Proprietà elettroattivo Polymer Nanoparticelle Esporre fototermiche

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di preparare nanoparticelle polimeriche conduttive che presentano proprietà fototermiche e valutare la loro citotossicità. Le nanoparticelle polimeriche conduttive sono agenti ideali per la terapia fototermica perché assorbono la luce nella gamma del vicino infrarosso e la convertono in calore per uccidere le cellule tumorali. Il vantaggio principale degli agenti di fototerapia polimerica è che possono essere personalizzati per regolare le loro proprietà di assorbimento in base alla compatibilità e alla capacità di targeting del tumore per consentire un'efficace terapia del cancro localizzato non invasiva.

I polimeri che stiamo utilizzando per la fototerapia possono essere utilizzati anche per applicazioni di energia alternativa, sensori ed elettrocromici. Gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché la reazione è sensibile all'umidità. Una buona comprensione delle tecniche di sintesi airless è essenziale.

La dimostrazione visiva dei saggi di coltura cellulare è fondamentale poiché le tecniche sterili sono difficili da padroneggiare. Tutti i saggi di gioco multiruolo richiedono accuratezza e coerenza per ottenere risultati adeguati. Su un pallone a tre colli a fondo tondo fissare un setto, un condensatore dotato di un adattatore di controllo dell'ingresso e un adattatore di controllo dell'uscita del gas.

Collegare l'adattatore di uscita del gas a un gorgogliatore. Quindi, collegare l'adattatore di ingresso a una linea Shlenk di argon con tubi in PVC a pareti spesse. Iniziare il flusso di argon nel pallone di reazione e lasciare che il gas fluisca per alcuni minuti.

Dopo aver acceso l'aspirapolvere, utilizzare un bruciatore Bunsen per asciugare la reazione alla fiamma, quindi spurgare l'apparecchio con argon. Ripeti l'operazione altre due volte per ottenere un ambiente privo di aria. Utilizzare una siringa per aggiungere un virgola zero sette grammi di EDOT all'apparecchio attraverso il setto.

Aggiungere 20 millilitri di Tetraidrofurano nel pallone e mescolare. Preparare un bagno di acetone con ghiaccio secco in un pallone Dewar a bassa forma e raffreddare il pallone EDOT per 15 minuti a meno 78 gradi Celsius. Quindi scendere a 11 millimoli di n-butillitio in esani mantenendo una temperatura di meno 78 gradi Celsius.

Dopo l'aggiunta completa, mescolare per un'altra ora. È necessario prestare la massima attenzione quando si maneggiano i reagenti organolitio. Queste soluzioni sono eccezionalmente pericolose e devono essere maneggiate solo da qualcuno che è stato ampiamente addestrato al loro utilizzo.

Rimuovere il bagno di acetone con ghiaccio secco. Iniziare immediatamente un'aggiunta goccia a goccia di 14 virgola 13 millilitri di una soluzione di cloruro di zinco molare, mescolando per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere alla reazione quattro millimoli di uno, quattro Dialkoxy, due, cinque dibromobenzene e 80 micromoli di palladio tetrakis trifenilfosfina.

Iniziare a riflussare la reazione a 75 gradi Celsius con un bagno d'olio. Ogni giorno, utilizzare una siringa per prelevare un piccolo campione della miscela di reazione. Precipitare il campione in due millilitri di acido cloridrico molare e utilizzare due millilitri di diclorometano per estrarre il materiale.

Individuare l'estratto su una cromatografia su strato sottile di silice, o piastra TLC, insieme a soluzioni preconfezionate di EDOT purificato e il corrispondente uno quattro Dialkoxy due cinque Dibromobenzene. Utilizzare una soluzione da 60 a 40 di acetato di etile ed esani per sviluppare la piastra in una camera di vetro. Una volta completata la reazione, in tre-cinque giorni, raffreddare la reazione a temperatura ambiente.

Aggiungere 10 millilitri di acido cloridrico molare seguiti da 20 millilitri di diclorometano per estinguere la reazione. Trasferire il processo di reazione in un imbuto separatore e isolare lo strato organico. Lavare le sostanze organiche con acqua deionizzata fino a quando i lavaggi dell'acqua non sono più acidi.

Quindi, essiccare le sostanze organiche con oltre 15 grammi di solfato di magnesio. Dopo aver filtrato il solido, rimuovere il solvente utilizzando un evaporatore rotante per ottenere un solido giallo arancio. In una fiala di vetro, preparare un millilitro di PSS-co-MA al due percento in peso in volume in acqua e aggiungere una piccola ancoretta.

Preparare una soluzione di 16 milligrammi per millilitro di monomero in cloroformio e trasferirne 100 microlitri in una provetta microcentrifugata. Sciogliere 30 milligrammi di acido dodecilbenzensolfonico nella provetta da microcentrifuga, quindi utilizzare un miscelatore automatico a vortice per 30-60 minuti per omogeneizzare la soluzione. Successivamente, aggiungere la fase organica omogeneizzata in aliquota da 10 microlitri alla soluzione di PSS-co-MA al due percento ogni 60 secondi.

Dopo l'aggiunta completa, diluire la soluzione con due millilitri di acqua e rimuovere l'ancoretta di combustione. Immergere l'emulsione in un bagno di ghiaccio, quindi utilizzare una sonda per sonicare l'emlusione con due intervalli di 10 secondi a un'ampiezza del 30 percento. Rimuovere la fiala dal bagno di ghiaccio e sostituire l'ancoretta per continuare a mescolare l'emulsione.

Quindi, aggiungere tre virgola otto microlitri di una soluzione acquosa di cloruro di ferro da cento milligrammi per millilitro all'emulsione monomerica e mescolare per un'ora per ottenere nanoparticelle polimeriche stabilizzate con PSS-co-MA. Trasferire la sospensione di nanoparticelle in provette da centrifuga da sette millilitri e centrifugare la sospensione a 75, 600 volte G per tre minuti. Infine, recuperare il surnatante e dializzare in acqua per 24 ore utilizzando un tubo per dialisi con interruzione del peso molecolare da 100 kilodalton.

Coltura SCOV di tre cellule di cancro ovarico in DMEM integrati con il 10% di siero fetale bovino a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica in fiasche T 75. Dopo la dissociazione e il conteggio delle cellule utilizzando protocolli standard, alimentare le cellule a una densità di 5.000 cellule per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica.

Immediatamente prima dell'uso, illudere la sospensione di nanoparticelle in un mezzo di crescita completo a una concentrazione di un milligrammo per millilitro. Filtrare la sospensione di nanoparticelle attraverso un filtro sterile da due micrometri a punto zero. Quindi diluire la sospensione alle concentrazioni di esposizione desiderate con un terreno di coltura completo integrato con l'uno per cento di penicillina streptomicina.

Rimuovere delicatamente il terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 microlitri di sospensione di nanoparticelle a varie concentrazioni di esposizione. Dopo aver incubato le cellule, rimuovere con cura la soluzione, quindi sostituire il terreno con 100 microlitri di soluzione MTT filtrata sterile di virgola zero per millilitro. Incubare le cellule per due-quattro ore nell'incubatore.

Quindi esamina le cellule al microscopio per verificare la formazione di cristalli di Formazan. Rimuovere con cautela la soluzione MTT e sostituirla con 100 microlitri di dimetilsolfossido. Posizionare il piatto su uno shaker e mescolare per alcuni minuti.

Infine, misurare gli assorbenti di ciascun pozzetto a 590 nanometri e 700 nanometri. Questi valori corrispondono rispettivamente ai picchi assorbenti del prodotto Formazan e a un valore di riferimento. I monomeri risultanti possono essere caratterizzati mediante spettroscopia NMR all'idrogeno e al carbonio 13.

Le reazioni di accoppiamento di Negishi attaccano l'anello fenilico all'EDOT causando lo spostamento del picco del protone fenilico da sette virgola un PPM a sette virgola otto PPM. Il protone theyenel si sposta anche verso l'alto a sei virgola cinque PPM. I quattro protoni sul ponte di carbonio dell'etilendiossisi si dividono in due serie di multipletti a quattro punti tre PPM.

Lo spettro NMR del carbonio 13 mostra picchi a 70, 45, 40 e 13 per i carboni del tienelo, e 50, 20 e 12 per i carboni fenilenici. La compatibilità cital delle nanoparticelle polimeriche è determinata utilizzando un saggio di vitalità cellulare MTT. All'interno dell'intervallo di concentrazione di nanoparticelle da zero virgola due a 56 microgrammi per millilitro, le nanoparticelle non riducono la vitalità cellulare a meno del 90% del controllo.

In genere, una riduzione della vitalità cellulare inferiore al 20% è considerata accettabile. Una volta padroneggiato, ci vuole circa una settimana per sintetizzare il monomero, un'altra settimana per purificarlo e meno di un giorno per preparare e purificare le nanoparticelle. Lo studio di citotossicità può essere completato in due giorni e mezzo dalla semina cellulare alla conclusione del test.

Durante gli studi cellulari in vitro, è fondamentale seguire le corrette tecniche asettiche. Ulteriori studi come saggi di morti vivi, studi di microscopia e studi di biodistribuzione in vivo e di ovulazione fototermica possono essere eseguiti con le nanoparticelle preparate attraverso questi protocolli per comprendere meglio il loro potenziale come agenti fototermici per la terapia del cancro.