Induzione di materna immunitario attivazione nei topi a Mid-gestazione stage con Viral Mimic poli (I: C)

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre un'attivazione immunitaria materna, o MIA, nei topi mediante iniezione intraperitoneale del polimero virale poly al stadio embrionale medio della gestazione. Questo metodo può aiutarci a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroimmunologia, come ad esempio in che modo un malfunzionamento del sistema immunitario possa portare a perturbazioni nello sviluppo cerebrale e nel comportamento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che è stata progettata specificamente per ricercatori interessati allo studio della MIA come fattore di rischio ambientale per l'autismo e la schizofrenia.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà, poiché piccole differenze nel metodo di induzione della MIA possono alterare in modo significativo la risposta successiva nella prole. Per allestire una coppia di accoppiamento temporizzato, iniziare sistemando cinque topi femmina per gabbia uno accanto all'altro in gabbie standard per topi, al fine di sincronizzare i loro cicli estrali, e utilizzare una perforazione all'orecchio per etichettare ciascun animale. Da zero a due ore prima dell'inizio del ciclo scuro, sistemare i topi femmina due per gabbia, pesarli e registrare il peso corporeo di ciascun topo singolarmente, quindi aggiungere un topo maschio per ogni gabbia contenente due femmine.

Dalle zero alle quattro ore dopo la fine del ciclo scuro, sollevare delicatamente ogni topo femmina alla base della coda, permettendo all'animale di aggrapparsi alla griglia della gabbia con le zampe anteriori, per verificare la presenza di una massa biancastra all'apertura vaginale. Se non è visibile un tappo, inserire delicatamente una punta di pipetta da 200 microlitri nell'apertura vaginale. Una resistenza dovuta alla coagulazione conferma la formazione del tappo.

Raggruppare i topi con spinaletto in una nuova gabbia, poiché la presenza di un tappo vaginale conferma soltanto che è avvenuta la copulazione. Nei giorni embrionali 10,5-11,5, sollevare ogni femmina di topo con spinaletto alla base della coda ed osservare la presenza di un rigonfiamento addominale, quindi pesare i topi per verificare la gravidanza e alloggiare gli animali gravidi in gabbie pulite singole. Pesare la polvere di poli(I:C) in un conico da 50 millilitri.

Al giorno embrionale 12,5, aggiungere il volume appropriato di cloruro di sodio allo 0,9% al volume corrispondente di poli(I:C) in un tubo conico e chiudere il cappuccio. Far rotolare delicatamente la goccia di soluzione salina sulle polvere fino a quando la soluzione non diventa limpida. Quindi centrifugare il tubo e trasferire la soluzione di poli(I:C) in un tubo da microcentrifuga.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare il rapporto tra 260 e 280 della soluzione di poli(I:C). Il rapporto deve essere compreso tra 1,54 e 1,82, come indicato dal produttore. Successivamente, pesare il primo topo e caricare una siringa per insulina da 0,3 millilitri con il volume corrispondente calcolato della soluzione di poli(I:C).

Quindi, prendere il topo per la coda, appoggiarlo sulla sommità della gabbia e tenerlo fermo per la nuca. Inserire ora l’ago, con la bisellatura rivolta verso l’alto, al centro dei due capezzoli superiori a un angolo di circa 20 gradi rispetto al topo, e somministrare la soluzione di poli(I:C). Successivamente, rimettere il topo nella gabbia.

Dopo aver iniettato tutti i topi, posizionare le gabbie in una stanza tranquilla e con poco passaggio per evitare altri effetti confondenti e pesare i topi la mattina successiva. Almeno tre giorni prima dei test comportamentali, sostituire la lettiera delle gabbie dei soggetti adulti di 8-12 settimane di età derivanti dall'attivazione immunitaria materna o MIA. Mezz'ora prima del test, abituare i topi alla stanza di prova.

Per un test di inibizione del riflesso di pre-allarme, immobilizzare i topi all'interno di cilindri in plexiglass posizionati sopra un sensore piezoelettrico. Abituare il topo alla camera per l'inibizione del riflesso di pre-allarme per cinque minuti, con sei prove di rumore bianco a 120 decibel. Successivamente esporre i topi a miscele casuali di suoni, come indicato nella tabella, e confrontare i risultati con la risposta di allarme basale, al fine di determinare l'inibizione del pre-stimolo negli animali MIA.

Per un test del campo aperto, posizionare un topo in un angolo di un'arena quadrata aperta, con una zona centrale definita di 17 per 17 centimetri, e registrare la traiettoria del topo per 10 minuti mediante una telecamera montata sul soffitto. Quindi quantificare gli ingressi nella zona centrale e il tempo trascorso all'interno della zona centrale. Per un test di sepoltura dei sassolini, abituare un topo a una gabbia di prova contenente lettiera pulita di pino tremolo compressa profonda cinque centimetri per 10 minuti, quindi riportare il topo nella gabbia di casa ed ordinare delicatamente 20 sassolini di vetro blu scuro del diametro di 1,5 centimetri in una griglia di quattro per cinque nella gabbia di prova.

Ora riportare il topo nella gabbia di prova per 10 minuti, quindi riposizionare l'animale nella gabbia di casa e contare il numero di biglie sepolte durante il periodo di prova. L'iniezione di poly(I:C) al giorno embrionale 12,5 può indurre una risposta infiammatoria acuta nell'asse placentario materno-fetale e provocare un effetto cronico sullo sviluppo cerebrale e sui fenotipi comportamentali. In effetti, il poly(I:C) induce un'espressione genica di Il6 più elevata nella milza materna, nella placenta e nel cervello fetale, tre ore dopo l'iniezione.

In generale, rispetto alla prole adulta trattata con soluzione salina, la prole adulta MIA mostra un numero ridotto di ingressi nella zona centrale e una durata minore nella zona centrale nel test del campo aperto. Gli animali iniettati con poli(I:C) mostrano anche comportamenti di seppellimento più frequenti nel test di seppellimento delle biglie e una minore inibizione del pre-impulso. La perdita di cellule di Purkinje nel lobulo sette del cervelletto è un altro tratto distintivo della prole MIA, con un numero inferiore di cellule di Purkinje positive per la calbindina osservato nel lobulo sette del cervelletto di questi animali, rispetto ai controlli iniettati con soluzione salina.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di non disturbare i topi gravidi dopo l'induzione di MIA. Successivamente, è possibile indurre ulteriori fattori come stress o infezioni postnatali per studiare ulteriori interazioni tra ambiente e ambiente.