Name: Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a editar el genoma de células madre pluripotentes humanas mediante electroporación y selección con antibióticos. Este protocolo permite modelar enfermedades humanas con precisión genética en un contexto controlado.

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Este trabajo fue apoyado por una subvención de Semilla de Fundación de Investigación del Cerebro (BRFSG-2014-02) para Helen Bateup. Dirk Hockemeyer es un nuevo Académico en el envejecimiento de la Fundación Médica Ellison y es apoyado por la Fundación Glenn así como el El Shurl y Fundación Kay Curci. DH también es apoyado por el NIH subvención 1R01CA196884-01.

Los procedimientos descritos en este manuscrito fueron revisados ​​y aprobados por el Comité de Supervisión de la Investigación Universidad de Berkeley de Células Madre. 1. Preparar las células madre para la edición <ol><li> Crecer y cultivar células madre pluripotentes humanas (hPSCs) en una placa de 6 pocillos que contiene 2,4 × 10 6 células / plato de ratón inactivado-C mitomicina fibroblastos embrionarios (MEF) alimentadores cultivadas en gelatina 32. Mantener hPSCs en 3 ml de medio de células madre de embriones humanos por pozo (medios hESC) y crecer en un 37 ° C incubadora con 3% O 2/5% de CO 2. Nota: Para el éxito de este protocolo, no es necesario mantener hPSCs en una incubadora de bajo oxígeno; sin embargo, es importante señalar que hPSCs proliferan más rápidamente en un entorno de alto O 2, por lo que los tiempos y el número de células se deben ajustar en consecuencia. También hay que señalar que hPSCs mantienen en bajos niveles de oxígeno tienen menores tasas de diferenciación espontánea 33. <ol><li> To hacer que los medios de comunicación 500 ml hESC combinan 380 ml de DMEM / F12, 75 ml de suero fetal bovino (FBS), 25 ml KnockOut suero de Reemplazo (KSR). Añadir glutamina (1 mM concentración final), 5 ml 100x ácidos no esenciales Amino, 100 unidades / ml penicilina-estreptomicina (P / S), factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) (4 ng / ml de concentración final), y 2- mercaptoetanol (5,5 M concentración final). </li></ol></li><li> Cambie los medios de comunicación mediante la eliminación de todo el volumen de los medios de comunicación (3 ml) con una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con medios hESC 3 ml tibia con una pipeta serológica. Repita los medios cambian todos los días hasta hPSCs son aproximadamente el 50% de confluencia (día -1). </li><li> Un día antes de la orientación (día -1), cambiar los medios de comunicación células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. </li><li> También el día -1, preparar una o dos placas de 6 pocillos o de 10 cm de resistentes células alimentadoras MEF drogas de ratones DR4 (2,4 × 10 6 células / placa) 34. Nota: En general, las placas de 6 pocillos son adventajosos más de 10 platos cm, ya que acomodan más medios. 6 placas así también garantizar que los diferentes clones de diferentes pozos son independientes. Sin embargo, una placa de 10 cm permitirá picking más fácil, dependiendo del microscopio disponible para este proceso. </li></ol> 2. Edición de células madre pluripotentes <ol><li> Preparar soluciones de transfección pipeteando 5 g cada uno de ZFN 1 y 2, TALEN 1 y 2, o 15 g de la CRISPR / Cas9 plásmido que codifica px330 (Figura 1) en un tubo de 1,5 ml. Pipetear 30 g del plásmido de reparación en este tubo también. Por último, la pipeta 1x tampón fosfato salino (PBS) en el tubo para llevar el volumen hasta 300 l. Nota: Preparar plásmidos como un midiprep (cualquier kit es adecuado) con una concentración mínima de 300 ng / l con el fin de mantener el volumen total de la solución de transfección de menos de 300 microlitros. No es necesario para llevar a cabo la extracción con fenol / cloroformo, para linealizar el plásmido, o utilizar un endotokit de preparación plásmido libre xin. </li><li> Retire el medio de hPSCs utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 2 ml de PBS 1x caliente en cada pozo para lavar las células. </li><li> Retire la PBS de inmediato con una pipeta de vidrio y de vacío. Añadir solución de tripsina-EDTA 0,5 ml 0,25% directamente sobre las células en cada pocillo. Colocar en la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2) durante aproximadamente 10 min. o hasta capa de alimentación comienza a levantar la placa. </li><li> Añadir 2 ml de medio caliente esWash (470 ml DMEM / F12, 25 ml de FBS, 100 unidades / ml P / S) a cada pocillo para detener la reacción tripsina. </li><li> Asegurar que las células alimentadoras salir como una hoja. Pipetear los contenidos de cada pocillo en un único tubo cónico de 50 ml, la combinación de todos los pocillos. Células usando un triturado en 10 ml pipeta serológica. No es necesario para romper la capa de alimentación; hPSCs se desprenderá de la capa de alimentación por trituración suave. No debe ser de unos 15 ml de la suspensión celular. </li><li> Añadir 25 ml de medio esWash al tubo para llevar el voluyo hasta 40 ml en total. Permitir que grandes trozos de alimentación se asienten en el fondo del tubo de 1-2 min. Eliminar el sobrenadante (~ 38 ml) del tubo utilizando una pipeta serológica y depositar en un nuevo tubo cónico de 50 ml. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 190 x g. Eliminar el sobrenadante del tubo usando una pipeta de vidrio y de vacío. Asegúrese de no perturbar el sedimento celular. Resuspender las células en 500 l de 1x PBS. Combinar con solución de transfección del plásmido preparado con anterioridad. Contar las células en este paso. Utilice 5-10 millones de células por electroporación. </li><li> Pipetear toda la suspensión de 800 l en una cubeta de electroporación de 4 mm, colocar en hielo durante 3-5 minutos. Electroporar células utilizando el programa exponencial en el sistema de electroporación con los siguientes parámetros: 250 V, 500 mF, ∞ resistencia, y 4 mm de tamaño de cubeta. Después de la electroporación, coloque la cubeta de nuevo en hielo durante 3 min. Nota: Tenga en cuenta la constante de tiempo de la electroporación en el sistema de electroporación. La constante de tiempovaría con el número de células y la pureza del ADN. Transfecciones exitosos por lo general tienen un tiempo constante entre 10 a 14 ms cuando se utilizan las condiciones mencionadas y un pulsador de genes II. Bajar las eficiencias de electroporación pueden ocurrir cuando constantes de tiempo varía de estos valores. </li><li> Resuspender las células electroporadas en 18 ml cálida hESC medio suplementado con 10 mM Y-27632. Placa 3 ml de esta suspensión de células individuales en cada pocillo de una placa de 6 pocillos con células alimentadoras DR4. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2). </li></ol> 3. Selección de colonias positivas <ol><li> Día 2, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplazar con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. Día 3, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálida sin incluir Y-27632. Día 4, quite todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Reemplace con 3 ml de medio de células madre cálidos suplementado con antibióticos para selectien. Retorno a la incubadora (37 ° C / 5% de CO 2/3% O 2). Nota: El tipo de antibiótico que se usa dependerá de la casete de resistencia incluido en la plantilla de reparación. Cuando se trabaja con WIBR # 3 hPSCs (NIH registro 0079), 0,5 mg / ml de puromicina, 70 mg / ml de G418 (geneticina), y 35 mg / ml de higromicina se han utilizado con éxito. Las concentraciones de la selección deben determinarse empíricamente mediante el establecimiento de la concentración mínima de antibiótico necesaria para matar las células de tipo salvaje en un plazo aproximado de una semana. </li><li> Días 5-12, cambian los medios de comunicación todos los días, en sustitución de los viejos medios cada vez con medios hESC cálidos suplementado con antibióticos. Nota: esperar una gran cantidad de muerte celular. Las colonias individuales se pondrán de manifiesto en torno días 8-10. Medios hESC Regular sin antibióticos se puede utilizar después de 12-14 días de selección continua. Si la densidad celular es alta o la muerte celular es lenta, la acidificación de los medios de comunicación debe ser evitado y que puede ser necesario aumentar las volu mediosme (hasta 4-5 ml) durante los primeros días de la selección. </li></ol> 4. Recoger las colonias seleccionadas (día 12-14) <ol><li> Observe colonias en días 12-14. Observe las colonias que están listos para recoger en un microscopio de disección y asegurarse de que no contienen células que empiezan a diferenciarse. El tamaño aproximado debe ser 800-1.200 M. Si colonias alcanzan este tamaño antes del día 12, se recomienda que deben ser recogidos a continuación. Nota: Para cada experimento dirigido, recoger la mayor cantidad de colonias como sea necesario para asegurar el genotipo deseado se aísla. Como ejemplo, la edición AAVS1 con la plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP ha demostrado consistentemente la integración robusta, y requiere sólo 12-24 colonias para ser recogidos para obtener aproximadamente 5-10 clones heterocigótica dirigidos. Otros experimentos dirigidos pueden requerir más colonias para ser recogidos (Tabla 1). La frecuencia de los eventos de segmentación correcta, depende de factores tales como la eficiencia de la SSN para introducir un OSD, el tamaño de inserción, y la estrategia de selección. En el caso del enfoque de trampa de genes para el locus AAVS1 que aquí se presenta, el marcador de selección sólo se expresa cuando se integra correctamente en el sitio diana, reduciendo el número de colonias requerido para obtener un clon correctamente orientado. </li><li> Un día antes de recoger, preparar placas de 12 pocillos de MEFs (2,4 × 10 6 células / placa, un pozo se utilizarán para cada colonia recogido). </li><li> En el día de la recolección, retire todos los soportes de las placas de 12 pocillos MEF utilizando una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazar con 1 ml de medio de células madre. También el día de la recolección, cambiar los medios de comunicación células madre en las placas de 6 así que van a ser recogidos. </li><li> Tire pipetas de vidrio para la disociación mecánica de colonias individuales de la capa alimentadora. Baje las pipetas sobre un mechero Bunsen en el capó y suavizado en el punto de expansión hasta que el vidrio es maleable. Quitar rápidamente del fuego y tirar la pipeta creando además un punto angular. Rompe elapuntar aproximadamente 2 cm desde el eje doblado, dejando un estrecho canal. Pulir el extremo del canal mediante la exposición a la llama durante 1-2 seg. Nota: Opcionalmente recoger colonias una punta de pipeta p20, sin embargo, esto puede reducir la clonalidad de la cultura, como la punta embotada puede desalojar mayores cantidades de células de cada colonia en los medios de comunicación, potencialmente contaminante cosechas posteriores. </li><li> Montar dispositivo de recogida mediante la adopción de una punta de pipeta filtro p1000 y adjuntando un bulbo de succión al extremo estrecho. Inserte la pipeta de vidrio tirado en el extremo ancho. </li><li> Coloque una placa de 6 pocillos de hPSCs a ser recogido en el escenario de un microscopio de disección montada en una campana de cultivo de tejidos. Comprimir la bombilla del dispositivo de recogida y extirpar con cuidado y cortar una colonia individual en 10-20 piezas de igual tamaño, con cuidado de no soltar piezas en los medios de comunicación. Tome extirpados piezas HPSC de la colonia en la pipeta por la liberación de la bombilla. Trate de tomar tan poco como sea posible los medios de comunicación durante la transferencia. </li><li> Transfer la colonia individual a un solo pocillo de una placa de 12 pocillos MEF, comprimiendo el bulbo de nuevo directamente en el pozo, la liberación de la colonia ahora roto. Etiquete cada pocillo para permitir la identificación única de una sola célula clones derivados. Repita el procedimiento para el mayor número de colonias como sea necesario, el cambio de la pipeta de vidrio cada vez. Nota: Las colonias de la cosecha puede tomar algún tiempo para aprender. Se recomienda que la práctica experimentador en algunas células de control antes de intentar aislar colonias específicas. </li><li> Volver placas de 12 pocillos a la incubadora (37 ° C / 3% O 2/5% de CO 2), meciéndose suavemente la placa primero para evitar la acumulación de las células en el medio de cada pocillo. </li><li> Al día siguiente y cada día subsiguiente, eliminar todo volumen de los medios de comunicación con una pipeta de vidrio y de vacío y reemplazan con 1,5 ml de medio de células madre caliente hasta que las células son aproximadamente el 50% de confluencia (esto tarda generalmente 10-12 días). </li><li> Después de 10-12 días, elegir uno de dos colonias de cada pocillo y transferir a los nuevos 12 pozos placas MEF repeating pasos 4.1 a 4.8 para generar una placa de réplica. </li><li> Extracto de ADN (véase a continuación) a partir de las colonias restantes en cada pocillo de las placas MEF originales. <ol><li> Retire los medios de comunicación de todos los pozos utilizando una pipeta de vidrio y de vacío. Pipeta 1 ml de PBS 1x en cada pozo para lavar las células. Retire PBS con una pipeta de vidrio y de vacío. Pipetear 250 l de tampón de lisis celular (concentraciones finales en H 2 O: Tris HCl 10 mM, EDTA 5 mM, 0,2% de SDS, NaCl 200 mM, 0,08 mg / ml de proteinasa-K) en cada pocillo. Colocar en incubadora (37 ° C / 3% O 2/5% de CO 2) O / N. </li><li> Al día siguiente, los contenidos de cada pocillo de pipeta en tubos de 1,5 ml individuales. Pipetear 250 l de alcohol isopropílico en cada tubo para precipitar el ADN. Agitar el tubo vigorosamente. Un precipitado blanco debe ser visible. </li><li> Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa. Después de la vuelta abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegada al fondo deel tubo. Pipetear 250 l de etanol al 70% en cada tubo para lavar el sedimento de ADN. Agite vigorosamente. Haga girar cada tubo hacia abajo durante 3 minutos a 13.000 rpm en una centrífuga de mesa. </li><li> Después de girar hacia abajo, desechar el sobrenadante por decantación en los residuos líquidos. Un pequeño sedimento de ADN debe permanecer pegado a la parte inferior del tubo. Pipetear a cabo el resto del sobrenadante así que no hay líquido que queda en el tubo. Deja tubo abierto a secar en mesa de trabajo durante 5-10 minutos. Después del secado, resuspender el ADN en tampón TE 250 l. Coloca a 37 ° C durante 6 horas para permitir que el ADN se disuelva. </li></ol></li><li> Genotipo cada muestra utilizando una estrategia de transferencia de pre-optimizado PCR o el sur. Nota:.. Para AAVS1 focalización mediante la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP, la estrategia de transferencia de Southern se puede encontrar en Hockemeyer et al, 2009 4 Un protocolo integral transferencia de Southern se puede encontrar en el sur de 2006 35 Para multiplex PCR genotipificación de. el mismo experimento, cebadores y condiciones pueden serencontrado en la Tabla 2 36. </li><li> Deseche los pozos que no están adecuadamente dirigidos y continuar cambiando los medios de comunicación células madre en células adecuadamente dirigidos todos los días. Congele por las células cuando son aproximadamente el 50% de confluencia, ver más abajo para la congelación de protocolo. <ol><li> Un día antes de la congelación, cambiar de medios de células madre, la eliminación de los viejos medios de comunicación y la adición de los medios de comunicación de células madre cálidos suplementado con 10 mM Y-27632. </li><li> En el día de la congelación preparar 0,5 ml cada una de solución A y la solución B por pocillo de una placa de 12 pocillos que se está congelado en dos tubos cónicos de 15 ml. Soluciones Coloque sobre hielo. Solución A: 50% de células madre medios de comunicación y el 50% de SFB; Solución B: 80% de FBS y 20% dimetilsulfóxido (DMSO). </li><li> Disociar colonias HPSC en células individuales antes de la congelación. Siga los pasos 2.2-2.8 para hacer esto, escalando volúmenes en consecuencia. Sedimento celular totalmente resuspender en 0,5 ml de solución A. </li><li> Añadir 0,5 ml de solución B a la suspensión de células, la pipeta hacia arriba y abajo para que la suspensión celular homogénea. Take el volumen total de la suspensión de células (~ 1 ml) y depositar en un criotubo 2 ml. Tornillo tapa firmemente. </li><li> Lugar criotubo en un congelador a -80ºC O / N. El día después de la congelación, a eliminar las células congeladas de -80 ° C congelador y colocar inmediatamente en el tanque de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

El método que aquí se presenta para el aislamiento de poblaciones homogéneas de células madre pluripotentes humanos de genes-editado es un enfoque poderoso para la generación de líneas isogénicas HPSC que se diferencian sólo en el locus diana. Estas células son un sistema ideal para sondear los mecanismos de la diferenciación celular y el desarrollo humanos, así como para la comprensión de la fisiopatología de las enfermedades monogénicas en un entorno genético controlada. Como se ha demostrado aquí, es posible utilizar independientes tres estrategias de diseño SSN (ZFNs, Talens, y CRISPR / Cas9) para lograr la integración dirigida en el locus AAVS1. Cada una de estas metodologías tiene sus propias ventajas y desventajas. Una ventaja potencial de ZFNs y, en cierta medida, Talens es su flexibilidad de diseño, lo que permite la ingeniería iterativo con el fin de mejorar los dominios de nucleasas individuales 42 de unión a ADN. Esta optimización nucleasa podría aumentar la especificidad de ZFNs y Talens más allá de lo que se puede lograr con el CRISistema de SPR / Cas9. Tal selectividad puede ser importante para aplicaciones clínicas que requieran un alto grado de especificidad de diana. La ventaja principal del sistema / Cas9 CRISPR es su facilidad de uso. Aunque kits de construcción TALEN y ZFN se han puesto a disposición del público (es decir, a través de Addgene 21), / SSN basados ​​Cas9 CRISPR son significativamente más fáciles de construir, como la única personalización necesaria es un par de oligonucleótidos 20 base (cuando se utiliza el plásmido px330 diseño de 14). Esta simplicidad resulta ser ventajoso para los laboratorios de investigación que buscan incluir la edición genoma en sus estudios. Hay técnicas de transfección alternativos, incluyendo nucleofection 43, para crear genes editado HPSC líneas; Sin embargo electroporación ha demostrado ser eficaz 4,5,25 consistente y costo. Nucleofection se puede utilizar para transfectar directamente Cas9-guía complejos de ribonucleoproteínas ARN en el núcleo, el aumento de la eficiencia SSN unad fidelidad 44. Creciendo hPSCs en MEFs es un método robusto y de bajo costo para mantener hPSCs en un estado pluripotente sin diferenciación excesiva. Además, permite el fácil aislamiento de colonias genéticamente idénticos. Alternativamente, es posible hPSCs de cultivo sin MEFs, sin embargo estas condiciones de cultivo pueden ser más caros que los cultivos basados ​​alimentadoras. Además, todo el proceso es escalable, lo que permite el aislamiento de edición de eventos muy raros o la generación de muchas líneas celulares distintas en experimentos paralelos de edición. El protocolo descrito aquí es robusto; sin embargo, hay varios pasos clave que afectan a la eficiencia con la que clones editado correctamente se pueden obtener. El componente más crítico para este método es que tiene MEFs de alta calidad y resistentes MEFs DR4 drogas. La supervivencia de hPSCs individuales es tenue, y MEFs baja calidad impedirá el aislamiento de líneas diferenciadas HPSC. En segundo lugar, el uso de Y-27632 es tambiénclave para permitir solo la supervivencia celular sin generar una presión selectiva para las células con un cariotipo anormal 45. En tercer lugar, recogiendo colonias bien espaciadas garantiza homogeneidad genética de las líneas celulares derivadas. Finalmente, es importante preparar pipetas de vidrio de modo que la abertura es lo suficientemente pequeño para romper la colonia en muchos pedazos más pequeños, asegurando que múltiples colonias crecerán en el nuevo pozo. Esto permite la recogida de subclones bien espaciadas para una placa de réplica para tener en la cultura, dejando la placa original de colonias aisladas para el genotipado. Una parte difícil en este protocolo es el manual tirando de las pipetas de vidrio; esta debe ser practicado de antemano. Cabe señalar que existen múltiples técnicas de picking clon que no requieren una pipeta de vidrio. Se anima a los experimentadores para encontrar el que funciona mejor para ellos. Existen limitaciones a este protocolo que puede ser superado por modificaciones sencillas. Un experimento destinado a oólo perturbar el lugar de interés sin reparación o aquel cuya reparación plantilla no contiene un casete de selección, debe utilizar otro método de enriquecimiento para las células que fueron editadas. Tenga en cuenta que el número de colonias que deben ser recogidos para encontrar un clon positivo aumenta en gran medida en ausencia de selección. Una estrategia para mejorar la eficiencia es para co-transfectar un plásmido no integrador que expresa una proteína fluorescente. Después de permitir que las células se recuperen durante dos días, las células diana pueden ser ordenados en la fluorescencia positiva utilizando fluorescencia de clasificación de células activadas y replated 29. Este proceso enriquece para células que han sido transfectadas con los plásmidos por electroporación y por lo tanto aumenta la probabilidad de un evento de edición concurrente en la célula. Las técnicas descritas aquí se pueden extender para utilizar varios RNAs guía para orientar de forma simultánea varios 14,46,47 loci. Muchos protocolos se han establecido para diferenciar hPSCsen distintos tipos de células, lo que permite varias manipulaciones genéticas en los tipos de células de interés 30. En general, hemos demostrado el potencial para la edición genoma eficientes en hPSCs independientemente de la elección SSN. Proponemos que esta técnica se puede adaptar para crear líneas isogénicas HPSC que han sido editados-gen en cualquier locus genómico.

Tecnologías de edición Genoma están evolucionando rápidamente en herramientas estándar de biología molecular y celular 1. La ingeniería genética de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) es de particular interés ya hPSCs representan una fuente de auto-renovación de células humanas primarias genéticamente intactos. hPSCs pueden diferenciarse en diversos tipos de células para el modelado de la enfermedad o como una fuente para las terapias de trasplante de 2,3. Ha demostrado aquí es un protocolo que utiliza tres tipos diferentes de nucleasas específicas de sitio (SSN) en conjunción con los mecanismos de reparación del ADN endógeno para la integración dirigida de un constructo indicador en el locus AAVS1. Después de la transfección de los SSN en hPSCs, demostramos cómo aislar poblaciones de células isogénicas albergar el reportero. La capacidad de manipular genomas, específicamente los genomas de células madre pluripotentes, utilizando los SSN no es un nuevo fenómeno como la utilidad de nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) y activat transcripciónnucleasas efectoras o similares (Talens) para la edición de genes se demostró hace varios años 4-10. Sin embargo, con el advenimiento de S. pyogenes CRISPR / tecnología Cas9 11-13 de la edición gen se ha convertido en ampliamente accesible 14. Todos los números de Seguro Social introducen una ruptura del ADN de doble cadena (DSB) en el sitio 1,4,5,11 destino especificado que está reparado por mecanismos celulares endógenos usando reparará extremo de unión (NHEJ) u homología dirigida no homóloga (IDH) 15. NHEJ es propenso a errores y se puede introducir mutaciones cambio de marco resulta en la pérdida de la función génica, mientras HDR permite nuevos elementos para ser introducidos a través de la co-transfección de una plantilla de reparación con el SSN. Mientras que los principios subyacentes de la reparación del ADN que facilitan la edición gen se cree que son en gran parte los mismos para cada SSN, algunas diferencias entre las plataformas pueden tenerse en cuenta. De novo diseño de ZFNs permite la flexibilidad y la nucleasa de optimización 16, sin embargo el uso de públicamentebibliotecas de montaje disponibles y herramientas de evaluación para diseñar ZFNs individuales pueden llevar mucho tiempo. Una vez determinado el lugar deseado para la orientación mediada por ZFN, pares ZFN pueden ser diseñados con la herramienta en línea ZiFit 17. Después de diseño, ZFNs se puede montar de forma modular a través de varias rondas de clonación plásmido 18. Alternativamente, hay muchas ZFNs disponibles comercialmente, pre-validado 19. Nucleasas TALE también pueden ser diseñados utilizando herramientas en línea y componentes disponibles públicamente 17,20. Por ejemplo, Talens se puede montar rápidamente de bloques de cinco repeticiones TALE, a través del conjunto FLASH 21 o el uso conjunto de la puerta de oro de PCR basada jerárquica 22. Facilidad de diseño SSN y la velocidad de la construcción utilizando CRISPR / Cas9 han hecho genoma editar una herramienta ampliamente accesible. La guía breve orientación ARN mediada de CRISPR / Cas9 también permite la multiplexación de los ARN de guía para orientar varios loci con una única construcción 14. El diseñoCas9 para la edición de gen sólo requiere la identificación de un motivo adyacente protospacer (PAM; un trinucleótido NGG para S. pyrogenes Cas9) proximal para el locus diana. Mediante la inserción de un oligonucleótido que corresponde a los pares de bases 20 5 &#39;de la PAM en el plásmido px330 14, el constructo se puede montar en un solo paso de clonación. Además de S. pyogenes Cas9, Cas9 de N. meningitidis (NmCas9) que reconoce a &#39;(PAM) 5&#39;-NNNNGATT-3 se ha demostrado para permitir la eficiente gen de edición en hPSCs 23. Además de las diferencias en la facilidad de diseño SSN, cada plataforma tiene propiedades específicas. Por ejemplo, ZFNs y Talens utilizan el dominio nucleasa FokI, que genera una de cuatro nucleótidos 5 &#39;voladizo 24, mientras que Cas9 se piensa sobre todo para generar embotar DSBs terminado. ZFNs, Talens, y Cas9 difieren en sus estabilidades de proteína, la tasa de encendido y apagado en el ADN objetivo, y el modo de exploración de ADN, todos los cuales could teóricamente dar lugar a pequeñas diferencias en el resultado de edición 1. Aunque se necesitan más estudios para comprender plenamente las consecuencias de estas diferencias, se describe aquí un protocolo que es muy robusto en las tres plataformas y se puede utilizar para generar fácilmente hPSCs modificados genéticamente. Independientemente de la opción SSN, electroporación es un procedimiento robusto para transfectar SSN y plantillas de reparación de homología en hPSCs 25. El número de colonias supervivientes después de la selección para la resistencia a los antibióticos depende de los parámetros específicos de locus y la estrategia de edición (por ejemplo, el tamaño del inserto transgénico y el modo de selección). El protocolo descrito aquí por lo general se traduce en unos 150 a 400 colonias de células individuales derivados. Gen-editando en el locus AAVS1 usando este protocolo se ha utilizado anteriormente para demostrar la eficacia de los SSN 4,5. La plantilla de reparación de AAV-CAGGS-EGFP utiliza una trampa de genes strategia para conferir resistencia a puromicina de una manera específica locus. Brevemente, la plantilla de reparación contiene un sitio aceptor de empalme aguas arriba de la casete de resistencia a puromicina sin promotor. Tras la integración correcta en el primer intrón del gen PPP1R12C en el locus AAVS1, la casete de resistencia se expresa a partir del promotor del gen editado. La solidez de este ensayo AAVS1 específica nos permite comparar la eficiencia de cada plataforma SSN. Edición de genes usando números de seguro social es de gran alcance, dada la capacidad de alterar y / o modificar teóricamente cualquier gen. La aplicación de esta estrategia para hPSCs ofrece versatilidad como hPSCs pueden diferenciarse posteriormente en una multitud de tipos de células humanas tales como las neuronas 26, hepatocitos 27, 28 y cardiomiocitos. Además, el uso de células madre pluripotentes inducidas derivados del paciente permite la reparación o la introducción de mutaciones causantes de enfermedad conocidos en un fondo genético específico del paciente 29 </sup&gt;, Proporcionando una plataforma para investigar mecanismos de la enfermedad y la terapéutica de prueba utilizando las propias células del paciente 30. En resumen, la edición de genes en hPSCs es un enfoque eficiente y versátil para la investigación de la biología básica del desarrollo humano y la enfermedad 31.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320082</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (HI)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Suero knockout</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos - básico</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Pluma/Estreptococo</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Calbiochem</td><td>688000</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 12 pocillos</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>4 mm Cubetas de electroporación</td><td>Bio-rad</td><td>165-2081</td><td></td></tr><tr><td>X-cel gene pulsador II</td><td>Bio-rad</td><td>165-2661</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>10&times; Solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH7.4&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Life Technologies</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur, taponadas</td><td>VWR</td><td>14672-412</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5941</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa-K</td><td>Life Technologies</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>TX89125-172SFU</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>VWR</td><td>MK303216</td><td></td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>12090-015</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>1.8 ml Tubos criogénicos</td><td>ThermoScientific</td><td>377267</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de editados-genoma humano pluripotentes líneas de células madre: de focalización de aislamiento

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genoma de edición de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) proporciona una plataforma controlada genéticamente y clínicamente relevante de la que para comprender el desarrollo humano e investigar la fisiopatología de la enfermedad. Mediante el empleo de nucleasas específicas del lugar (SSN) para la edición del genoma, la rápida derivación de nuevas líneas HPSC albergan alteraciones genéticas específicas en un entorno de lo contrario isogénico se hace posible. Zinc dedo nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas tipo activador efectoras (Talens) y agrupados espaciadas regularmente repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) / Cas9 son los números de seguro social más utilizados. Todas estas nucleasas funcionan mediante la introducción de un descanso de ADN de doble cadena en un sitio determinado, promoviendo así la edición gen precisa en un locus genómico. Edición genoma meditado-SSN explota dos de los mecanismos de las células endógenas de reparación del ADN, de extremos no homólogos de unión (NHEJ) y homología de reparación dirigido (IDH), ya sea a introducir de inserción / deleción mutaciones o alter el genoma utilizando una plantilla de reparación homóloga en el sitio de la rotura de doble cadena. Electroporación de hPSCs es un medio eficaz para la transfección de números de Seguro Social y las plantillas de reparación que incorporen transgenes tales como reporteros fluorescentes y casetes de resistencia a antibióticos. Después de la electroporación, es posible aislar sólo aquellos hPSCs que incorporaron el constructo de reparación mediante la selección para la resistencia a los antibióticos. Para separar mecánicamente colonias HPSC y confirmando la integración adecuada en el sitio diana a través de genotipado permite el aislamiento de líneas celulares correctamente orientadas y genéticamente homogéneos. La validez de este protocolo se demuestra aquí utilizando las tres plataformas SSN incorporar EGFP y una resistencia a puromicina construyen en el locus puerto seguro AAVS1 en células madre pluripotentes humanas.

Aquí se demuestra un protocolo compatible con tres plataformas SSN diferentes para crear por ingeniería genética líneas HPSC. Nos enfocamos WIBR # 3 células madre de embriones humanos en el locus AAVS1 usando ZFNs publicados anteriormente 4, 5 y Talens CRISPR / Cas9s 37 utilizando una plantilla de reparación que introduce un reportero EGFP y un casete de resistencia a puromicina 4. Nosotros cultivamos nuestros hPSCs en MEFs para un flujo de trabajo de cultivo celular que permite el mantenimiento y expansión de hPSCs no diferenciadas (Figura 2), que también es rentable y escalable. Si las células se cultivan más de lo necesario, existe el riesgo de un aumento de la diferenciación, lo que reduce el número de células pluripotentes que se transfecta y en consecuencia el número de colonias HPSC correctamente orientados obtenidos. Nos electropcorporado 5.0 x 10 6 células por plataforma SSN y chapado en las células de cada objetivo en una sola placa de 6 de DR4 MEFs. Después de la selección, cada plataforma resultó en colonias EGFP-positivas (Figura 3) y una combinación de clones no focalizados, homocigótica y heterocigótica específicas dirigidas (Figura 4A, B, Tabla 3). En las condiciones que se presentan aquí, nos encontramos con que la AAVS1 Talens resultó en la mayoría de los clones EGFP-positivas. La plantilla de reparación utilizado para este experimento consiste en un sitio aceptor de empalme aguas arriba del casete reportero y resistencia a la puromicina EGFP. Usando esta estrategia &quot;gen-trampa&quot; (Figura 1), el constructo debe insertar en el primer intrón del locus AAVS1, utilizando el promotor endógeno para conducir la expresión del casete de resistencia a puromicina. La falta de un promotor que dirige la expresión del gen de resistencia a puromicina dentro de la plantilla de reparación debe evitar la expresión en el<html> evento de integración aleatoria. Por lo tanto, esperamos que todos los clones resistentes a la puromicina se destinarían en el sitio AAVS1. Cabe señalar que un subconjunto de clones llevar integraciones aberrantes en el locus AAVS1 que son detectables por Southern blot utilizando una sonda interna, pero no por la mayoría de las estrategias de PCR (Figura 1; Figura 4C) 4. Estos eventos de integración son muy probablemente el resultado de acontecimientos dirigidos heterólogos que conducen a múltiples integraciones del plásmido donante 4. Escogimos 24 colonias de cada experimento SSN y encontró que todas las plataformas tuvieron eficiencias muy altas de focalización y mostraron sólo diferencias mínimas. Como interrogado por PCR, CRISPR / Cas9 dado los clones más correctamente dirigida, mientras que la plataforma TALEN tenía los clones más homocigóticamente específicas (Tabla 3). /files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 700 &quot;/&gt; Figura 1. Esquema del gen editado locus AAVS1 utilizando la plantilla de reparación AAV-CAGGS-EGFP. Modificado de Hockemeyer et al., 2009. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. Las colonias de células WIBR # 3. Imágenes de campo claro representativos de colonias de WIBR # 3 células madre de embriones humanos antes de la orientación. Tenga en cuenta la falta de diferenciación y la clara separación de la capa de alimentación en una colonia de ideales (izquierda) frente a uno no ideal (derecha). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. EGFP-positivas WIBR # 3 células. Imágenes representativas de WIBR # 3 células diana con una plantilla de reparación EGFP-expresión en el locus AAVS1. Imágenes de colonias representativas editadas con ZFNs, Talens y CRISPR / Cas9 se muestran. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. estrategias de genotipado para confirmar la orientación correcta. (A) genotipo resultados Representante de PCR que muestran clones específicos focalizados, heterocigotos y homocigotos en las tres plataformas SSN. WT CTL = control de tipo salvaje. (B) Repreresultados Southern blot representativas que muestran un heterocigoto dirigida clon y un clon objetivo homocigotos detectó con sonda externa a 3 &#39;. Tamaños de los fragmentos: WT-6,5 kb, Editado-6,9 kb. (C) Resultados de Southern blot representativo que muestra un clon correctamente editado y un clon heterocigoto con un doble integración no aleatoria. Tamaños de los fragmentos:. Correctamente editados-6,9 kb, aberrante adicional integración-5 kb <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53583/53583fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Estudiar </td><td> Gen diana </td><td> Plataforma </td><td> Reparación tipo de plantilla </td><td> Nº de clones recogidos </td><td> Eficiencia Orientación </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> TPP1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td&gt; <td> no declarada </td><td> no declarada </td></tr><tr><td> Sexton et al., 2014 </td><td> De TERT </td><td> ZFN </td><td> Higromicina </td><td> no declarada </td><td> no declarada </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> POU5F1 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 31 </td><td> 39,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2009 </td><td> Pitx3 </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> 74 </td><td> 14,9% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> POU5F1 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 68 </td><td> 91,0% </td></tr><tr><td> Hockemeyer et al., 2011 </td><td> Pitx3 </td><td> TALEN </td><td> GFP-Puro </td><td> 96 </td><td> 13,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> VASA </td><td> Cas9 </td><td> Reportero-Geneticina </td><td> 139 </td><td> 94,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al. &lt;/ em&gt;, 2015 </td><td> CRH </td><td> Cas9 </td><td> Reportero-Geneticina </td><td> 30 </td><td> 93,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HCRT </td><td> Cas9 </td><td> Reportero-Geneticina </td><td> 154 </td><td> 92,0% </td></tr><tr><td> Merkle et al., 2015 </td><td> HMX2 </td><td> Cas9 </td><td> Reportero-Geneticina </td><td> 11 </td><td> 45,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Nterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> no declarada </td><td> 30,0% </td></tr><tr><td> Forster et al., 2014 </td><td> LRG5-Cterm </td><td> ZFN </td><td> GFP-Puro </td><td> no declarada </td><td> 14,0% </td></tr><tr><td> Soldner et al., 2011 </td><td> SNCA </td><td> ZFN </td><td> Puro </td><td> 96 </td><td> 1,0% </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Descripción de otros genes dirigida utilizando este método, con correcorres- focalización eficiencia tomadas de estudios publicados anteriormente. 4,5,38-41 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Lugar </td><td> Secuencia </td><td> Notas </td></tr><tr><td> AAVS1-F imprimación </td><td> CTCTAACGCTGCCGTCTCTC </td><td> Las condiciones de PCR: T m = 57 ° C, 35 ciclos </td></tr><tr><td> AAVS1-WT-R imprimación </td><td> GCTTCTCCTCTTGGGAAGTG </td><td> Banda WT: 1.273 pb </td></tr><tr><td> AAVS1 Targeted-R-imprimación </td><td> CGTCACCGCATGTTAGAAGA </td><td> Banda dirigida: 992 pb </td></tr><tr><td> T2-Cas9-guía </td><td> GGGCCACTAGGGACAGGAT </td><td> Malí et al., 2013 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Derecha </td><td> TAGGGACAGGAT </td><td> De Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-ZFN-Izquierda </td><td> TGGGGTGTCACC </td><td> De Hockemeyer et al., 2009 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Derecha </td><td> TCCTAACCACTGTCTTT </td><td> De Hockemeyer et al., 2011 </td></tr><tr><td> AAVS1-TALEN-Izquierda </td><td> CCCCTCCACCCCACAGT </td><td> De Hockemeyer et al., 2011 </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Lista de cebadores y SSN secuencias de direccionamiento. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Orientación Construir </td><td> Número de EGFP + Colonias </td><td> Clones recogidos focalizados (PCR verificado) </td><td> Anterior Reportado Eficiencia focalización correcta (por Southern blot) </td></tr><tr><td> ZFN </td><td> 150 </td><td> 86,9% (73,9% het / 13,0% homo) </td><td> 56% (50% het / 6% homo) </td></tr><tr><td> TALEN </td><td> 412 </td><td> 91,3% (47,8% het / 39,1% homo) </td><td> 47% (37,5% het / 9,3% homo) </td></tr><tr><td> CRISPR-Cas9 </td><td> 235 </td><td> 95,7% (69,5% het / 26,3% homo) </td><td> no declarada </td></tr></tbody></table> Tabla 3. números comparativos de EGFP-positivas y dirigidos TALEN, ZFN y CRISPR / colonias de células madre humanas Cas9. PCR verifican integraciones en el locus AAVS1 para este experimento se comparan con Southern blot verificado integraciones individuales adecuadas en experimentos anteriores 4,5.

La edición del genoma de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) se puede realizar de forma rápida y eficiente. Aquí se presenta un procedimiento experimental robusto para la ingeniería genética de hPSCs, como se ejemplifica mediante la edición del locus de puerto seguro AAVS1 para expresar EGFP e introducir resistencia a los antibióticos.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar ingeniería genética en células madre pluripotentes humanas utilizando tecnología moderna de edición del genoma. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre la biología de las células madre, también puede aplicarse para facilitar la modelización de enfermedades humanas en un entorno genéticamente definido. Por lo general, las personas nuevas en este método necesitarán practicar el aislamiento de colonias antes de alcanzar la pericia.La demostración visual de este método es esencial, ya que la identificación y selección de colonias puede ser difícil. Comience por cultivar células madre pluripotentes humanas en medio hESC en una placa de seis pocillos que contenga fibroblastos embrionarios de ratón inactivados con mitomicina C, o células alimentadoras MEF cultivadas sobre gelatina. Cada día posterior al siembra, hasta que las células hPSC alcancen una confluencia del 50 %, utilice una pipeta de vidrio y vacío para retirar todo el volumen del medio.Sustituya con tres mililitros de medio para hESC tibio por pocillo. Un día antes de la edición, retire el medio para hESC y agregue medio fresco precalentado para hESC suplementado con 10 micromoles de Y-27632. Además, prepare de una a dos placas de seis pocillos de células alimentadoras MEF resistentes a fármacos procedentes de ratones DR4.En el día del direccionamiento, prepare las soluciones de transfección pipeteando cinco microgramos del plásmido de expresión de nucleasa con dedos de zinc 1 y 2, del plásmido de expresión TALON 1 y 2, o 15 microgramos del plásmido que codifica CRISPR cas9 px330, en un tubo de 1,5 mililitros. Añada 30 microgramos del plásmido donador reparado, seguido de suficiente solución salina tamponada con fosfato 1x para llevar el volumen a 300 microlitros. Inspeccione las células bajo el microscopio para asegurar una confluencia del 50 %.A continuación, utilice una pipeta de vidrio y vacío para retirar el medio del pocillo de hPFC, luego lave las células con 2 mililitros de PBS 1x tibio. Después de aspirar el PBS, agregue cero punto cinco mililitros de solución de tripsina-EDTA al 0,25 % directamente sobre las células. Incube en el incubador de cultivo tisular durante aproximadamente 10 minutos, o hasta que la capa de alimentación comience a desprenderse del pocillo.Después de la incubación, agregue dos mililitros de medio de lavado tibio para células ES en cada pocillo para detener la reacción de tripsina. Recoja las células de cada pocillo, asegurándose de que las células alimentadoras se desprenda en una lámina. Pase el contenido de cada pocillo a un solo tubo cónico de 50 mililitros, combinando todos los pocillos, y triture las células utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros.Añada medio de lavado de ES para llevar la suspensión celular a 40 mililitros. Espere uno o dos minutos para permitir que los fragmentos grandes de células alimentadoras se sedimenten en el fondo del tubo, luego retire el sobrenadante utilizando una pipeta serológica y depósitelo en un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular durante cinco minutos a 190 ×g, aspire el sobrenadante sin perturbar la pastilla celular.Re-suspenda las células en 500 microlitros de PBS 1x. Combine las células re-suspendidas con la solución de transfección preparada anteriormente. Pase mediante pipeta la mezcla de células y transfección a una cubeta de electroforesis de cuatro milímetros y colóquela en hielo durante tres a cinco minutos.Configure los parámetros del programa exponencial en el sistema de electrotransferencia a 250 voltios, 500 microfaradios, resistencia infinita y tamaño de cubeta de cuatro milímetros. Electrotransfiera las células y luego coloque la cubeta nuevamente en hielo durante tres minutos. Resuspenda las células electrotransferidas en 18 mililitros de medio para hESC tibio, suplementado con 10 micromoles de Y-27632.Inspeccione los MEF DR4 bajo un microscopio. Siembre tres mililitros de la suspensión de células individuales en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga células alimentadoras DR4, y devuélvala al incubador. Al tercer día después del siembra, sustituya el medio celular por medio hESC sin Y-27632.El día cuatro, reemplace el medio sin suplementar por medio que contenga el antibiótico de selección adecuado. Aquí se utiliza puromicina. El día anterior a la selección de colonias, prepare una placa de 12 pocillos con células alimentadoras de MEF por cada colonia que se vaya a seleccionar.El día 12 después del siembra, examine la placa bajo un microscopio de disección. Identifique colonias de 800 a 1.200 micrones de diámetro que estén listas para ser seleccionadas. Asegúrese de que esas colonias no contengan células que estén comenzando a diferenciarse, como la que se muestra aquí.Además, asegúrese de que las células estén expresando GFP. El día de la selección, inspeccione los MEF bajo el microscopio para verificar que se encuentren sanos. Retire todo el medio de las placas de células alimentadoras MEF y reemplace con un mililitro de medio hESC.Además, cambie el medio de las cÉPS en las placas de seis pocillos de cPSC que se van a seleccionar. A continuación, prepare pipetas de vidrio para la selección de colonias. Para seleccionar colonias, primero coloque la placa de cPFC sobre la plataforma del microscopio de disección dentro de la cabina de cultivo celular, y arme el dispositivo de selección introduciendo el extremo de la pipeta de vidrio en la perilla de succión.Identifique la colonia que se va a seleccionar y coloque la punta de la pipeta de vidrio estirada sobre la colonia. A continuación, comprima la perilla del dispositivo de selección para excavar y cortar suavemente una colonia individual en 10 a 20 fragmentos de tamaño uniforme. Luego, aspire los fragmentos excizados de la colonia dentro de la pipeta liberando la perilla.Intente tomar la menor cantidad posible de medio durante la transferencia. Presione la perilla para transferir la colonia ahora rota directamente a un pocillo de una placa de 12 pocillos con células alimentadoras MEF. Etiquete cada pocillo para permitir la identificación única de los clones derivados de célula única.Cambie la pipeta de vidrio y repita el procedimiento para la siguiente colonia. Devuelva las placas al incubador y agite suavemente las placas para dispersar las células en el pocillo. Al día siguiente, retire todo el volumen del medio y reemplácelo con un punto cinco mililitros de medio para hESC tibio.Repita durante 10 a 12 días hasta que las células alcancen una confluencia del 50 %. Después de 10 a 12 días, examine las células hESC bajo el microscopio. Seleccione una o dos colonias de cada pocillo y transfiéralas a nuevas placas de 12 pocillos con células alimentadoras MEF para generar una placa réplica.Extraiga ADN de las colonias restantes en cada pocillo de las placas originales para genotipificación mediante PCR o hibridación Southern. Tres células madre embrionarias humanas fueron dirigidas al locus AAVS1 utilizando nucleasas específicas de sitio y una plantilla de reparación para introducir un reportero EFFP y un casete de resistencia a la puromicina. Estas imágenes representativas muestran colonias editadas con nucleasas de dedos de zinc, TALENs y CRISPR/Cas9.Estos resultados representativos de genotipificación por PCR muestran clones no dirigidos, heterocigotos y homocigotos dirigidos utilizando nucleasas de dedo de zinc, TALENs y CRISPR/Cas9, junto con un control de tipo silvestre. Esta tabla muestra las integraciones verificadas por PCR en el locus AAVS1 para cada nucleasa específica de sitio en este experimento, en comparación con las integraciones únicas adecuadas verificadas por hibridación Southern en experimentos previos. CRISPR-Cas9 produjo el mayor número de clones correctamente dirigidos, mientras que la plataforma TALEN presentó el mayor número de clones dirigidos de forma homocigota.Una vez dominada, esta técnica requiere de tres a cinco horas de trabajo práctico, y se pueden obtener células editadas en aproximadamente tres semanas a partir del inicio de los experimentos. Es muy importante trabajar de forma segura con esta técnica y utilizar técnicas estériles en todo momento. Tras la manipulación genética, se puede observar cómo afecta a otros tipos de células mediante la diferenciación de células madre en otros tipos celulares, como neuronas.El desarrollo de este protocolo allanó el camino para que los investigadores utilicen la edición del genoma en células madre pluripotentes humanas para establecer modelos de enfermedades in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la edición del genoma en células madre pluripotentes humanas.

establishment-genome-edited-human-pluripotent-stem-cell-lines-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se presenta un protocolo para la reprogramación eficiente de las células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) utilizando vectores retrovirales que codifican Oct3 / 4, Sox2, Klf4 y c-myc (OSKM) y la identificación de hiPSC correctamente reprogramado por tinción en vivo con Tra- 1-81 anticuerpo.

Selección y aislamiento de las colonias de humanos células madre pluripotentes inducidas a partir de fibroblastos adultos Reprogramado

Este video demuestra una técnica de edición del genoma basada en nucleasas de dedos de zinc en células madre pluripotentes humanas (hPSCs). Dado que las hPSC pueden diferenciarse potencialmente en varios tipos de células, esta tecnología es útil para estudios patológicos y farmacológicos in vitro de manera específica para cada paciente.

Edición del genoma basada en nucleasa de dedos de zinc: una técnica para modificar el genoma en células madre pluripotentes humanas mediante un mecanismo de reparación dependiente de la homología de doble cadena

Líneas celulares Reporter ofrecen un medio para visualizar, controlar y aislar las células de interés por parte de las poblaciones heterogéneas. Sin embargo, gen de la orientación mediante recombinación homóloga convencional en células madre de embriones humanos es extremadamente ineficiente. Aquí se describe la orientación del SNC locus cerebro medio específico Pitx3 factor de transcripción con EGFP usando nucleasa dedo de zinc mejorado recombinación homóloga.

Nucleasa dedo de zinc-gen mejorada en células madre embrionarias humanas

Describimos un protocolo para derivar células madre pluripotentes inducidas humanas basadas en lentivirales, reprogramadas y caracterizadas, y convertirlas en condiciones putativas de grado clínico.

Derivación y caracterización de un transgen libre Humano madre pluripotentes inducidas Línea Celular y Conversión en condiciones definidas de calidad clínica

La edición génica mediada por TALEN en el locus AAVS1 de puerto seguro permite la adición de transgenes de alta eficiencia en iPSCs humanas. Este protocolo describe los procedimientos para la preparación de iPSCs para TALEN y la administración de vectores donantes, la transfección de iPSCs y la selección y aislamiento de clones de iPSC para lograr la integración dirigida de un gen GFP para generar líneas reporteras.

La transfección, selección y Colonia-cosecha de células madre humanas pluripotentes inducidas TALEN dirigidos con un gen GFP en el puerto seguro AAVS1

Aquí se presenta un método de edición gen rápida y eficiente basado en RMCE en el locus de AAVS1 humanas pluripotentes células madre (hPSCs) que mejora los sistemas anteriormente descritos. Usando esta técnica, líneas isogénicas se pueden generar rápida y fiable para los estudios comparativos adecuados, facilitar la investigación transgénesis mediada con hPSCs.

Generación rápida y eficiente de las células madre pluripotentes recombinante humana mediada por la recombinasa Cambio en el cassette<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Se describe aquí es un protocolo para etiquetar endógeno expresado proteínas con las etiquetas fluorescentes en las células de vástago humanas pluripotentes inducidas mediante CRISPR/Cas9. Células supuestamente editadas se enriquecen con clasificación de celda de fluorescencia activada y se generan líneas de células clonales.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

Aprende a editar el genoma de células madre pluripotentes humanas mediante electroporación y selección con antibióticos. Este protocolo permite modelar enfermedades humanas con precisión genética en un contexto controlado.

Establecimiento de editados-Genoma Humano pluripotentes Líneas de Células Madre: De Focalización de Aislamiento

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