Name: Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara a coltivare cellule staminali pluripotenti e neurali in un sistema chiuso con controllo di ossigeno, CO2 e temperatura. Questo metodo garantisce massima sterilità e conformità cGMP per la ricerca preclinica.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il personale Biospherix per il loro aiuto per imparare a utilizzare il sistema di coltura cellulare Xvivo chiusa, soprattutto Matt Freeman; il personale di Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. per il loro lavoro nella creazione delle infrastrutture di laboratorio, in particolare Russ Hughes; il personale dell&#39;ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Strutture e servizi di supporto per il loro lavoro nel coordinare la ristrutturazione di laboratorio, in particolare Adam Lukhard e Devin Hugie; il personale dell&#39;ospedale dei bambini del dipartimento Orange County di Sistemi Informativi per il loro aiuto nella creazione delle infrastrutture di gestione dei dati e l&#39;accesso remoto, in particolare Viet Tran; Ospedale dei Bambini di Orange County Executive Management team per il loro lunga sostegno del progetto, in particolare il Dr. Maria Minon e Brent Dethlefs. Questo lavoro è stato finanziato dal Children Hospital di Orange County e il California Institute for Regenerative Medicine attraverso la concessione TR3-05476 a PHS. Tutti gli autori hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.

<ol><li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children%27s+Hospital+of+Orange+County%3A+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl.Med%22%5BJournal%5D)">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li>
<li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li>
<li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li>
<li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li>
<li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.Rev.Neurother%22%5BJournal%5D)">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Stem+Cell+Res.Ther%22%5BJournal%5D)">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li>
<li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci.Res%22%5BJournal%5D)">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li>
<li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li>
<li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Le cellule coltivate nei CPF vedono alcun cambiamento nelle concentrazioni di ossigeno o di anidride carbonica mentre si spostano da incubatrice al trattamento da camera al microscopio da camera e indietro. È fondamentale che le condizioni in ciascuna camera sono abbinati al particolare incubatore in cui le cellule sono mantenute prima che le cellule vengono rimosse dal termostato. L&#39;atmosfera all&#39;interno dell&#39;apparato è continuamente HEPA filtrata ed è personalizzabile in materia di concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica. Le cellule possono essere coltivate in concentrazioni standard per PSC o NSC, 5% e il 9%, rispettivamente; o concentrazioni alternative possono essere scelti per diversi tipi di cellule o per esperimenti specifici. Pertanto, l&#39;apparato è fornito con fonti costanti di grado medico ossigeno, anidride carbonica e azoto (Figura 4). Tutti e tre di questi gas sono forniti da sistemi molteplici specifiche di gas che garantiscono forniture costanti. L&#39;apparecchio è fornito con una miscela di gas di taratura rappresentati10% (± 0,01%) di anidride carbonica in ossigeno. I sistemi di collettore si trovano al di fuori dello stabilimento di produzione delle cellule e i gas vengono convogliati nella struttura attraverso il soffitto. Il gas di taratura è alloggiato all&#39;interno della struttura. L&#39;apparecchio è inoltre fornito con il vuoto casa, anche attraverso il soffitto. L&#39;utilizzo di un sistema di monitoraggio elettronico e wireless unità invio, le pressioni di uscita di tutti i collettori sono costantemente monitorati. Nel caso in cui qualsiasi pressione scende fuori campo, i gestori di impianti di produzione di celle vengono automaticamente telefonato e notificate in modo tale che l&#39;azione appropriata può essere adottata. I requisiti di alimentazione degli apparecchi sono soddisfatte da sei dedicati 120 V circuiti che scendono dal soffitto e collegate a generatori di back-up dell&#39;ospedale al fine di garantire un costante rifornimento. Il funzionamento dell&#39;apparecchiatura è controllata via software su un computer basato su PC alimentato tramite un gruppo di continuità. Queste disposizioni di potenza e computergarantire che il sistema funzioni continuamente anche in caso di guasto del sistema di alimentazione pubblica. Il software che controlla l&#39;apparecchio ha un&#39;interfaccia grafica user-friendly (figura 1) che consente il controllo delle concentrazioni di ossigeno e anidride carbonica e pressioni di temperatura, umidità, e da camera. I valori di tutti questi parametri vengono registrate in continuo per fornire una registrazione parziale di tutti i parametri dell&#39;apparato. Questi dati viene eseguito il backup su un server remoto ogni notte per proteggere la loro integrità. Il computer e il software è possibile accedere in remoto dagli utenti amministrativi per valutare e / o modificare qualsiasi parametro. Inoltre, il computer e il software è possibile accedere in remoto, consentendo la valutazione interattiva dei parametri di apparecchi e la risoluzione dei problemi con gli utenti locali. Un ulteriore unità di invio allarme è collegato all&#39;apparato tale che gli operatori degli impianti di produzione di celle vengono informati di qualsiasi condizione out-of-range dell&#39;apparecchiatura. L&#39;accesso a distanza capabilities permettono il login e la valutazione delle specificità della condizione out-of-range. L&#39;apparecchio è progettato come un sistema modulare sia in una macro e micro senso. I singoli moduli di coltura cellulare, quali incubatori e camere di lavorazione, possono essere personalizzati in vista delle loro dimensioni e requisiti nonché nella loro disposizione rispetto all&#39;altro. Inoltre, la maggior parte delle funzioni di controllo dei singoli moduli sono essi stessi modulare tale che singoli regolatori gas atmosferici, per esempio, può essere facilmente sostituito senza notevoli disagi al sistema. camere di elaborazione specializzati, ad esempio uno per visualizzazione microscopica e manipolazione di colture cellulari, possono essere facilmente adattati al sistema. Sia a contrasto di fase e microscopio a fluorescenza sono all&#39;interno del sistema (figura 6) in modo che le cellule possono essere vivo macchiati, e le colonie possono essere sezionati nelle stesse condizioni atmosferiche come all&#39;interno tegli incubatrici. Routing dei cavi attraverso occhielli sigillati nelle pareti laterali della camera di trattamento consente apparecchiature come alimentatori e computer per essere tenuti al di fuori dell&#39;apparato, di solito su un carrello (Figura 6). Le camere di elaborazione nella struttura di produzione di cellule hanno un modello diverso da quello del flusso d&#39;aria BSC convenzionali. In BSC convenzionali, il flusso d&#39;aria scorre verso il basso da una bocca di scarico centrale e si divide in due flussi separati, che vengono poi ripresi da due differenti prese d&#39;aria nella parte anteriore ed a poppa del pavimento del cabinet. Per contro, il CPF ha un unico sfogo nella porzione anteriore del soffitto. L&#39;aria fluisce verso il basso e verso la parte posteriore della camera, dove viene quindi trascinato verso l&#39;alto in una bocchetta di aspirazione. Sebbene il CPF è intrinsecamente molto pulito, questo campo di flusso unico significa che i tecnici devono modificare leggermente la tecnica per ridurre il rischio di contaminazione. Come con un BSC convenzionale, un tecnico di laboratorio should evitare di mettere le mani monte di piastre di coltura di cellule aperte e bottiglie di media. Tuttavia, la direzione che è a monte è stato alterato nel CPF L&#39;impianto di laboratorio di produzione cellula stessa è abbastanza standard ed è dotato di un congelatore C -20 °, a -80 ° C congelatore, un frigorifero C 4 °, una centrifuga, e un bagno di acqua. Il laboratorio ha anche un lavandino con i comandi a pedale per il funzionamento conveniente a mani libere. Affinché questo laboratorio per diventare un impianto di produzione di celle funzionale clinica, tuttavia, devono ancora essere effettuate diverse modifiche aggiuntive. In primo luogo, l&#39;apparato stesso deve essere aggiornato per avere la capacità di monitorare i composti organici volatili, particolato, e le concentrazioni di biossido di cloro che viene utilizzato per la decontaminazione. In secondo luogo, una camera di trattamento contenente una macchina FACS può essere alloggiato e collegato al resto del dispositivo tramite un modulo buffer. Ciò consentirà di selezione cellulare e purificazione di trpopolazioni di cellule ansplantable alle condizioni ambientali adeguate. Infine, l&#39;intero apparato deve essere alloggiata all&#39;interno di una stanza pulita muro morbido. Ciò fornisce un International Organization for Standardization (ISO) Classe 8 ambiente per l&#39;apparato 5. L&#39;elevata sterilità e la natura controllato dal computer del CPF lo rende un sistema ideale per le applicazioni future con la terapia a base di cellule e buoni processi di fabbricazione. Il rischio di contaminazione è notevolmente mitigato, ma ancora più importante, le condizioni di espansione delle cellule vengono automaticamente registrati e archiviati dal sistema informatico. Deviazioni in concentrazioni di gas, temperatura, umidità, e tutti gli eventi di accesso al sistema sono rigorosamente documentati. Questo può essere di grande aiuto quando si studiano i problemi di qualità del prodotto. Tuttavia, vi sono ancora limiti. L&#39;utilizzo di qualsiasi e tutti i reagenti e materiali di consumo (ad esempio, i componenti multimediali, pipette, piastre) deve essere documentata separatamente. Aggiungereitionally, ci sono una moltitudine di potenziali problemi (tra cui molte forme di errore umano) che possono sorgere che sono completamente estranei alle variabili documentate dal sistema di monitoraggio del CPF. Pertanto, la necessità di personale altamente qualificato e documentazione dettagliato manuale di compiti rimane al suo posto.

Le tecniche standard di coltura di cellule staminali soffrono di diversi vincoli ambientali che impongono stress eccessivi alle cellule ed espongono le cellule a rischi inaccettabili di contaminazione. Tra gli stress che le cellule possono sopportare in condizioni standard di coltura cellulare ci sono cambiamenti precipitosi nei livelli di anidride carbonica e nelle concentrazioni di ossigeno3,4. Ciò si verifica quando le cellule vengono spostate dall'incubatore alla cabina di biosicurezza e/o al microscopio, il che potrebbe non essere ottimale per le cellule. Studi precedenti hanno confermato i vantaggi della coltura di cellule staminali pluripotenti e neurali in condizioni di ipossia4,11 e, per ottenere i migliori risultati, queste condizioni devono essere continue. Inoltre, i rischi di contaminazione cellulare sono maggiori poiché l'ambiente di laboratorio e il personale interferiscono con le cellule in quasi ogni fase della loro coltura e manipolazione. Le camere bianche tradizionali costituiscono un metodo efficace per ridurre notevolmente i rischi di contaminazione, ma sono costose, hanno un ingombro elevato e non riescono ad affrontare i fattori di stress legati alle concentrazioni di anidride carbonica e ossigeno. 
Un impianto di produzione di celle in grado di affrontare sia i rischi di contaminazione che le concentrazioni di gas e che può essere qualificato per soddisfare i criteri cGMP9 fornisce celle di alta qualità per la ricerca scientifica di base e per le applicazioni cliniche1,6,7. Tale impianto di produzione cellulare è costituito, come minimo, dai seguenti componenti: una camera di processo, che funge da spazio di lavoro riscaldato per l'alimentazione e la manipolazione di colture cellulari; una cappa a flusso laminare, per la sterilizzazione iniziale di reagenti, provette e strumenti; due camere di compensazione tampone tra la cappa e la camera di processo; due incubatori per colture cellulari accessibili dalla camera di processo; una camera del microscopio adiacente alla camera di processo; e infine, un software per computer per impostare e monitorare le condizioni all'interno di questi moduli. Utilizzando questa infrastruttura di base, è possibile eseguire un'ampia varietà di attività, come l'alimentazione standard e il passaggio di cellule staminali pluripotenti e cellule staminali neurali multipotenti, nonché metodi più specializzati come la riprogrammazione basata sul virus Sendai, gli studi di migrazione in vitro e la differenziazione delle cellule staminali neurali per la caratterizzazione elettrofisiologica.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xvivo System</td><td>Biospherix</td><td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>Xvivo Software</td><td>Biospherix</td><td>versione i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O2 Collettore</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>Collettore CO2</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N2 Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio con fotocamera DP21 e fluorescenza</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Integratore StemPro hESC Life</td><td>Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Clone</td> di<td>sodio tamponato con fosfato</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti 2</td><td>R& D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Dissociazione cellulare a base di Hank Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>R& D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticorpo</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SSEA4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Integratore di siero</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda </td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Consumabili Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Pipetta sierologica</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipetta sierologica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pipetta sierologica</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 25 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>pipetta sierologica da 50 ml</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Pallone Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>Pallone T-75</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; l. puntali per pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; l puntali per pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1.000 puntali per pipette</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>candeggina</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Questo documento descrive come utilizzare un sistema di coltura cellulare chiuso prodotto su misura e disponibile in commercio per la ricerca di base e preclinica. Le cappe di biosicurezza (BSC) e gli incubatori sono stati a lungo lo standard per la coltura e l'espansione di linee cellulari per la ricerca di base e preclinica. Tuttavia, poiché l'attenzione di molti laboratori di cellule staminali si sposta dalla ricerca di base alla traduzione clinica, sono necessari ulteriori requisiti per il sistema di coltura cellulare. Tutti i processi devono essere ben documentati e avere requisiti eccezionali di sterilità e riproducibilità. Negli incubatori tradizionali, le concentrazioni e le temperature dei gas fluttuano notevolmente ogni volta che le cellule vengono rimosse per l'alimentazione, il passaggio o altre manipolazioni. Tali interruzioni contribuiscono a creare un ambiente che non è lo standard per le linee guida cGMP e GLP. Queste interruzioni devono essere ridotte al minimo, soprattutto quando le cellule vengono utilizzate per scopi terapeutici. La motivazione per passare dal sistema BSC e incubatore standard a un sistema chiuso è che tali interruzioni possono essere rese trascurabili. I sistemi chiusi forniscono uno spazio di lavoro per alimentare e manipolare le colture cellulari e mantenerle in un ambiente controllato in cui la temperatura e le concentrazioni di gas sono costanti. In questo modo, le cellule staminali pluripotenti e multipotenti possono essere mantenute in ottima salute dal momento della loro derivazione fino al loro eventuale utilizzo in terapia.

Questo manoscritto descrive in dettaglio un impianto di produzione di cellule, e gli aspetti peculiari della coltura di cellule in un sistema chiuso. La maggior parte della struttura di produzione di celle e dispone di un apparecchio che ha un ingombro ridotto e può essere facilmente alloggiata all&#39;interno di un 6 x 7,5 m 2 Camera (Figura 2) su misura, chiuso, coltura cellulare. In nessun momento sono le cellule all&#39;interno dell&#39;apparato esposta al personale di laboratorio o ambiente. L&#39;apparecchiatura consiste di diversi moduli: una camera di processo, una cappa a flusso laminare, 2 camere buffer tenuta stagna tra il cappuccio e la camera di processo, due incubatori per colture cellulari, e una camera di microscopio adiacente alla camera di processo (Figura 3). Il sistema è controllato da un software consentendo variabili ambientali di essere controllati e monitorati (Figura 1). Il computer che esegue questo software è in un gruppo di continuità. I gas sono alimentati in the sistema da una serie di collettori per ossigeno, azoto e anidride carbonica (Figura 4). Gas per il dispositivo siano alimentati da sistemi molteplici che hanno due serie di vasche di ciascuno - un set attiva e una serie di riserva. Quando il set attivo viene prelevato, il collettore passa automaticamente ai serbatoi di sostituzione ordine di riserva impostato e del personale. L&#39;alimentazione è presente un sistema generatore di backup. Pluripotenti e cellule staminali neurali possono essere coltivate in condizioni di ipossia in questa struttura utilizzando i protocolli sviluppati in precedenza 9, con le complicazioni aggiunti inerenti alle apparecchiature romanzo. Le cellule staminali pluripotenti possono essere derivate utilizzando virus di Sendai, utilizzando anticorpi specifici pluripotenza per identificare colonie completamente transfettate, che vengono poi isolate ed espanse. (Figura 5A e B), Da queste iPSCs, cellule staminali neurali e neuroni possono essere derivate usando l&#39;inibizione doppia SMAD, e il loro fenotipo USI verificati<html> ng anticorpi NSC-specifici (Figura 5C e D). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figura 1. Interfaccia grafica per la produzione di celle strumento. (A) La rappresentazione grafica del CPF è la schermata di default e corrisponde al disegno CAD mostrato in Figura 3. Un clic del mouse sul buffer Modulo 1 (2F nella figura 1) apre il suo schermo di controllo (B), dove sono impostati O 2 valori per abbinare la camera di trattamento (3 nella Figura 3). Allo stesso modo, cliccando sul processo di Camera o Incubator 1 porta le loro rispettive schermate di controllo (C e D, rispettivamente), dove i valori possono essere modificati o controllati a seconda dei casi.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figura 2. The Cell Production Facility. (A) Il sistema come visto da una vista anteriore destra. Notare i collegamenti di alimentazione e di gas nel soffitto e il carrello con gli accessori microscopio e il computer a destra. (B) La cappa a flusso laminare con le porte di accesso ai moduli buffer visti a destra. (C) La camera di processo con i due incubatori (porte nere) visto nella parte posteriore. (D) Una vista attraverso il lato destro del sistema che mostra il microscopio e monitorare con le porte delle camere di tampone visto in lontananza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figura 3. Un disegno CAD della cella Production. Tutti gli elementi che entrano nel dispositivo vengono dapprima pulito con alcool ed aria secca nella cappa a flusso laminare (1). Gli articoli vengono quindi trasferiti nella atmosfera appropriata nel modulo front buffer (2F) prima di passare nel modulo UCPC, o Process sezione (3). Le cellule sono coltivate in due incubatrici (4, 5). Colorazione delle cellule vive, colonia raccolta, valutazione della morfologia cellulare generale e analisi di migrazione avviene nel modulo UPC, o Microscopio Camera (6). Infine, i rifiuti esce dal sistema attraverso il modulo di buffer posteriore (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figura 4. Fonti di gas e di potere. (A) Il collettore di CO 2 è una configurazione 4 x 4 in quanto fornisce tutti gli incubatori del laboratorio. (B) Il collettore O 2 è un 2 x 2 di installazione e fornisce solo l&#39;impianto di produzione di cellule. Azoto per il sistema è generata in un vaporizzatore (C, appena sotto il segno Exit) collegato ad un collettore azoto liquido (verso destra) che riempie anche automaticamente cryofreezers (in basso a sinistra). Il collettore è una configurazione 2 x 2 è rifornita da due coppie di 160 L serbatoi di azoto liquido. CO 2, O 2 e N 2 sono forniti dal soffitto tramite Shutoffs (D). Casa vuoto viene fornito anche in questa posizione. Visto appena dietro le Shutoffs gas di alimentazione sono una coppia di cavi elettrici che alimentano il sistema.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figura 5. cellule staminali pluripotenti derivate in ipossia con il virus di Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 iPSCs iPSCs (nomenclatura si trovano in Stover et al. 9), contrasto di fase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 iPSCs live-macchiato con AF-594-marcato Tra-1-60, diluizione 1: 100 in media. Tutti iPSCs sono state trasdotte nella struttura di produzione di celle a 5% O 2 con il virus di Sendai. (C) contrasto di fase di NSCs SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC-derivati, cresciuto al 5% O 2 in camera di diapositive. Le cellule sono state poi fissate in paraformaldeide al 4% e colorati con anticorpo primario Nestin anti-umano, e Alex-488 anticorpo secondario. Tutte le barre di scala sono a 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Ecco un protocollo per far crescere cellule staminali pluripotenti (PSC) e cellule staminali neurali (NSC) in un sistema di coltura cellulare chiuso che consente la massima sterilità e riproducibilità, sostituendo la tradizionale cappa di biosicurezza e l'incubatore. Questa apparecchiatura è conforme alle linee guida sulle buone pratiche cliniche di fabbricazione (cGMP) e sulle buone pratiche cliniche di laboratorio (cGLP).

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

L'obiettivo generale dell'utilizzo di questo equipaggiamento è coltivare cellule staminali in condizioni atmosferiche definite con la massima sterilità. Quello che andremo a dimostrare oggi è l'uso di una struttura chiusa per la coltura cellulare che consente un controllo preciso dei parametri della coltura. Nel nostro laboratorio, utilizziamo questa struttura per la coltura di cellule staminali multipotenti e cellule staminali pluripotenti.Il vantaggio principale di questo metodo è che le cellule sono esposte a un ambiente costante indipendentemente dalla loro posizione durante l'elaborazione. Che si tratti di manipolare le cellule, di mantenerle nell'incubatrice o di osservarle al microscopio, l'esposizione a ossigeno, CO2 e temperature rimane costante per tutto il ciclo. La procedura sarà dimostrata da Alexander Stover, un ricercatore del mio laboratorio.Per iniziare questa procedura, fare clic su un modulo per regolare la concentrazione del gas. Nella nuova finestra che mostra le impostazioni correnti, fare clic sul valore predefinito di ossigeno esistente sotto Impostazione e inserire la concentrazione di ossigeno richiesta per questo modulo. Successivamente, fare clic sul segno di spunta verde per confermare l'impostazione.Ripetere questa operazione per l'anidride carbonica e impostare un valore di riferimento del 5% di anidride carbonica per tutti i moduli, ad eccezione delle camere tampone che sono regolabili solo per l'ossigeno. Successivamente, monitorare le concentrazioni attuali dei gas, indicate come Valori di processo, per assicurarsi che raggiungano i nuovi valori di riferimento. In seguito, regolare i valori di riferimento dei gas di tutti i moduli ai valori appropriati.Regolare i livelli di anidride carbonica e ossigeno nelle camere che verranno esposte l'una all'altra. Ad esempio, regolare la camera di processo al 5% di ossigeno prima di aprire un'incubatrice che coltiva cellule al 5% di ossigeno. Regolare anche la camera tampone utilizzata per aggiungere materiali alla camera di processo al 5% di ossigeno.Successivamente, impostare la temperatura della camera di processo a 37 gradi Celsius utilizzando la stessa schermata per le regolazioni del gas. Dopodiché, impostare la temperatura del fondo della camera di processo a 37 gradi Celsius. Fare clic sulle unità del modulo di incubazione al di sotto di ciascun incubatore e regolare la temperatura delle unità a 37 gradi Celsius.Nella cappa a flusso laminare, spruzzare tutti i materiali che devono essere introdotti nel sistema con etanolo al 70% e lasciarli asciugare. Pulire delicatamente qualsiasi fiala o piastra contenente cellule con una garza sterile imbevuta di etanolo al 70%. Successivamente, assicurarsi che sia la porta esterna che quella interna della camera tampone siano saldamente chiuse, quindi aprire la porta esterna, inserire gli oggetti e richiuderla.Utilizzando il software, selezionare il modulo tampone e fare clic sulla scheda Fattore di diluizione. Inserire uno nella casella Fattore logaritmico, quindi fare clic su Avvia. Una volta che l'interfaccia grafica ha smesso di lampeggiare su Fattore di diluizione, aprire la porta interna della camera tampone e trasferire i materiali nella camera di processo.Per rimuovere oggetti dalla camera di processo, assicurarsi innanzitutto che la camera tampone abbia subito un fattore di diluizione. Successivamente, aprire la porta interna, posizionare gli oggetti da rimuovere all'interno e chiuderla. Dopodiché, aprire la porta esterna ed estrarre gli oggetti.Posizionare tre piastre di Petri nel vassoio dell'acqua alla base di ogni incubatore. Riempire queste piastre con acqua sterile e mantenere il livello dell'acqua in queste piastre, poiché è fondamentale per mantenere il valore impostato di umidità relativa nell'incubatore. Nell'interfaccia grafica, fare clic sull'incubatore.Successivamente, fare clic sul valore esistente di umidità relativa nella soglia e inserire il valore del 85%. Quindi, fare clic sul segno di spunta verde per confermare questo valore. Successivamente, regolare le camere tampone, la camera di processo e un'incubatrice ai valori di gas richiesti per il tipo di cellule da utilizzare. Pulire la superficie della camera di processo con garza sterile e un disinfettante non infiammabile, come un prodotto a base di cloruro di benzalconio.Quindi, pulire i guanti e le superfici comunemente toccate, come le maniglie delle porte. Successivamente, pulire la superficie della cappa a flusso laminare e della camera tampone con etanolo al 70% e lasciare asciugare. Dopodiché, posizionare il flacone o la piastra con le cellule nella cappa e passare brevemente una garza sterile imbevuta di etanolo sulla superficie esterna.Quindi, posizionare il pallone o la piastra nella camera tampone ed eseguire un fattore di diluizione. Al termine, trasferire immediatamente il pallone o la piastra nell'incubatore appropriato. Poiché l'incubatore si trova nella parte posteriore della camera di processo, estrarre un ripiano all'interno della camera di processo per posizionare le cellule ed evitare di aprire le porte dell'incubatore per periodi prolungati e senza necessità.In questo passaggio, preparare il mezzo di coltura cellulare. Lasciare il mezzo in equilibrio con i livelli di anidride carbonica e ossigeno presenti nel sistema, lasciando il contenitore del mezzo leggermente aperto per 20 minuti. Successivamente, rimuovere il mezzo vecchio dalle pozzette.Per le cellule staminali pluripotenti, rimuovere quasi tutto il vecchio mezzo, lasciando una piccola quantità di mezzo vecchio per prevenire la disidratazione durante il processo di alimentazione. Per le cellule staminali neurali, rimuovere metà del vecchio mezzo. Successivamente, aggiungere mezzo fresco alle piastre di coltura cellulare e riposizionare le piastre nell'incubatore designato.Qui è mostrata un'immagine delle iPSC. Ecco le iPSC vitali colorate con Trial 160 marcato con AF594 in una diluizione 1:100 nel mezzo di coltura. Tutte le iPSC sono state transdotte nel laboratorio di produzione cellulare in presenza di ossigeno al 5% mediante virus Sendai.Ecco l'immagine a contrasto di fase di cellule staminali neurali derivate da iPSC coltivate al 5% di ossigeno in camere portaoggetti. Le cellule sono state quindi fissate in paraformaldeide al 4% e colorate con l'anticorpo primario Anti-Human Nestin e l'anticorpo secondario Alexa Fluor 488. Una volta acquisite, queste tecniche possono essere eseguite in due ore se effettuate correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di impostare correttamente le concentrazioni dei gas prima di iniziare. Dopo la procedura, possono essere eseguiti altri metodi come il riprogrammamento e la differenziazione, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'effetto dell'ipossia sulla pluripotenza o sulla multipotenza. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali per esplorare la produzione clinica di cellule per il trattamento dei disturbi neurodegenerativi pediatrici.

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Biologia dello sviluppo

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Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca (Video) | JoVE Journal

Coltura umane pluripotenti e neurali cellule staminali in un sistema di coltura cellulare chiuso per base e preclinica di ricerca

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