso di cellule ES F1 con un genoma ibrido (Mus musculus 129 x Mus castaneus).
- Analisi delle delezioni monoallelici per studiare la trascrizione genica.
- Valutazione sperimentale dell'attività dell'enhancer attraverso l'analisi della perdita di funzione.
Risultati principali
- Implementazione con successo delle delezioni allele-specifiche nelle cellule staminali.
- Informazioni sulla regolazione della trascrizione genica da parte di specifici enhancer.
- Dimostrazione dell'applicabilità del metodo a vari sistemi biologici.
- Contributo alla comprensione della genomica funzionale.
Conclusioni
- Il metodo CRISPR/Cas9 è efficace per studiare l'attività degli enhancer.
- Questo approccio può chiarire la relazione tra enhancer ed espressione genica.
- I risultati possono avere implicazioni più ampie per la ricerca sulle cellule staminali e la genomica funzionale.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise interrogation of enhancer function through allele-specific CRISPR/Cas9 deletion in hybrid mouse embryonic stem cells, addressing a key challenge in target validation: linking distal regulatory elements to gene expression. By leveraging natural SNPs between Mus musculus 129 and Mus castaneus alleles, the approach supports mechanistic de-risking of transcriptional regulators without confounding homozygous lethality, providing predictive confidence in enhancer-gene relationships early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation by testing enhancer necessity for gene expression in a physiologically relevant stem cell model.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through monoallelic loss-of-function analysis that avoids phenotypic confounding from complete regulatory element deletion.
- Scientific Value: Enhances target confidence by providing direct cis-regulatory evidence via allele-specific deletion screening using SNP-discriminating primers.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Facilitates assay standardization through qPCR-based genotyping with allele-specific inside and outside primers to distinguish heterozygous, homozygous, and wild-type clones.
- Operational Value: Enables scalable screening workflow using 96-well plate colony picking and qPCR on 384-well plates for high-throughput deletion validation.
- Operational Value: Supports assay reproducibility by requiring confirmation of no indels on the non-deleted allele via gRNA-flanking primers before expression analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Provides disease-relevant system insights by studying enhancer-mediated regulation of pluripotency factors like Sox2 in mouse embryonic stem cells.
- Translational Value: Supports predictive confidence in stem cell fate decisions by linking enhancer deletion to changes in gene expression relevant to differentiation pathways.
- Translational Value: Enables mechanistic de-risking of enhancer targets through quantitative expression analysis (qPCR) showing allele-specific reduction in target gene transcription.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology to lead identification continuum by providing functional validation of non-coding regulatory elements prior to therapeutic targeting, with outputs directly informing target prioritization and de-risking decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-gene relationships through allele-specific deletion and expression analysis in a genetically tractable model.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized qPCR workflow using allele-specific primers to quantify deletion efficiency and specificity across clones.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (CT values, melt curves) that enable comparison of allelic expression and deletion zygosity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by studying enhancer function in a stem cell model relevant to differentiation and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for enhancer validation across genomic regions using the same SNP-based primer design and CRISPR workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in enhancer function through direct loss-of-function evidence without compensatory mechanisms from homozygous deletion.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via SNP-guided allele-specific primer design and qPCR screening protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by clarifying enhancer dependency and reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of transcriptional targets based on validated enhancer-gene relationships in a disease-relevant cellular context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design, allele-specific primer engineering, and qPCR analysis for allelic discrimination.
- Dependent on access to F1 hybrid embryonic stem cells with sufficient SNP density (every ~125 bp) for reliable allele-specific targeting.
- Necessitates standardization across teams for primer design workflows using UCSC genome browser and Primer3Plus to ensure allele specificity.
- Involves adaptation considerations for non-hybrid models where SNP density may be insufficient for allele-specific resolution.
- Includes practical limitations such as the need to confirm absence of indels on the non-deleted allele before attributing expression changes to enhancer loss.
