Name: Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-04T15:00:01.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri come monitorare il trasporto degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET geneticamente codificato. Questo metodo offre alta risoluzione spaziale e temporale senza necessità di marcatura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni iniziali del CER (ERC-2011-StG 280255 e ERC-2013-StG 337479) e dall'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario (Vidi 91713319).

<ol><li>Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+imaging+of+cell+signaling+from+in+vitro+to+in+vivo%3A+basis+of+biosensor+construction%2C+live+imaging%2C+and+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing.</a> Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).</li>
<li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">FRET imaging.</a> Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li>
<li>Mank, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FRET-based+calcium+biosensor+with+fast+signal+kinetics+and+high+fluorescence+change%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change.</a> Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).</li>
<li>Li, I. T., Pham, E., Truong, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+biosensors+based+on+the+principle+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+for+monitoring+cellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics.</a> J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).</li>
<li>Stephens, D. J., Allan, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+microscopy+techniques+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Light microscopy techniques for live cell imaging.</a> Science. 300 (5616), 82-86 (2003).</li>
<li>Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+FRET+sensor+proteins+based+on+mutually+exclusive+domain+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions.</a> Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).</li>
<li>Lindenburg, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Stickiness%3A+Thermodynamic+Characterization+of+Intramolecular+Domain+Interactions+To+Guide+the+Design+of+Fo%CC%88rster+Resonance+Energy+Transfer+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors.</a> Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).</li>
<li>van der Velden, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+bile+acid+transport+in+single+living+cells+using+a+genetically+encoded+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor.</a> J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).</li>
<li>Dawson, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heteromeric+organic+solute+transporter+%CE%B1-%CE%B2%2C+Ost%CE%B1-Ost%CE%B2%2C+is+an+ileal+basolateral+bile+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter.</a> J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).</li>
<li>Meier, P. J., Stieger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+salt+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Bile salt transporters.</a> Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).</li>
<li>Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mTurquoise-based+cAMP+sensor+for+both+FLIM+and+ratiometric+read-out+has+improved+dynamic+range%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range.</a> PLoS One. 6 (4), e19170(2011).</li>
<li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Plass, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesoid+X+receptor+and+bile+salts+are+involved+in+transcriptional+regulation+of+the+gene+encoding+the+human+bile+salt+export+pump%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump.</a> J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l&#39;utilizzo di un romanzo geneticamente codificato sensore acido biliare capace di monitorare le dinamiche spazio-temporali di trasporto degli acidi biliari in cellule viventi. Questo biosensore è costituito da proteine ​​fluorescenti cerulee e citrino che sono fusi per FXR-LBD, formando così un sensore acido biliare basato FRET-(BAS). Bile Acid sensore è relativamente semplice e conveniente in uso quando si ha esperienza di base con colture c...

Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) è ampiamente utilizzato per ottenere una migliore comprensione delle funzioni cellulari in cellule viventi con alta risoluzione temporale e spaziale 1. In FRET, l&#39;energia da un fluoroforo donatore eccitato è trasferita ad un fluoroforo accettore. Efficienza FRET è fortemente dipendente dalla distanza tra il donatore e accettore fluoroforo e il loro orientamento ed è quindi una lettura sensibile cambiamenti conformazionali che influenzano i due fluorofori. Questo fenomeno viene sfruttato per generare biosensori basati FRET per l&#39;imaging di piccole molecole. Cambiamenti nella loro concentrazione può essere monitorato come aumenta / diminuisce nel rapporto di intensità di emissione del fluoroforo accettore rispetto al donatore 2. Ad esempio, biosensori a base di calcio-FRET consentono il rilevamento veloce e stabile di concentrazioni di calcio liberi nelle cellule viventi 3. Altri vantaggi di biosensori basati su FRET sono imaging singole cellule viventi, terede non invasività, la loro capacità di essere mirata a diversi tipi di cellule e compartimenti cellulari 4. Molti aspetti della dinamica degli acidi biliari intracellulare sono ancora poco conosciuti. Ad esempio, poco si sa circa il meccanismo di regolazione di base del trasporto degli acidi biliari coniugati e non coniugata. Tecniche esistenti per monitorare questo trasporto in primo luogo fanno uso di giornalisti basati luciferasi-, acidi biliari radioattivi, o gli analoghi degli acidi biliari fluorescenti. Quest&#39;ultima richiede la modifica degli acidi biliari, possibilmente che interessano le loro proprietà. Giornalisti basato luciferasi-hanno scarsa risoluzione temporale. Inoltre, queste tecniche comportano la perdita del campione e non sono applicabili per l&#39;imaging in cellule singole. Pertanto, sarebbe utile usare metodi che consentano vivo imaging cellulare unico di attività di trasporto utilizzando biosensori FRET, soprattutto dal momento che comprende il vantaggio di rilevamento raziometrici 5, 6. Mentre varianti del CFP / form YFP utilizzato più frequentemente coppie FRET, nuove strategie utilizzando Morange e mCherry trasportano mutazioni auto-associazione-inducono hanno portato ad un ampliamento della toolbox FRET con nuovi sensori, tra cui un sensore di acido biliare rosso-spostato 7. Abbiamo già creato un FRET bile sensore acido geneticamente codificato (BAS), che consiste in un fluoroforo donatore (ceruleo) e un fluoroforo accettore (citrino) che si fonde con il recettore X farnesoid (FXR) ligando dominio di legame (FXR-LBD) e un peptide contenente un motivo LXXLL 8. Questo peptide si associa con il FXR-LBD in maniera acido-dipendente biliari. Dopo l&#39;attivazione FXR, la distanza tra citrino e ceruleo cambierà a causa di un cambiamento conformazionale. In linee cellulari di mammifero, FXR risultati di attivazione in un aumento chiaramente rilevabile nel / rapporto di ceruleo citrino, mentre il sensore purificato opera nella direzione opposta e porta ad un rapporto di FRET diminuita al momento dell&#39;attivazione FXR. Questo sensore (CytoBAS)consente il monitoraggio delle dinamiche degli acidi biliari citosoliche. Con carbossi-terminale aggiunta di motivi di targeting subcellulare, il costrutto BAS può essere mirata al nucleo (NucleoBAS) e perossisomi (PeroxiBAS), consentendo misurazioni delle concentrazioni di acidi biliari nei diversi compartimenti cellulari. Anche se l&#39;aggiunta del motivo di targeting perossisomale non altera la sua capacità di risposta agli acidi biliari, cellulari permeabili FXR-ligandi non ha indotto alcun Fret cambiamenti di PeroxiBAS dentro perossisomi 8. Come la natura di questa discrepanza non è noto, il protocollo seguito è focalizzata su CytoBAS e NucleoBAS. L&#39;uso di questo sensore FRET geneticamente codificato è stato recentemente dimostrato in cellule contenenti i trasportatori epatici acidi biliari Na + polipeptide / taurocolato co-trasportatore (NTCP) e organica soluto trasportatore alfa / beta (OSTαβ) 8. NTCP è il principale importatore epatica acidi biliari e OSTαβ è un bile intestinale basolateraletrasportatore acido che può funzionare sia come importatore ed esportatore dipende dal gradiente di concentrazione degli acidi biliari elettrochimico 9, 10. Dati recenti hanno mostrato che al trasporto degli acidi biliari da NTCP e / o OSTαβ, risposte robuste e veloci in rapporto FRET come risultato dell&#39;interazione ligando-FXR-LBD possono essere osservati. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i metodi per misurare FRET quali confocale analisi microscopica e la fluorescenza delle cellule attivate (FACS), segnalano passaggi critici, affrontare potenziali problemi e discutere metodi alternativi. L&#39;utilizzo di questo sensore FRET geneticamente codificato, l&#39;interazione degli acidi biliari con FXR-LBD può essere quantificata e monitorata direttamente nelle cellule viventi e fornisce un metodo rapido e semplice di visualizzare trasporto degli acidi biliari e le dinamiche in tempo reale. Plasmidi di espressione di mammifero che codificano CytoBAS e NucleoBAS sono disponibili in commercio. Pertanto, questo biosensore in grado di contribuire ulteriormente allacomprensione dei trasportatori degli acidi biliari o composti che attivano FXR e fornire una più profonda comprensione della biologia e la segnalazione degli acidi biliari.

<table><tbody><tr><td>CytoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62860</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBAS&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>62861</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagles media (DMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td>Alto glucosio senza L-glutammina</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (penna/streptococco)</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200mM)</td><td>Lonza</td><td>17-605E</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>102-70</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Pallone</td> per colture cellulari Lonza <td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>T-25</td><td>VWR international</td><td>392-0253</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari T-175</td> rivestito in laminina <td>VWR international</td><td>392-0238</td> Piastra a 6 pozzetti <td>rivestita in laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>734-0229</td> Piastra da 10 cm <td>rivestita in poli-L-lisina e laminina</td></tr><tr><td></td><td>VWR international</td><td>392-0243</td><td>Rivestita in laminina</td></tr><tr><td>Dietilamminoetile (DEAE) - Destrano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9885</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)&nbsp;</td><td>Brunschwig</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>G418 (geneticina) 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Igromicina B, 50 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>10687-010</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro di clonazione (6 x 8 mm)</td><td>Bellco</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Terreno di coltura Leibovitz</td><td>Invitrogen</td><td>21083-027</td><td>Senza fenolo rosso</td></tr><tr><td>Polistirene tubo a fondo tondo (5 ml) Tubo Facs</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td>Senza tappo, non sterile</td></tr><tr><td>Falcon 2.063 provette (5 ml)</td><td>Falcon BD</td><td>352063</td><td>Tappo a scatto, sterile</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Vetro di copertura a 8 pozzetti</td><td>Thermo scientific</td><td>155409</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>filtrato al carbone FBS</td><td>Life technologies</td><td>12676011</td><td></td></tr><tr><td>GW4064</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5172</td><td></td></tr><tr><td>TCDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6260</td><td></td></tr><tr><td>CDCA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9377</td><td></td></tr><tr><td>Altri prodotti chimici</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n.v.t.</td><td></td></tr></tbody></table>

monitoraggio in tempo reale di intracellulare bile acid dynamics utilizzando una sede a fret geneticamente codificato bile acid sensore

Real Time Monitoring of Intracellular Bile Acid Dynamics Using a Genetically Encoded FRET-based Bile Acid Sensor

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) è diventato un potente strumento per monitorare il ripiegamento, l'interazione e la localizzazione delle proteine nelle singole cellule. I biosensori basati sul principio FRET hanno consentito la visualizzazione in tempo reale di eventi di segnalazione subcellulare in cellule vive con un'elevata risoluzione temporale e spaziale. Qui, descriviamo l'applicazione di un sensore di acidi biliari (BAS) geneticamente codificato che consiste in due fluorofori fusi al dominio di legame del ligando del recettore X farnesoide (FXR-LBD), formando così un sensore di acidi biliari che può essere attivato da un gran numero di specie di acidi biliari e altri ligandi FXR (sintetici). Questo sensore può essere mirato a diversi compartimenti cellulari, tra cui il nucleo (NucleoBAS) e il citosol (CytoBAS), per misurare localmente le concentrazioni di acidi biliari. Consente una rapida e semplice quantificazione dell'afflusso di acidi biliari cellulari, dell'efflusso e della distribuzione subcellulare degli acidi biliari endogeni senza la necessità di marcare con tag fluorescenti o radionuclei. Inoltre, i sensori BAS FRET possono essere utili per monitorare il legame del ligando FXR. Infine, dimostriamo che questo biosensore FRET può essere combinato con l'imaging di altri fluorofori spettralmente distinti. Ciò consente l'analisi combinata della dinamica intracellulare degli acidi biliari e i) la localizzazione e/o l'abbondanza delle proteine di interesse, o ii) la segnalazione intracellulare in una singola cellula.

Il sensore FRET-BAS presentato si basa sul dominio di FXR (LBD-FXR) legame ligando attaccato a due fluorofori citrino e cerulee) e un motivo LXXLL. Questo sensore permette indagini trasporto degli acidi biliari in cellule con alta risoluzione spaziale e temporale (Figura 1 A) vivono. Mutazioni in ceruleo e citrino sono stati applicati per promuovere la formazione del complesso intramolecolare (Figura 1 <...

Forniamo un protocollo dettagliato per studiare la dinamica degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET BAS geneticamente codificato. Questo sensore di acidi biliari rappresenta uno strumento unico per studiare (regolare) il trasporto degli acidi biliari e l'attivazione FXR in un'ampia gamma di tipi di cellule.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) has become a powerful tool for monitoring protein folding, interaction and localization in single cells. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare un sensore di acidi biliari FRET geneticamente codificato per visualizzare facilmente il trasporto e la dinamica degli acidi biliari con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Questo sensore è in grado di rispondere a domande metaboliche chiave, come la relazione tra bile e dinamica con glucosio, lipidi e metabolismo energetico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il trasporto degli acidi biliari può ora essere monitorato direttamente alle singole cellule viventi senza la necessità di marcare gli acidi biliari.Questo metodo può fornire informazioni sul trasporto e sulla dinamica delle cellule e degli acidi biliari. Può anche essere utilizzato per visualizzare gli effetti o l'attivazione di singole cellule viventi, o per combinare l'imaging della localizzazione delle proteine e il trasporto degli acidi biliari. Il sensore di acidi biliari geneticamente codificato, d'ora in poi, il sensore, è costituito da un fluoroforo ceruleo donatore e da un fluoroforo citrino ad eccezione.I due fluorofori sono legati dal dominio di legame del ligando del recettore nucleare degli acidi biliari FXR, fuso con un cofattore FXR, il peptide. Due cambiamenti di aminoacidi ingegnerizzati nei due fluorofori promuovono interazioni intermolecolari tra il ceruleo e il citrino. Vengono utilizzati due diversi costrutti che trasportano il sensore.In un costrutto, il sensore contiene il segnale di localizzazione nucleare c-terminale e, quindi, si accumula nel nucleo. Nell'altro costrutto, il sensore manca di qualsiasi sequenza di puntamento, e quindi si localizza nel citoplasma. Il seguente protocollo video si concentra su come visualizzare il sensore nelle cellule viventi.Il protocollo di testo illustra come progettare le cellule che esprimono il sensore e come analizzarle ulteriormente in base ai fatti. In preparazione per l'imaging delle cellule, piastrate le cellule che esprimono il sensore alla densità desiderata in un vetrino inferiore sterile a otto pozzetti in terreni di coltura completi. Quando le cellule sono cresciute fino a 60 t0 70 di confluenza, procedere con l'esperimento.Lavare una volta le cellule che hanno aderito al vetrino della camera con 200 microlitri di 1x PBS o terreno di coltura Leibovitz L-15. Quindi, aspirare la soluzione e sostituirla con 300 microlitri di terreno di coltura Leibovitz L-15 in modo che non sia necessario alcun controllo delle emissioni di CO2. Se si utilizza DMEM con rosso fenolo, invece di Leibovitz L-15, pianificare di tenere traccia del PH durante la raccolta dei dati, perché il sensore è sensibile al PH. Successivamente, preparare le diluizioni dei composti da utilizzare nell'esperimento a concentrati da 3x a 5x, inclusi GW4064 e TCDCA.Prepararsi ad aggiungere aliquote da 50 a 100 microlitri durante l'imaging, in modo che le soluzioni vengano rapidamente miscelate nella camera dei vetrini. Ora, avvia il software di imaging di un microscopio confocale e accendi il laser. Il microscopio deve essere dotato di un obiettivo a olio 63x, una camera di incubazione a 37 gradi Celsius e un laser viola a 405 nanometri.Quindi, regolare le impostazioni del microscopio. Impostare la modalità di acquisizione su XYT per l'imaging time-lapse di un singolo piano focale. Imposta la velocità di acquisizione dell'immagine a intervalli di 20 secondi, in modo da poter aggiungere composti durante le pause.Inoltre, assicurati di impostare la gamma spettrale per il rilevamento di una missione. Concentrati sulle celle utilizzando la transilluminazione. Quindi, nel controllo software, disegnare dei cerchi per definire le regioni di interesse.Selezionare cellule con intensità di fioritura simili e dimensioni e forma normali. Non disegnare troppo vicino ai perimetri della cella. Quindi, inizia a prendere le misure.Prendi nota del loro valore e continua a prendere le misure fino a quando la fioritura cerulea e citrino non si è stabilizzata. Una volta raggiunta la stabilità della florescenza, aggiungere da 50 a 100 microlitri di acidi biliari o altri composti in momenti scelti durante la misurazione. Evitare il bordo della camera durante il pipettaggio e aggiungere il liquido lentamente.L'esecuzione corretta di questo passaggio è fondamentale per l'esperimento. Anche in questo caso, lasciare che la florsenza si stabilizzi prima di procedere. Termina l'esperimento aggiungendo con cura 100 microlitri di GW4064 per una concentrazione da cinque a 10 micromolari.Continuate a registrare fino a quando la fioritura non si sarà stabilizzata di nuovo. Quindi, salva l'esperimento ed esporta i dati come file avi. Apri i file avi salvati nell'immagine J selezionando plugin, stack, stack interleaver.Quindi, fai clic su modifica, seleziona e aggiungi a manager per aprire la finestra RLI manager. Quindi, attiva l'opzione, mostra tutto. Con lo strumento di selezione ovale, disegna alcune ROI che coprono celle specifiche.Non avvicinarti ai perimetri delle cellule perché le cellule probabilmente subiranno una deriva o una migrazione focale. Inoltre, disegna un cerchio in un'area al di fuori delle celle per determinare il segnale di fondo. È possibile utilizzare anche un'area all'interno di una cella che non esprime il sensore.Ora, seleziona un ROI e fai clic su plugin, quindi su profiler del rapporto. Appariranno tre schermate. RAW, rapporto e profilo del rapporto.La finestra RAW mostra l'aumento dell'intensità del citrino come linea blu e una diminuzione del ceruleo come linea rossa, se c'è FRET. La finestra del rapporto mostra informazioni sul rapporto citrino/ceruleo, che aumenterà con l'aumentare del FRET. La finestra del profilo del rapporto mostra i valori per le misure dell'intensità della florescenza in entrambi i canali.Se si utilizzano file di configurazione specifici per microscopio, l'ordine dei canali potrebbe apparire invertito. A questo punto, copiare i dati dalla finestra del profilo del rapporto in un foglio di calcolo per l'analisi statistica. Quindi, procedi a fare lo stesso per tutte le altre ROI selezionate e per la ROI in background.È stato eseguito un esperimento FRET basato sull'intensità quantitativa su cellule vive su cellule U2OS che esprimono il sensore e sono prive di trasportatori endogeni degli acidi biliari. Le cellule sono state trattate con TCDCA. Ciò non ha comportato alcuna modifica del FRET.Quando le cellule sono state trattate con GW4064, il rapporto medio citrino/ceruleo è aumentato notevolmente. Per dimostrare che il sensore può essere combinato con altre proteine, sono state ingegnerizzate le cellule U2OS che co-esprimono il sensore con NTCP e OST alfa-beta. Hanno mostrato un chiaro aumento del rapporto citrino/ceruleo in aggiunta a TCDCA e GW4064.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la dinamica degli acidi biliari utilizzando il sensore degli acidi biliari. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora. Questa procedura può essere facilmente estesa per includere più informazioni di imaging, come la localizzazione subcellulare della proteina di interesse.Purché la lunghezza d'onda di questa proteina sia diversa da quella del sensore. Per prevenire il fotosbiancamento, è importante mantenere il sensore che esprime le cellule al buio il più possibile.

real-time-monitoring-intracellular-bile-acid-dynamics-using

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Questo protocollo descrive un metodo per la misurazione in tempo reale dei flussi di calcio mitocondriale di imaging fluorescente. Il metodo si avvale di una circolare permutated YFP a base di sensori di calcio dual-eccitazione raziometrico (raziometrico pericam-mt) l'indicazione espressa nei mitocondri.

Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l&#39;apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.

FRET Microscopia per Monitoraggio in tempo reale di segnalazione di eventi in cellule vive Uso Biosensori unimolecolare

Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.

FIBS-enabled non invasiva Metabolic Profiling

In questo articolo verrà illustrato come monitorare le dinamiche di glutammina in cellule vive usando FRET. I sensori geneticamente codificate permettono il monitoraggio in tempo reale delle molecole biologiche con una risoluzione subcellulare. Disegno sperimentale, i dettagli tecnici delle impostazioni sperimentali e considerazioni per le analisi post-sperimentali saranno discussi per i sensori di glutammina geneticamente codificati.

La glutammina Flux Imaging Utilizzando sensori geneticamente codificato

Strumenti per diagnosticare la bile malassorbimento degli acidi e misurano il trasporto degli acidi biliari in vivo sono limitati. Un approccio innovativo di animali vivi è descritto che utilizza protoni combinato (1 H) più di fluoro (19 F) risonanza magnetica; questa nuova metodologia ha traslazionale potenziale per lo screening del malassorbimento degli acidi biliari nella pratica clinica.

Utilizzando Multi-fluorurati biliari acidi e<em&gt; In Vivo</em&gt; Risonanza Magnetica misurare Bile Acid Trasporti

Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l'imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un'alta risoluzione temporale e spaziale.

Registrazione in tempo reale In Vivo di Arabidopsis segnali di calcio durante l'alimentazione dell'insetto utilizzando un biosensore fluorescente

L'attivazione della Ser/Thr chinasi multifunzionale AURKA è caratterizzata dalla sua autofosforilazione su Thr288. Le sonde fluorescenti che si basano su FRET possono discriminare tra i suoi stati inattivi e attivati. Qui, illustriamo alcune strategie per l'ingegneria della sonda, insieme a un protocollo FRET rapido per seguire l'attivazione della chinasi durante la mitosi.

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive

Questo protocollo presenta un flusso di lavoro standard ad alta produttività per lo screening dei microrganismi industriali. Consiste nella costruzione di una libreria mutante tramite mutagenesi ARTP, nell'esecuzione di screening positivo delle gocce con microfluidica automatizzata, e successivamente nella verifica dei risultati. L'affidabilità del flusso di lavoro è stata convalidata tramite lo screening di ceppi ad alta resa di B. coagulans .

Screening ad alta produttività dei mutanti di Bacillo coagulante iperproduttore di acido lattico L-lattico utilizzando una piattaforma microfluidica automatica a gocce

In questo protocollo video tracciamo - ad alta velocità e in tre dimensioni - lisosomi marcati in fluorescenza all'interno di cellule viventi, utilizzando il metodo di tracciamento orbitale in un microscopio a due fotoni modificato.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

Questo articolo descrive il monitoraggio in tempo reale dell'ablazione HIFU nel fegato canino con imaging ecografico ad alta frequenza di fotogrammi utilizzando l'imaging divergente e a onde piane. L'Harmonic Motion Imaging per ultrasuoni focalizzati viene utilizzato per visualizzare la diminuzione dello spostamento indotto dalla forza di radiazione acustica nella regione ablata.

Monitoraggio in tempo reale di alta intensità ultrasuoni focalizzati (HIFU) Ablazione<em&gt; In Vitro</em&gt; Canine Livers Uso Harmonic Imaging Movimento per Focused Ultrasound (HMIFU)

Scopri come monitorare il trasporto degli acidi biliari nelle cellule viventi utilizzando un sensore FRET geneticamente codificato. Questo metodo offre alta risoluzione spaziale e temporale senza necessità di marcatura.

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore (Video) | JoVE Journal

Monitoraggio in tempo reale di intracellulare Bile Acid Dynamics Utilizzando una sede a FRET geneticamente codificato Bile Acid sensore

Esplora altri video