Name: Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri come monitorare il trasporto degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET geneticamente codificato. Questo metodo offre alta risoluzione spaziale e temporale senza necessità di marcatura.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di un romanzo geneticamente codificato sensore acido biliare capace di monitorare le dinamiche spazio-temporali di trasporto degli acidi biliari in cellule viventi. Questo biosensore è costituito da proteine ​​fluorescenti cerulee e citrino che sono fusi per FXR-LBD, formando così un sensore acido biliare basato FRET-(BAS). Bile Acid sensore è relativamente semplice e conveniente in uso quando si ha esperienza di base con colture c...

Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è ampiamente utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle funzioni cellulari in cellule viventi con alta risoluzione temporale e spaziale 1. In FRET, l&#39;energia da un fluoroforo donatore eccitato è trasferita ad un fluoroforo accettore. Efficienza FRET è fortemente dipendente dalla distanza tra il donatore e accettore fluoroforo e il loro orientamento ed è quindi una lettura sensibile cambiamenti conformazionali che influenzano i due fluorofori. Questo fenomeno viene sfruttato per generare biosensori basati FRET per l&#39;imaging di piccole molecole. Cambiamenti nella loro concentrazione può essere monitorato come aumenta / diminuisce nel rapporto di intensità di emissione del fluoroforo accettore rispetto al donatore 2. Ad esempio, biosensori a base di calcio-FRET consentono il rilevamento veloce e stabile di concentrazioni di calcio liberi nelle cellule viventi 3. Altri vantaggi di biosensori basati su FRET sono imaging singole cellule viventi, terede non invasività, la loro capacità di essere mirata a diversi tipi di cellule e compartimenti cellulari 4. Molti aspetti della dinamica degli acidi biliari intracellulare sono ancora poco conosciuti. Ad esempio, poco si sa circa il meccanismo di regolazione di base del trasporto degli acidi biliari coniugati e non coniugata. Tecniche esistenti per monitorare questo trasporto in primo luogo fanno uso di giornalisti basati luciferasi-, acidi biliari radioattivi, o gli analoghi degli acidi biliari fluorescenti. Quest&#39;ultima richiede la modifica degli acidi biliari, possibilmente che interessano le loro proprietà. Giornalisti basato luciferasi-hanno scarsa risoluzione temporale. Inoltre, queste tecniche comportano la perdita del campione e non sono applicabili per l&#39;imaging in cellule singole. Pertanto, sarebbe utile usare metodi che consentano vivo imaging cellulare unico di attività di trasporto utilizzando biosensori FRET, soprattutto dal momento che comprende il vantaggio di rilevamento raziometrici 5, 6. Mentre varianti del CFP / form YFP utilizzato più frequentemente coppie FRET, nuove strategie utilizzando Morange e mCherry trasportano mutazioni auto-associazione-inducono hanno portato ad un ampliamento della toolbox FRET con nuovi sensori, tra cui un sensore di acido biliare rosso-spostato 7. Abbiamo già creato un FRET bile sensore acido geneticamente codificato (BAS), che consiste in un fluoroforo donatore (ceruleo) e un fluoroforo accettore (citrino) che si fonde con il recettore X farnesoid (FXR) ligando dominio di legame (FXR-LBD) e un peptide contenente un motivo LXXLL 8. Questo peptide si associa con il FXR-LBD in maniera acido-dipendente biliari. Dopo l&#39;attivazione FXR, la distanza tra citrino e ceruleo cambierà a causa di un cambiamento conformazionale. In linee cellulari di mammifero, FXR risultati di attivazione in un aumento chiaramente rilevabile nel / rapporto di ceruleo citrino, mentre il sensore purificato opera nella direzione opposta e porta ad un rapporto di FRET diminuita al momento dell&#39;attivazione FXR. Questo sensore (CytoBAS)consente il monitoraggio delle dinamiche degli acidi biliari citosoliche. Con carbossi-terminale aggiunta di motivi di targeting subcellulare, il costrutto BAS può essere mirata al nucleo (NucleoBAS) e perossisomi (PeroxiBAS), consentendo misurazioni delle concentrazioni di acidi biliari nei diversi compartimenti cellulari. Anche se l&#39;aggiunta del motivo di targeting perossisomale non altera la sua capacità di risposta agli acidi biliari, cellulari permeabili FXR-ligandi non ha indotto alcun Fret cambiamenti di PeroxiBAS dentro perossisomi 8. Come la natura di questa discrepanza non è noto, il protocollo seguito è focalizzata su CytoBAS e NucleoBAS. L&#39;uso di questo sensore FRET geneticamente codificato è stato recentemente dimostrato in cellule contenenti i trasportatori epatici acidi biliari Na + polipeptide / taurocolato co-trasportatore (NTCP) e organica soluto trasportatore alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP è il principale importatore epatica acidi biliari e OSTαβ è un bile intestinale basolateraletrasportatore acido che può funzionare sia come importatore ed esportatore dipende dal gradiente di concentrazione degli acidi biliari elettrochimico 9, 10. Dati recenti hanno mostrato che al trasporto degli acidi biliari da NTCP e / o OSTαβ, risposte robuste e veloci in rapporto FRET come risultato dell&#39;interazione ligando-FXR-LBD possono essere osservati. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i metodi per misurare FRET quali confocale analisi microscopica e la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), segnalano passaggi critici, affrontare potenziali problemi e discutere metodi alternativi. L&#39;utilizzo di questo sensore FRET geneticamente codificato, l&#39;interazione degli acidi biliari con FXR-LBD può essere quantificata e monitorata direttamente nelle cellule viventi e fornisce un metodo rapido e semplice di visualizzare trasporto degli acidi biliari e le dinamiche in tempo reale. Plasmidi di espressione di mammifero che codificano CytoBAS e NucleoBAS sono disponibili in commercio. Pertanto, questo biosensore in grado di contribuire ulteriormente allacomprensione dei trasportatori degli acidi biliari o composti che attivano FXR e fornire una più profonda comprensione della biologia e la segnalazione degli acidi biliari.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Alto glucosio senza L-glutammina</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (penna/streptococco)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Pallone</td> per colture cellulari Lonza <td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T-175</td> rivestito in laminina <td>VWR international</td><td>392-0238</td> Piastra a 6 pozzetti <td>rivestita in laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0229</td> Piastra da 10 cm <td>rivestita in poli-L-lisina e laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Rivestita in laminina</td></tr><tr><td>Dietilamminoetile (DEAE) - Destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticina) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di clonazione (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Terreno di coltura Leibovitz</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Senza fenolo rosso</td></tr><tr><td>Polistirene tubo a fondo tondo (5 ml) Tubo Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Senza tappo, non sterile</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 provette (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Tappo a scatto, sterile</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Vetro di copertura a 8 pozzetti</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>filtrato al carbone FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Altri prodotti chimici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio in tempo reale di intracellulare bile acid dynamics utilizzando una sede a fret geneticamente codificato bile acid sensore

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) è diventato un potente strumento per monitorare il ripiegamento, l'interazione e la localizzazione delle proteine nelle singole cellule. I biosensori basati sul principio FRET hanno consentito la visualizzazione in tempo reale di eventi di segnalazione subcellulare in cellule vive con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. Qui, descriviamo l'applicazione di un sensore di acidi biliari (BAS) geneticamente codificato che consiste in due fluorofori fusi al dominio di legame del ligando del recettore X farnesoide (FXR-LBD), formando così un sensore di acidi biliari che può essere attivato da un gran numero di specie di acidi biliari e altri ligandi FXR (sintetici). Questo sensore può essere mirato a diversi compartimenti cellulari, tra cui il nucleo (NucleoBAS) e il citosol (CytoBAS), per misurare localmente le concentrazioni di acidi biliari. Consente una rapida e semplice quantificazione dell'afflusso di acidi biliari cellulari, dell'efflusso e della distribuzione subcellulare degli acidi biliari endogeni senza la necessità di marcare con tag fluorescenti o radionuclei. Inoltre, i sensori BAS FRET possono essere utili per monitorare il legame del ligando FXR. Infine, dimostriamo che questo biosensore FRET può essere combinato con l'imaging di altri fluorofori spettralmente distinti. Ciò consente l'analisi combinata della dinamica intracellulare degli acidi biliari e i) la localizzazione e/o l'abbondanza delle proteine di interesse, o ii) la segnalazione intracellulare in una singola cellula.

Il sensore FRET-BAS presentato si basa sul dominio di FXR (LBD-FXR) legame ligando attaccato a due fluorofori citrino e cerulee) e un motivo LXXLL. Questo sensore permette indagini trasporto degli acidi biliari in cellule con alta risoluzione spaziale e temporale (Figura 1 A) vivono. Mutazioni in ceruleo e citrino sono stati applicati per promuovere la formazione del complesso intramolecolare (Figura 1 <...

Forniamo un protocollo dettagliato per studiare la dinamica degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET BAS geneticamente codificato. Questo sensore di acidi biliari rappresenta uno strumento unico per studiare (regolare) il trasporto degli acidi biliari e l'attivazione FXR in un'ampia gamma di tipi di cellule.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un sensore di acidi biliari FRET geneticamente codificato per visualizzare facilmente il trasporto e la dinamica degli acidi biliari con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Questo sensore è in grado di rispondere a domande metaboliche chiave, come la relazione tra bile e dinamica con glucosio, lipidi e metabolismo energetico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il trasporto degli acidi biliari può ora essere monitorato direttamente alle singole cellule viventi senza la necessità di marcare gli acidi biliari.Questo metodo può fornire informazioni sul trasporto e sulla dinamica delle cellule e degli acidi biliari. Può anche essere utilizzato per visualizzare gli effetti o l'attivazione di singole cellule viventi, o per combinare l'imaging della localizzazione delle proteine e il trasporto degli acidi biliari. Il sensore di acidi biliari geneticamente codificato, d'ora in poi, il sensore, è costituito da un fluoroforo ceruleo donatore e da un fluoroforo citrino ad eccezione.I due fluorofori sono legati dal dominio di legame del ligando del recettore nucleare degli acidi biliari FXR, fuso con un cofatt

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