Name: Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Scopri la dissezione optogenetica ex vivo dei circuiti della paura nel cervello utilizzando fette acute e patch-clamp. Questo metodo consente di analizzare le proprietà sinaptiche con precisione spaziale e temporale.

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Ringraziamo Cora Hübner e Andrea Gall per l'aiuto nell'acquisizione di alcuni dei risultati rappresentativi. Questo lavoro è stato sostenuto dal Werner Reichardt Centre for Integrative Neuroscience (CIN) dell'Università di Tubinga, da un'iniziativa di eccellenza finanziata dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) nell'ambito dell'Excellence Initiative (EXC 307) e da fondi della Charitable Hertie Foundation.

dichiarazione etica: Tutte le procedure sperimentali erano in conformità con la direttiva UE sulla uso di animali nella ricerca e sono stati approvati dalla cura degli animali locali e del Comitato Usa (Regierungspräsidium Tuebingen, stato di Baden-Württemberg, Germania) responsabile per l&#39;Università di Tubinga. 1. procedura di iniezione stereotassica <ol><li> Preparare strumenti sterili (forbici, bisturi, pinze, trapano, aghi, materiale di sutura) utilizzando uno sterilizzatore. Disporre strumenti sterili e altre soluzioni necessarie e le forniture di chirurgia quali swap sterili di cotone, disinfettante, sterile tampone fosfato (PBS, pH 7,4), e H 2 O 2 su un telo chirurgico sterile. </li><li> Tirare micropipette di vetro per iniezioni (Figura 1A, inserto) con 3 mm di larghezza scatola filamento su un microelettrodo orizzontale estrattore secondo le istruzioni del produttore. Nota: Per le iniezioni in profondità, il cono elettrodo dovrebbe essere sufficientementelungo per raggiungere le ventrali maggior parte delle coordinate (circa 5 mm. per le coordinate, vedi 1.10). </li><li> Premix 1 ml di soluzione di virus e 0,2 ml di 0,1% soluzione verde veloce in PBS sterile (per una migliore visibilità della soluzione nel pipetta di vetro). Riempire pipette di vetro con la miscela di soluzione di virus e verde veloce con una pipetta microlitro con una punta fine (Figura 1A, nel riquadro). Nota: Lavorare con ricombinanti vettori virali adeno-associati (rAAV) è considerato livello di biosicurezza 1 (BSL 1) il lavoro e deve essere eseguita in un BSL 1 laboratorio. rAAVs utilizzati in questo studio (Figura 1C) sono stati: 1) mPFC: rAAV-hSyn-ChR2 (H134R) -eYFP (sierotipo 2/9) 16; 2) MGM / PIN: rAAV-CAGh-ChR2 (H134R) -mCherry (sierotipo 2/9) 23; 3) mpITC / BLA: rAAV-EF1A-DIOhChR2 (H134R) -YFP (sierotipo 2/1) 23 </li><li> Anestetizzare un mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia (isoflurano: 3% di ossigeno per l&#39;induzione). Nota: I topi utilizzati in questo studio sono stati 4 -7 settimane di vita e dei seguenti ceppi e genotipi: C57Bl6 / J wild type (esperimento nelle figure 2A e 3A-D); GAD67-GFP 24 (esperimento nelle figure 2B e 3E-H); TAC2-Cre 25 (esperimento nelle figure 2C e 3I-J). </li><li> Radersi la testa tra le orecchie e gli occhi. Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) per la testa rasata utilizzando tamponi di cotone. </li><li> Applicare una pomata oculare per evitare l&#39;essiccazione degli occhi durante l&#39;anestesia. Sottocutanea iniettare mouse con analgesici (0,1 ml di 5 mg / soluzione meloxicam basata ml). </li><li> Posizionare il mouse nel frame stereotassico (Figura 1A) e mantenere l&#39;anestesia tramite una maschera di anestesia del gas (isoflurano: 2% di ossigeno per la manutenzione). Controllare la profondità dell&#39;anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare. Nota: Mantenere condizioni sterili, nonché possibile durante tutta la procedura chirurgica; indossare maschera usa e getta, Go chirurgicawn, e guanti. </li><li> Fare incisione cutanea sulla parte superiore della testa con le forbici. Tirare delicatamente la pelle a lato con pinze smussato, fissare con fascette per esporre superficie del cranio, e cranio pulito con H 2 O 2. </li><li> Siti di iniezione segno sul cranio con una multa fori marcatori e trapano permanenti di punta per entrambi gli emisferi (Figura 1B). Coordinate per iniezioni in questo studio sono (da Bregma (mm)): mPFC: anteriore 1.9, laterale ± 0.3, 2.1 ventrale; MGM / PIN: posteriore 3.0, laterale ± 1.8, 3.8 ventrale; mpITC / BLA: posteriore 1.45, laterale ± 3,35 e 4,75 ventrale. </li><li> Montare pipetta di vetro riempito sul telaio stereotassico collegato ad un dispositivo di iniezione a pressione e portare la pipetta in posizione Bregma. </li><li> Rompere la punta della pipetta di vetro con pinza sottile diritto-punta. Fate questo delicatamente per evitare la generazione di aerosol di soluzione virus. Assicurarsi che la punta della pipetta è aperto mediante l&#39;applicazione di un paio di impulsi di pressione e osservando estrusione di gocce di Virusoluzione s. </li><li> Vai alle coordinate iniezione desiderati e iniettare la metà del contenuto della pipetta (~ 0,5 ml) utilizzando le seguenti impostazioni del dispositivo di iniezione a pressione: Pressione: 20 psi, durata media di impulso: 30 ms, numero medio di impulsi: 50. </li><li> Lasciare pipetta in posizione per ~ 1 min prima lentamente (1 mm / min) richiamo della medesima. Nota: Assicurarsi che la pipetta non sia bloccato prima di ripetere procedura con lo stesso pipetta sulla emisfero. In caso di punta bloccato, pulire o rompere punta e la posizione della pipetta zero Bregma di nuovo. </li><li> Pulire cranio con PBS (pH 7,4), rimuovere i morsetti, tirare delicatamente la pelle insieme, e suturare l&#39;incisione con sutura singolo pulsante (3 - 4 nodi). Applicare il disinfettante (Providone iodio-based) intorno alla ferita. </li><li> Arrestare il anestesia e non lasciare incustodita del mouse fino a quando è completamente sveglio. Mantenere singola alloggiati o tornare alla compagnia di altri animali solo se pienamente recuperato. Dopo l&#39;intervento, continuerà a monitorare lo stato di salute, e amminiter analgesico se necessario. Seguire le procedure in base alle leggi formulate dal Comitato di cura degli animali e uso locale. </li></ol> 2. Preparazione di acuta fette <ol><li> Preparare ACSF, soluzione di taglio, strumenti (forbici, bisturi, pinze, spatola, pipetta Pasteur), e blocca agar. Nota: 1 L di artificiale liquido cerebro-spinale (ACSF) è richiesto per ogni esperimento, e viene preparata sciogliendo sostanze chimiche nel doppio distillata H 2 O come precedentemente pubblicato con il 16,23. Soluzione di taglio viene preparata completandola 200 ml di ACSF con 0,87 ml di 2 M MgSO 4 soluzione madre. </li><li> ACSF Ossigenare e soluzione di taglio durante l&#39;esperimento con 95% O 2 e 5% CO 2. </li><li> Profondamente anestetizzare mouse utilizzando una piccola macchina animale anestesia con isoflurano (3% di ossigeno). Controllare la profondità dell&#39;anestesia con arto ritiro reflex prima di continuare. </li><li> Decapitare mouse usando forbici grandi e subito rilassarsitesta in soluzione di taglio ghiacciata. </li><li> Aprire il cranio da una singola incisione mediana da caudale a rostrale e spingere delicatamente pezzi di cranio ai lati con pinze. Rapidamente rimuovere cervello sollevando delicatamente fuori cranio con una piccola spatola arrotondata. Tagliare il cervelletto con bisturi. Mettere cervello in soluzione di taglio ghiacciata. </li><li> Per i siti di iniezione mPFC: tagliare parte anteriore del cervello (contenente mPFC) con un bisturi e mettere in soluzione di taglio ghiacciata fino affettare. </li><li> Rimuovere soluzione di taglio in eccesso con carta da filtro e incollare la parte posteriore del cervello sul palco vibratome. </li><li> Per fette amigdala inclinati, incollare il cervello su un taglio di blocco di agar (4%) con un angolo di 35 ° (Figura 1D, al centro). Per fette amigdala coronali, siti di iniezione MGM / PIN e siti di iniezione mPFC, incollare il cervello direttamente sul palco (Figura 1D, a destra ea sinistra). Posizionare un blocco di agar aggiuntivo dietro cervello per la stabilità, mentre affettare. </li><li> Place fase in camera di taglio con soluzione di taglio ossigenato ghiacciata che viene mantenuta a 4 ° C utilizzando un gruppo di raffreddamento. Preparare fette acuta dell&#39;amigdala (320 micron) con una lama zaffiro. Mettere le fette in una camera di interfaccia fornito con ACSF ossigenato a temperatura ambiente. </li><li> Dopo la preparazione di fette amigdala acute, posizionare la camera di interfaccia a bagnomaria a 36 ° C per recuperare fette per 35 - 45 min. Successivamente, riportare la camera di interfaccia per RT. Per la registrazione da queste fette, procedere con passo 3.2. </li><li> Durante l&#39;inizio della fase di 2.10, tagliare delle fette dei siti di iniezione, come descritto in precedenza per le fette amigdala acute (passi 2,8-2,9). Il recupero di fette nel bagnomaria non è necessario qui. Facoltativo: per stimare rapidamente posizione del sito di iniezione, osservare le fette su uno stereoscopio dotato di una lampada fluorescente e appositi set di filtri. </li><li> Fissare fette contenenti siti di iniezione per l&#39;analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e submerli ging in 4% paraformaldeide (PFA) in PBS soluzione O / N. Per l&#39;analisi dei siti di iniezione procedere con passo 4.1. </li></ol> 3. Visualizzazione e stimolazione delle fibre Presinaptico <ol><li> Preparare microscopio di patch per l&#39;attivazione optogenetic di fibre e cellule: <ol><li> Centrare il diodo montato emissione luminosa (LED) sul percorso di consegna luce. </li><li> Misurare l&#39;intensità della luce LED in corrispondenza del piano focale posteriore e all&#39;uscita di ciascun obiettivo con un misuratore di potenza scelta opportuna lunghezza d&#39;onda di 470 nm. </li><li> Calcolare l&#39;intensità della luce in mW / mm 2 e creare una curva di calibrazione (intensità del LED (%) rispetto emissione luminosa (mW / mm 2)) per ciascun obiettivo per valori misurati per 470 nm. </li></ol></li><li> Recuperare una fetta dell&#39;amigdala acuta dalla camera dell&#39;interfaccia e posto nella camera fetta montato sul microscopio verticale dotato di una lampada fluorescente. Fare attenzione a posizionare la fetta in modo tale che il SLICe superficie rivolta verso l&#39;alto nella camera di interfaccia è anche rivolto verso l&#39;alto nella camera di registrazione. Profumato fetta fresca, ASCF ossigenata ad una velocità di 1 - 2 ml / min ad una temperatura di ~ 31 ° C. </li><li> Osservare fibre presinaptiche nella fetta utilizzando la lampada fluorescente in combinazione con appositi set di filtri per la proteina fluorescente specifica espresso. Utilizzare obiettivo 5x per ottenere una visione d&#39;insieme (Figura 1E), e 60x oggettiva per la valutazione della densità delle fibre all&#39;interno della zona di destinazione. Nota: Per GFP e YFP, utilizzare il filtro impostato &quot;verde&quot; (eccitazione 472/20, divisore di fascio 495, Emissione 490 LP) per mCherry utilizzare il filtro impostato &quot;rosso&quot; (eccitazione 560/40, divisore di fascio 585, Emissione 630/70), come specificato nella tabella materiali / attrezzature. </li><li> Aprire o limitare l&#39;apertura nel percorso ottico del microscopio come desiderato per l&#39;esperimento (Figura 2D). </li><li> Per ottenere una registrazione patch, riempire una pipetta di patch con una soluzione interna e montare iportaelettrodo n. Applicare una pressione positiva alla pipetta di patch e abbassare lentamente in primo luogo nella soluzione bagno e poi sotto il controllo visivo nella fetta utilizzando il micromanipolatore. <ol><li> Avvicinatevi al neurone di interessi con la pipetta di patch di lato e in alto. Rilasciare pressione positiva quando la pipetta è sulla superficie della cellula (fossetta visibile sulla superficie cellulare) ed ottenere un &quot;gigaseal&quot; applicando pressione negativa. </li><li> Applicare in seguito alla rottura di aspirazione la patch di membrana per ottenere la registrazione a cellula intera. Successivamente, stimolare fibre marcate con LED collegato utilizzando la lunghezza d&#39;onda appropriata per attivare ChR (470 nm) durante la registrazione risposte elettriche dalla cella. </li><li> Per la stimolazione sinaptica iniziare con una bassa intensità LED e aumentare fino a raggiungere la ampiezza della corrente sinaptica desiderato. TRIGGER il LED configurando uscite digitali nel software di acquisizione dei dati di controllare i tempi e il polso lunghezza (esempi della Figura3). Nota: altri software e / o TTL che generano i dispositivi possono essere utilizzati per attivare LED. </li></ol></li><li> Ripetere stimolazione con diaframma aperto o ristretto (passo 3.4) nel percorso ottico del microscopio come desiderato per la cella successiva registrati e / o in presenza di farmaci specifici. </li><li> Dopo la registrazione, correggere le fette per l&#39;analisi post-hoc da loro sandwich tra due carte da filtro e sommergendo nel 4% PFA O / N. </li><li> Analizzare i dati elettrofisiologici. Nota: Usare un software adatto per la visualizzazione dei dati spazzata registrati per ogni singola linea di stimolazione. Quando si analizzano gli effetti delle droghe, utilizzare routine di rilevamento di picco per ottenere andamento nel tempo degli effetti della droga su ampiezze delle correnti sinaptiche per tutti i singoli spazza. Determinare quando l&#39;effetto della droga raggiunge lo stato stazionario. Per preparare le risposte medi rappresentativi per le figure, utilizzare il software per la media ≥10 singoli spazza ogni condizione sperimentale (cf figura 3B-D, FH, J pannello di destra). Nota: diversi pacchetti software alternativi possono essere utilizzati per l&#39;analisi dei dati. </li></ol> 4. analisi post-hoc dei siti di iniezione <ol><li> Lavare le fette di siti di iniezione (dal punto 2.12) e la registrazione siti (se ri-immagini si desidera, dal punto 3.7) per tre volte in PBS. Questo viene fatto ripetutamente sostituendo soluzione PBS fresco su un agitatore rotante per tre volte per 10 min. </li><li> Preparare soluzione al 2% agar-agar in PBS, e lasciarlo raffreddare a ~ 65 ° C. Mettere le fette appoggiati sul fondo di un piccolo piatto di 30 millimetri di diametro di Petri, incorporare fette in agar-agar e lasciate raffreddare fino solido. </li><li> Incollare un blocco di agar con la fetta o fette incorporato per la fase di un vibratome e mettere in primo piano in camera di taglio con PBS. </li><li> La resezione fette a 70 micron di spessore incorporato. Opzionale: Dopo resezione, fette possono essere colorati, cioè con Neurotrace rivelare citoarchitettura (Figura 3A, C), e / o by colorazione immunofluorescenza per YFP o mCherry per amplificare il segnale proveniente dalla proteina di fusione ChR. </li><li> fette di montaggio su vetrini e vetrino con mezzi di montaggio. Siti di iniezione Immagine e, se desiderato, anche le porzioni di immagine contenenti fibre nelle aree di proiezione usando un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale a scansione laser (Figura 2A-C). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo protocollo descrive un metodo per ex vivo indagini optogenetic dei circuiti neurali e la connettività locale che può essere facilmente implementato sulla maggior parte, se non tutti, in posizione verticale fetta configurazioni di registrazione patch-clamp dotandoli di un ~ 470 LED al porto luce epifluorescenza nm. Uno dei principali vantaggi della stimolazione optogenetic di proiezioni assonale in fette è che permette l&#39;attivazione e ricerca di proprietà di connessioni non accessibili con stimolazion...

strumenti precisi per la visualizzazione e l&#39;attivazione simultanea di connessioni specifiche tra aree cerebrali e specifici tipi di neuroni stanno diventando sempre più importante per capire le connettività funzionale sottostanti sani stati funzioni cerebrali e malattie. Idealmente, questo comporta indagini fisiologica di precise proprietà sinaptiche con cui i neuroni comunicano identificati. Ciò è particolarmente vero per i collegamenti tra aree cerebrali che non possono essere conservati in una sola fetta cerebrale acuto. In passato, questo è stato ampiamente raggiunto in esperimenti separati. Da un lato, traccianti neurali iniettate in vivo sono stati impiegati in combinazione con conseguente leggero o analisi al microscopio elettronico di partner pre e post-sinaptici. D&#39;altra parte, quando tratti di fibre provenienti dalla regione di origine sono conservati e accessibili nella preparazione fetta, stimolazione elettrica è stato usato per valutare i meccanismi di comunicazione sinaptici con celle nella regione di destinazione. Con l&#39;avvento della optogenetics, l&#39;espressione mirata di cationi canali luce-dipendenti, come Channelrhodopsins (CHRS) fuso con proteine ​​fluorescenti, consente ora di attivazione dei neuroni e loro traiettorie assonale pur consentendo la loro visualizzazione e post-hoc analisi anatomica 1- 4. Perché assoni CHR-esprimono possono essere stimolati anche se isolate dal genitore somata 5, è possibile in fettine di cervello a: 1) valutare ingressi da regioni cerebrali che non erano accessibili con la stimolazione elettrica convenzionale, in quanto tratti di fibre non sono separabili o la traiettoria specifica non è noto; 2) in modo inequivocabile identificare la regione di origine per gli ingressi specifici che sono stati postulate ma non completamente compresi; e 3) studiare la connettività funzionale tra i tipi di cellule definite, sia a livello locale e nelle proiezioni a lungo raggio. A causa di una serie di vantaggi, questa mappatura optogenetic di circuiti in fettine cerebrali è diventato ampiamente utilizzato negli ultimi anni, e una varietà di vettori virali per l&#39;espressione di CHRS fluorescenti-taggato sono prontamente disponibili da fornitori commerciali. Alcuni vantaggi chiave di attivazione optogenetic sopra stimolazione elettrica convenzionale sono danni al tessuto a causa di posizionamento di elettrodi di stimolazione, la specificità della stimolazione fibra, perché la stimolazione elettrica può altresì assumere fibre di passaggio o di altre cellule vicine, e una stimolazione altrettanto rapido e temporalmente precisi. Inoltre, l&#39;iniezione stereotassica di vettori virali può facilmente essere mirati a specifiche aree cerebrali 6 e specifica espressione condizionale o cellula-tipo può essere ottenuto utilizzando l&#39;espressione Cre-dipendente e / o promotori specifici 7. Qui, questa tecnica viene applicata per la mappatura di lungo raggio e circuiti locali nel sistema paura. L&#39;amigdala è una regione chiave per l&#39;acquisizione e l&#39;espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali 8,9 paura e. Oltre from l&#39;amigdala, la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e l&#39;ippocampo (HC), strutture che sono reciprocamente collegati al amigdala, sono implicati in aspetti di acquisizione, il consolidamento e il recupero di paura e di estinzione ricordi 10,11. Attività in suddivisioni del mPFC sembra giocare un doppio ruolo nel controllare sia alta e bassa la paura afferma 12,13. Questo potrebbe in parte essere mediato da collegamenti diretti da mPFC all&#39;amigdala che avrebbe controllato l&#39;attività e l&#39;uscita amigdala. Pertanto, negli ultimi anni, diversi studi hanno iniziato a ex vivo esperimenti fetta di indagare le interazioni sinaptiche tra afferenze mPFC e cellule bersaglio specifici nell&#39;amigdala 14-17. Durante l&#39;apprendimento la paura, le informazioni sensoriali sulla stimoli condizionati e incondizionati raggiunge l&#39;amigdala attraverso proiezioni specifiche regioni del talamo e corticali. Plasticità di questi ingressi ai neuroni nella parte laterale (LA) del Basolamigdala ateral (BLA) è un importante meccanismo alla base condizionamento alla paura 9,18. Una crescente evidenza suggerisce che i processi di plastica paralleli nell&#39;amigdala coinvolgono elementi inibitori per il controllo della memoria timore 19. Un gruppo di neuroni inibitori cluster sono i mediale paracapsular intercalate cellule GABAergici (mpITCs), ma la loro connettività e precisa funzione non è completamente compresa 20-22. Qui, la mappatura del circuito optogenetic viene utilizzato per valutare la connettività afferenti ed efferenti di queste cellule e il loro impatto sui neuroni bersaglio nell&#39;amigdala, dimostrando che mpITCs ricevono input sensoriali direttamente dalle stazioni talamici e corticali relè 23. espressione specifica del CHR mpITCs o neuroni BLA permette la mappatura delle interazioni locali, rivelando che mpITCs inibiscono, ma sono anche reciprocamente attivato, BLA neuroni principali, mettendoli in nuovi circuiti inibitori feed-forward e retroazione che controllano efficacemente l&#39;attività BLA23.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Surgery</td></tr><tr><td>Stereotactic frame</td><td>Stoelting, USA</td><td>51670</td><td>può essere sostituito da un altro frame stereotassico per topi</td></tr><tr><td></td><td>Stoelting, USA</td><td>51625</td><td>può essere sostituito da un altro frame stereotassico per</td></tr><tr><td>topi</td><td>Stoelting, USA</td><td>50264</td><td>non più disponibile, sostituito dall'articolo n. 51609M</td></tr><tr><td>Dispositivo di iniezione a pressione, Toohey Spritzer</td><td>Toohey Company, USA</td><td>T25-2-900</td><td>altri dispositivi di iniezione a pressione (ad es. Picospritzer) possono essere utilizzati</td></tr><tr><td>capillari in vetro Kwik Fill</td><td>World Precision Instruments, Germania</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia, IsoFlo</td><td>Eickemeyer, Germania</td><td>213261</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura CC e termoforo</td><td>FHC, USA</td><td>40-90-8D</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore orizzontale per micropipette Modello P-1000</td><td>Sutter Instruments, USA</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzatore per strumenti chirurgici, Sterilizzatore 75</td><td>Melag, Germania</td><td>08754200</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-hSyn-ChR2(H134R)-eYFP (sierotipo 2/9)</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-26973P</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-CAGh-ChR2(H134R)-mCherry (sierotipo 2/9)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-9-20938M</td><td></td></tr><tr><td>rAAV-EF1a-DIOhChR2(H134R)-YFP (sierotipo 2/1)&nbsp;</td><td>Penn Vector Core, USA</td><td>AV-1-20298P</td><td></td></tr><tr><td>verde veloce</td><td>Roth, Germania</td><td>0301.1</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano Anestetico, Isofurano CP (1ml/ml)</td><td>CP Pharma, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antisettico, Betadine (providone-iodio)</td><td>Purdure Products, USA</td><td>BSOL32</td><td>può essere sostituito da un altro disinfettante</td></tr><tr><td>Analgesico, Metacam Solution (5mg/ml meloxicam)</td><td>Boehringer Ingelheim, Germania</td><td></td><td>può essere sostituito da altri analgesici</td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi Bepanthen</td><td>Bayer, Germania</td><td>0191</td><td>può essere sostituito da un altro unguento per gli occhi</td></tr><tr><td>Trapano NM3000 (SNKG1341 e SNIH1681)</td><td>Nouvag, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutranox Ago da sutura</td><td>Strumenti per la scienza fine, Germania</td><td>12050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sutura in seta intrecciata</td><td>Strumenti per le scienze corte, Germania</td><td>18020-60</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Registrazioni, stimolazione luminosa e analisi</td></tr><tr><td>liquido cerebrospinale artificiale (ACSF)</td><td>per la composizione vedi riferimenti #16 e #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluzioni di cerotti interni</td><td>per la composizione vedi riferimenti #16 e #23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagnesioSolfato eptaidrato</td><td>Roth, Germania</td><td>P027.1</td><td>preparare una soluzione madre 2M in purificato </td></tr><tr><td>affettatrice ad acqua, Microm HM650V</td><td>Fisher Scientific, Germania</td><td>920120</td><td></td></tr><tr><td>Unità di raffreddamento per affettatrice di tessuti, CU65</td><td>Fisher Scientific, Germania</td><td>770180</td><td></td></tr><tr><td>Lama in zaffiro</td><td>Delaware Diamond Knives</td><td></td><td>ordine personalizzato, informarsi con l'azienda</td></tr><tr><td>Stereoscopio, SZX2-RFA16</td><td>Olympus, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada fluorescente Xcite (XI120Q-1492)</td><td>Lumen Dynamics Group, Canada</td><td>2012-12699</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio patch, BX51WI</td><td>Olympus, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore patch Multiclamp 700B&nbsp;</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitdata 1440A</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software PClamp, Versione 10</td><td>Molecular Devices, USA</td><td></td><td>utilizzato per controllare l'acquisizione e la stimolazione dei dati</td></tr><tr><td>Termoregolatore del bagno, TC05</td><td>Luigs & Neumann, Germania</td><td>200-100 500 0145</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a tre assi Mini 25</td><td>Luigs & Neumann, Germania</td><td>210-100 000 0010</td><td></td></tr><tr><td>Controllore per micromanipolatore SM7</td><td>Luigs & Neumann, Germania</td><td>200-100 900 7311</td><td></td></tr><tr><td>capillari di vetro per pipette patch World</td><td>Precision Instruments, Germania</td><td>GB150F-8P</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro al nitrato di cellulosa per camera di interfaccia&nbsp;</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germania</td><td>13006--50----ACN</td><td></td></tr><tr><td>Unità LED, CoolLED pE</td><td>CoolLED, UK</td><td>244-1400</td><td>CoolLED o USL 70/470 e adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED</td></tr><tr><td>CoolLED 100 Dual Adapt</td><td>CoolLED, UK</td><td>pE-ADAPTOR-50E</td><td>CoolLED o USL 70/470 e adattatori appropriati sono due scelte alternative per</td></tr><tr><td>l'unità LED di stimolazione LED, USL 70/470</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>L70-000</td><td>CoolLED o USL 70/470 e gli adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED</td></tr><tr><td>Adattatore a doppia porta</td><td>Rapp Optoelectronic</td><td>Informarsi con l'azienda</td><td>CoolLED o USL 70/470 e gli adattatori appropriati sono due scelte alternative per la stimolazione LED</td></tr><tr><td>Set di filtri rosso (eccitazione)</td> <td>AHF, Germania</td><td>I filtri F49-560</td><td>possono essere acquistati come set F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisore di fascio)</td><td>AHF, Germania</td><td>I filtri F48-585</td><td>possono essere acquistati come set F46-008</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emissione)</td><td>AHF, Germania</td><td>F47-630</td><td>I filtri possono essere acquistati come set F46-008</td></tr><tr><td>Set di filtri verde (eccitazione)</td><td>AHF, Germania</td><td>F39-472</td><td>Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (divisore di fascio)</td><td>AHF, Germania</td><td>F43-495W</td><td>Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda)</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; (emissione)</td><td>AHF, Germania</td><td>F76-490</td><td>Alternative: set di filtri F36-149 o F46-002 (con emissione passa-banda)</td></tr><tr><td>LaserCheck, misuratore di potenza portatile</td><td>Coherent, USA</td><td>1098293</td><td></td></tr><tr><td>IgorPro Software, versione 6</td><td>Wavemetrics, USA</td><td></td><td>per l'analisi dei dati di elettrofisiologia, è possibile utilizzare anche altri pacchetti software alternativi...</td></tr><tr><td>La suite di macro Neuromatic per IgorPro</td><td>http://www.neuromatic.thinkrandom.com per l'analisi</td><td></td> dei <td>dati di elettrofisiologia, possono essere utilizzati anche altri pacchetti software alternativi.</td></tr><tr><td colspan="4">Analisi post hoc di iniezioni e proiezioni</td></tr><tr><td>Polvere di paraformaldeide (PFA)</td><td>Roth, Germania</td><td>0335.2</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrace 435/455 colorante Nissl fluorescente blu</td><td>Invitrogen</td><td>N-21479</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar per l'inclusione e la resezione Roth</td><td>, Germania</td><td>5210.3</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri 30 x 10 mm per l'inclusione</td><td>di SPL Life Scienze</td><td></td><td>alternative possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Slides, Super Frost</td><td>R. Langenbrinck, Germania</td><td>61303802</td><td>alternative possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti</td><td>R. Langenbrinck, Germania</td><td>3000302</td><td>alternative possono essere utilizzate</td></tr><tr><td>Vecta Shield mezzo di montaggio</td><td>Vector Laboratories, USA</td> È <td>possibile utilizzare supporti di montaggio alternativi</td><td>H-1000</td></tr><tr><td>filtro al nitrato di cellulosa per l'appiattimento fette per fissaggio</td><td>Satorius Stedim Biotech, Germania</td><td>11406--Microscopio</td> a scansione laser confocale 25------N <td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Zeiss, Germania</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

approcci optogenetic sono ora ampiamente usati per studiare la funzione di popolazioni neuronali e circuiti combinando espressione mirata di proteine ​​luce-attivati ​​e successiva manipolazione dell&#39;attività neurale dalla luce. Channelrhodopsins (CHRS) sono cationi canali luce-dipendenti e quando fuso con una proteina fluorescente loro espressione permette la visualizzazione e l&#39;attivazione simultanea di specifici tipi cellulari e le loro proiezioni assonale in aree definite del cervello. Via iniezione stereotassica di vettori virali, proteine ​​di fusione CHR possono essere costitutivamente o condizionatamente espressi in cellule specifiche di una regione del cervello definito, e le loro proiezioni assonale possono essere successivamente studiato anatomicamente e funzionalmente via ex vivo attivazione optogenetic in fettine di cervello. Questo è di particolare importanza quando si punta a capire le proprietà sinaptiche di connessioni che non potevano essere affrontate con approcci convenzionali di stimolazione elettrica, o per identificare romanzo affeaffitto e connettività efferente che è stato precedentemente poco conosciuta. Qui, alcuni esempi illustrano come questa tecnica può essere applicata per studiare queste domande a chiarire i circuiti paura legate nell&#39;amigdala. L&#39;amigdala è una regione chiave per l&#39;acquisizione e l&#39;espressione di paura, e lo stoccaggio di memorie emozionali paura e. Molte linee di evidenza suggeriscono che la corteccia prefrontale mediale (mPFC) partecipa a diversi aspetti di acquisizione paura e l&#39;estinzione, ma la sua connettività preciso con l&#39;amigdala è appena iniziando a essere capito. In primo luogo, si mostra come ex vivo di attivazione optogenetic può essere utilizzato per studiare gli aspetti della comunicazione sinaptica tra le afferenze mPFC e cellule bersaglio nell&#39;amigdala basolaterale (BLA). Inoltre, è illustrato come questo approccio optogenetic ex vivo può essere applicato per valutare modelli di connettività nuovi utilizzando un gruppo di neuroni GABAergici nell&#39;amigdala, il cluster paracapsular intercalate cellule (mpITC), come esempio.

Questa sezione mostra il flusso di lavoro di un approccio optogenetic ex vivo e risultati rappresentativi di diverse strategie sperimentali per studiare le proprietà fisiologiche delle proiezioni sensoriali e modulatorie a lungo raggio a BLA e neuroni mpITC così come le proprietà di connettività locale fra mpITC e BLA. Dopo l&#39;iniezione stereotassica del vettore virale selezionato le coordinate desiderate nel cerve...

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l&#39;attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell&#39;attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare le proprietà funzionali e sinaptiche delle proiezioni neurali e dei microcircuiti mediante optogenetica ex-vivo. Questo include l'espressione della channelrodopsina e la sua attivazione in proiezioni specifiche, combinata con registrazioni in patch-clamp. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulle proprietà sinaptiche della connettività locale e a lungo raggio all'interno e tra aree cerebrali.Questo è illustrato qui mediante l'analisi dei circuiti neurali che sostengono il comportamento di paura. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente di studiare circuiti e sinapsi non accessibili con le convenzionali tecniche di stimolazione elettrica. In generale, le persone alle prime armi con questo metodo dovranno superare la sfida di eseguire tutti i passaggi necessari nel modo ottimale.Questo include il puntamento stereotassico per iniezioni virali, l'identificazione del tempo ottimale di espressione della rodopsina canale, la preparazione di sezioni cerebrali di buona qualità e l'attivazione luminosa stabile nonché le registrazioni. Prima di iniziare questa parte della procedura, un vettore

ex-vivo-optogenetic-dissection-of-fear-circuits-in-brain-slices

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Neuroscienze

Il video mostra la generazione di fette di amigdala inclinate dal cervello di un topo. Il cervello è posizionato ad angolo sullo stadio del campione di vibratomo per ottenere fette contenenti l'amigdala e gli assoni dalla corteccia prefrontale mediale che formano connessioni sinaptiche con l'amigdala. Le fette di cervello vengono mantenute alla temperatura fisiologica per preservare il tessuto per ulteriori esperimenti.

Generazione di fette di amigdala inclinate da un cervello di topo

Questo video dimostra la preparazione di sottili fette di cervello coronale da un cervello murino, esponendo le regioni dell'amigdala ricche di connessioni sinaptiche dalla corteccia prefrontale mediale. Le fette vengono quindi recuperate nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato per mantenere la vitalità neuronale.

Generazione di una fetta di cervello coronale che espone le regioni dell'amigdala da un cervello di topo

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

Questo video mostra una procedura per analizzare la connettività sinaptica tra la corteccia prefrontale mediale (mPFC) e i neuroni dell'amigdala utilizzando fette di cervello acuto dell'amigdala da topi. I neuroni mPFC in questi topi esprimono la canalrodopsina fusa con una proteina fluorescente. Le canalrodopsine facilitano l'afflusso di ioni e la generazione di potenziale d'azione nei neuroni mPFC dopo l'attivazione della luce. Di conseguenza, i neuroni mPFC rilasciano neurotrasmettitori che...

Visualizzazione e mappatura dei percorsi neuronali in una fetta di cervello dell'amigdala

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

Le fette di cervello ex vivo possono essere utilizzate per studiare gli effetti degli anestetici volatili sulle risposte evocate agli input afferenti. L'optogenetica è impiegata per attivare indipendentemente afferenze talamocorticali e corticocorticali alla neocorteccia non primaria, e le risposte sinaptiche e di rete sono modulate con isoflurano.

Attivazione optogenetica delle vie afferenti nelle fette cerebrali e modulazione delle risposte mediante anestetici volatili

Questo protocollo dimostra un metodo semplice e robusto per studiare la crescita degli assoni in situ e la dinamica dei coni di crescita. Descrive come preparare ex vivo fette di cervello acuto fisiologicamente rilevanti e fornisce una pipeline di analisi di facile utilizzo.

Sul posto Visualizzazione delle dinamiche dei coni di crescita e crescita degli assoni in colture di fette di cervello embrionali ex vivo acute

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Il paradigma della paura osservativa valuta il congelamento vicario nei roditori come modello di empatia affettiva. Questa procedura comporta l'esposizione di roditori osservatori a dimostratori conspecifici che ricevono scosse avversive del piede per suscitare risposte empatiche di congelamento. Utilizzando saggi osservativi della paura, i ricercatori possono studiare i meccanismi neurali alla base dell'empatia affettiva.

La paura osservativa come modello di empatia affettiva nei topi

Scopri la dissezione optogenetica ex vivo dei circuiti della paura nel cervello utilizzando fette acute e patch-clamp. Questo metodo consente di analizzare le proprietà sinaptiche con precisione spaziale e temporale.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

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