Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

L'obiettivo generale dell'utilizzo di questo equipaggiamento è coltivare cellule staminali in condizioni atmosferiche definite con la massima sterilità. Quello che andremo a dimostrare oggi è l'uso di una struttura chiusa per la coltura cellulare che consente un controllo preciso dei parametri della coltura. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa struttura per la coltura di cellule staminali multipotenti e cellule staminali pluripotenti.

Il vantaggio principale di questo metodo è che le cellule sono esposte a un ambiente costante indipendentemente dalla loro posizione durante l'elaborazione. Che si tratti di manipolare le cellule, di mantenerle nell'incubatrice o di osservarle al microscopio, l'esposizione a ossigeno, CO2 e temperature rimane costante per tutto il ciclo. La procedura sarà dimostrata da Alexander Stover, un ricercatore del mio laboratorio.

Per iniziare questa procedura, fare clic su un modulo per regolare la concentrazione del gas. Nella nuova finestra che mostra le impostazioni correnti, fare clic sul valore predefinito di ossigeno esistente sotto Impostazione e inserire la concentrazione di ossigeno richiesta per questo modulo. Successivamente, fare clic sul segno di spunta verde per confermare l'impostazione.

Ripetere questa operazione per l'anidride carbonica e impostare un valore di riferimento del 5% di anidride carbonica per tutti i moduli, ad eccezione delle camere tampone che sono regolabili solo per l'ossigeno. Successivamente, monitorare le concentrazioni attuali dei gas, indicate come Valori di processo, per assicurarsi che raggiungano i nuovi valori di riferimento. In seguito, regolare i valori di riferimento dei gas di tutti i moduli ai valori appropriati.

Regolare i livelli di anidride carbonica e ossigeno nelle camere che verranno esposte l'una all'altra. Ad esempio, regolare la camera di processo al 5% di ossigeno prima di aprire un'incubatrice che coltiva cellule al 5% di ossigeno. Regolare anche la camera tampone utilizzata per aggiungere materiali alla camera di processo al 5% di ossigeno.

Successivamente, impostare la temperatura della camera di processo a 37 gradi Celsius utilizzando la stessa schermata per le regolazioni del gas. Dopodiché, impostare la temperatura del fondo della camera di processo a 37 gradi Celsius. Fare clic sulle unità del modulo di incubazione al di sotto di ciascun incubatore e regolare la temperatura delle unità a 37 gradi Celsius.

Nella cappa a flusso laminare, spruzzare tutti i materiali che devono essere introdotti nel sistema con etanolo al 70% e lasciarli asciugare. Pulire delicatamente qualsiasi fiala o piastra contenente cellule con una garza sterile imbevuta di etanolo al 70%. Successivamente, assicurarsi che sia la porta esterna che quella interna della camera tampone siano saldamente chiuse, quindi aprire la porta esterna, inserire gli oggetti e richiuderla.

Utilizzando il software, selezionare il modulo tampone e fare clic sulla scheda Fattore di diluizione. Inserire uno nella casella Fattore logaritmico, quindi fare clic su Avvia. Una volta che l'interfaccia grafica ha smesso di lampeggiare su Fattore di diluizione, aprire la porta interna della camera tampone e trasferire i materiali nella camera di processo.

Per rimuovere oggetti dalla camera di processo, assicurarsi innanzitutto che la camera tampone abbia subito un fattore di diluizione. Successivamente, aprire la porta interna, posizionare gli oggetti da rimuovere all'interno e chiuderla. Dopodiché, aprire la porta esterna ed estrarre gli oggetti.

Posizionare tre piastre di Petri nel vassoio dell'acqua alla base di ogni incubatore. Riempire queste piastre con acqua sterile e mantenere il livello dell'acqua in queste piastre, poiché è fondamentale per mantenere il valore impostato di umidità relativa nell'incubatore. Nell'interfaccia grafica, fare clic sull'incubatore.

Successivamente, fare clic sul valore esistente di umidità relativa nella soglia e inserire il valore del 85%. Quindi, fare clic sul segno di spunta verde per confermare questo valore. Successivamente, regolare le camere tampone, la camera di processo e un'incubatrice ai valori di gas richiesti per il tipo di cellule da utilizzare. Pulire la superficie della camera di processo con garza sterile e un disinfettante non infiammabile, come un prodotto a base di cloruro di benzalconio.

Quindi, pulire i guanti e le superfici comunemente toccate, come le maniglie delle porte. Successivamente, pulire la superficie della cappa a flusso laminare e della camera tampone con etanolo al 70% e lasciare asciugare. Dopodiché, posizionare il flacone o la piastra con le cellule nella cappa e passare brevemente una garza sterile imbevuta di etanolo sulla superficie esterna.

Quindi, posizionare il pallone o la piastra nella camera tampone ed eseguire un fattore di diluizione. Al termine, trasferire immediatamente il pallone o la piastra nell'incubatore appropriato. Poiché l'incubatore si trova nella parte posteriore della camera di processo, estrarre un ripiano all'interno della camera di processo per posizionare le cellule ed evitare di aprire le porte dell'incubatore per periodi prolungati e senza necessità.

In questo passaggio, preparare il mezzo di coltura cellulare. Lasciare il mezzo in equilibrio con i livelli di anidride carbonica e ossigeno presenti nel sistema, lasciando il contenitore del mezzo leggermente aperto per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il mezzo vecchio dalle pozzette.

Per le cellule staminali pluripotenti, rimuovere quasi tutto il vecchio mezzo, lasciando una piccola quantità di mezzo vecchio per prevenire la disidratazione durante il processo di alimentazione. Per le cellule staminali neurali, rimuovere metà del vecchio mezzo. Successivamente, aggiungere mezzo fresco alle piastre di coltura cellulare e riposizionare le piastre nell'incubatore designato.

Qui è mostrata un'immagine delle iPSC. Ecco le iPSC vitali colorate con Trial 160 marcato con AF594 in una diluizione 1:100 nel mezzo di coltura. Tutte le iPSC sono state transdotte nel laboratorio di produzione cellulare in presenza di ossigeno al 5% mediante virus Sendai.

Ecco l'immagine a contrasto di fase di cellule staminali neurali derivate da iPSC coltivate al 5% di ossigeno in camere portaoggetti. Le cellule sono state quindi fissate in paraformaldeide al 4% e colorate con l'anticorpo primario Anti-Human Nestin e l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488. Una volta acquisite, queste tecniche possono essere eseguite in due ore se effettuate correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di impostare correttamente le concentrazioni dei gas prima di iniziare. Dopo la procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il riprogrammamento e la differenziazione, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'effetto dell'ipossia sulla pluripotenza o sulla multipotenza. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare la produzione clinica di cellule per il trattamento dei disturbi neurodegenerativi pediatrici.