Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare nuovi geni candidati per i disturbi malformativi cerebrali e confermare direttamente il loro ruolo causale in vivo. Questa strategia può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurobiologia scoprendo percorsi molecolari associati allo sviluppo cerebrale e patologie correlate. Il vantaggio principale di questa strategia è che aiuterà a scoprire nuovi geni associati a disturbi cerebrali e a sviluppare nuovi strumenti diagnostici.

Utilizzando questo approccio abbiamo potuto rivelare il contributo cruciale del gene C6orf70 nella patogenesi dell'eterotopia nodulare periventricolare, una malformazione cerebrale causata da un'anomala migrazione neuronale. A dimostrare la procedura sarà Fabienne Schaller, un ingegnere del nostro laboratorio. Preparare una rata gravida E15 per la procedura come indicato nel protocollo scritto e secondo le linee guida istituzionali e nazionali.

Assicurarsi che l'animale sia adeguatamente anestetizzato, che l'unguento oftalmico sia applicato sugli occhi e che l'addome sia adeguatamente rasato e disinfettato. Dopo aver usato le forbici affilate per praticare un'incisione verticale di due centimetri nella pelle e nel muscolo della linea mediana dell'addome caudale, esporre con cura un corno uterino dalla cavità addominale. Applicare una soluzione salina normale preriscaldata a 37 gradi Celsius goccia a goccia per idratare gli embrioni.

Mantieni l'utero umido durante tutta la procedura. Per iniettare il DNA, tieni delicatamente un embrione in una mano con la testa facilmente accessibile. Quindi, usando l'altra mano, inserire con cautela un capillare di vetro collegato a un microiniettore nel ventricolo laterale sinistro che si trova a un millimetro dalla linea mediana e a una profondità di due o tre millimetri.

Utilizzare il microiniettore per iniettare circa un microlitro di DNA con il verde veloce per consentire il monitoraggio visivo dell'iniezione. Per elettroporare il DNA nelle cellule, prima far cadere una normale soluzione salina sulla superficie dell'elettrodo di tre per sette millimetri. Quindi posizionare l'elettrodo positivo sul lato iniettato e l'elettrodo negativo sul ventricolo destro non iniettato.

Utilizzare il pedale controllato a pedale per erogare cinque impulsi elettrici a intervalli di 950 millisecondi. Dopo l'elettroporazione, riportare il corno uterino nella cavità addominale e aggiungere soluzione fisiologica sterile per consentire agli embrioni di posizionarsi in modo più naturale e per tenere conto della perdita di liquidi intraoperatori. Chiudere la parete muscolare con suture chirurgiche riassorbibili, quindi la pelle utilizzando un semplice punto interrotto.

Fornire analgesia post-operatoria per un massimo di 48 ore o come indicato dalle linee guida istituzionali. Rimetti il ratto nella sua gabbia domestica pulita e monitoralo fino a quando non emerge dall'anestesia. Dopo aver fissato il cervello in paraformaldeide al 4% come indicato nella parte scritta del protocollo, lavare in PBS per 10 minuti.

Durante il lavaggio, preparare 50 millilitri di agar al 4% in PBS assicurandosi che la temperatura dell'agarosio disciolto non superi i 50 gradi Celsius. Versare l'agarosio in stampi di plastica per incorporare e quindi posizionare il cervello nell'agarosio. Posiziona i cervelli incorporati a quattro gradi Celsius e lascia che l'agarosio polimerizzi per almeno un'ora.

Dopo che l'agarosio si è polimerizzato, tagliare l'agarosio in eccesso intorno al cervello, quindi incollare il cervello alla piastra di base del vibratomo con l'accesso posteriore anteriore del cervello perpendicolare alla lama. Dopo aver atteso qualche minuto affinché la colla si asciughi, posizionare la piastra con il cervello incollato nella camera del vibratomo. Riempire il vibratomo con PBS e iniziare ad affettare sezioni spesse 100 micron.

Dopo il sezionamento, trasferire le sezioni sui vetrini del microscopio e rimuovere il liquido in eccesso. Quindi aggiungere alcune gocce di mezzo di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetti sopra le sezioni. Lasciare asciugare per una notte.

Visualizzare le sezioni utilizzando un ingrandimento 10x su un microscopio confocale a scansione laser. Per analizzare le immagini, convertire prima l'immagine in 8 bit utilizzando un software appropriato per l'analisi quantitativa delle immagini. Quindi selezionare una cellula fluorescente positiva GFP rappresentativa e definirne manualmente la forma facendo clic su stima e utilizzando lo strumento di selezione a mano libera per disegnare il bordo della cella.

Il software mantiene automaticamente il diametro e la soglia di intensità della cella. Fare clic su Trova cellule per consentire al software di localizzare le cellule trasfettate in tutta la corteccia. Quindi, se necessario, rimuovere manualmente i falsi positivi.

Dividi l'intero spessore della corteccia in otto aree di interesse, normalizzate in singole sezioni, cliccando sullo strumento regione, selezionando otto strisce di regione, dove le strisce uno e otto corrispondono rispettivamente alla zona ventricolare e alla parte superiore della placca corticale. Successivamente, fare clic su applica per consentire al software di contare la posizione relativa delle cellule trasfettate GFP nell'intera corteccia. Infine, fai clic su salva quantificazione per esportare i dati in un file Excel per l'analisi.

L'array CGH e il sequenziamento dell'intero esoma hanno identificato C6orf70 come gene candidato per anomalie geniche dello sviluppo. La PCR quantitativa ha determinato che questo gene, insieme a PHF10 e DLL1, è espresso nella corteccia cerebrale del ratto. Le immagini seguenti mostrano sezioni coronali neocorticali rappresentative di cervelli di ratto E20 5 giorni dopo l'elettroporazione con un costrutto proteico fluorescente verde da solo o combinato con shRNA mirato alla sequenza codificante C6orf70 o con il costrutto di mismatch relativamente inefficace.

Il knock down del filamento A è stato utilizzato come controllo della migrazione neuronale compromessa. L'elettroporazione in utero con shRNA mirato al C6orf70 o al filamento A ha indotto l'arresto delle cellule GFP positive all'interno della zona ventricolare, come indicato dalle frecce bianche, mentre le cellule che esprimono GFP da sole o in combinazione con il costrutto di mismatch non hanno alterato la migrazione neuronale. Durante il tentativo di questa procedura è importante tenere a mente quale stato di genesi corticale si desidera analizzare, la proliferazione neuronale, la migrazione o la maturazione.

Non dimenticare che imparare a eseguire l'elettroporazione in utero nel cervello embrionale di roditore richiede un lungo periodo di allenamento, abilità e pratica regolare.