Name: I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Scopri metodi in silico per identificare l'uso di promotori alternativi nel gene murino Bcrp1 e valutarne la funzionalità mediante saggi reporter a luciferasi. Questa tecnica sfrutta dati genetici pubblici.

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Questo lavoro è stato sostenuto da Merit Review Awards per Douglas D. Ross e per Arif Hussain dal Department of Veterans Affairs.

1. previsione in silico della alternativi primi esoni del Bcrp1 Usando BLAST Analisi del mouse EST database Nota: Questo protocollo viene descritto come cercare il tag del mouse sequenza espressa (EST) del database per EST con similarità di sequenza di esone 2 di Bcrp1 (che contiene il sito di inizio traslazionale) e poi come allineare le corrispondenti sequenze EST di sequenze genomiche per accertare il loro posizione nel topo Bcrp1 gene rispetto alla estremità 5 &#39;di Bcrp1 dell&#39;esone 2. <ol><li> Ottenere la sequenza per il mouse Bcrp1 esone 2 inserendo l&#39;ID sequenza di riferimento di mRNA (NM_011920.3) nella finestra di ricerca del Ensembl Genome Browser 17, cliccare su &quot;GO&quot;. Nella schermata successiva, selezionare una sequenza full-length (contiene 16 esoni): <ol><li> Nella schermata successiva ( &quot;Trascrizione a base Display&quot;), selezionare &quot;16 esoni.&quot; Verrà visualizzata una schermata che contiene la sequenza di tutti gli esoni di Bcrp1. Exon 2 di Bcrp1 leggerà &quot;59; -AAAGGC ... TATCAA-3 &#39; &quot;I risultati ottenuti saranno simili a quelli mostrati in riferimento 18.. </li><li> Fare clic sull&#39;opzione &quot;Download sequenza&quot;. Nella schermata successiva, scegliere il formato FASTA, e quindi fare clic su &quot;Anteprima&quot;. Nella schermata successiva, copiare la sequenza Anteprima dell&#39;esone 2 negli appunti. </li></ol></li><li> Passare alla home page BLAST 19 sul National Center for Biotechnology Information (NCBI) sito web 20. <ol><li> Selezionare genoma &quot;Mouse&quot;. Incollare la sequenza dell&#39;esone 2 dagli appunti nella casella di ricerca. </li><li> Seleziona &quot;EST&quot; dal menu a discesa del database, ottimizzare per &quot;sequenze altamente simili,&quot; e quindi scegliere &quot;BLAST&quot;. Durata richiederà alcuni minuti. Quando la corsa BLAST è completo, verrà visualizzata la pagina &quot;Risultati&quot;. </li><li> Sotto la voce &quot;Descrizione&quot; della pagina &quot;Risultati&quot;, selezionare &quot;ALL&quot;, quindi &quot;Download&quot;, quindi &quot;FASTA (completosequenza) &quot;nel menu a discesa, e poi scegliere&quot; Continua &quot;Apparirà un file txt,. aprire e copiare l&#39;intero file negli appunti Il file txt contiene le sequenze di tutte le EST ad alta sequenza somiglianza con il exon2 del mouse Bcrp1. ma non la loro posizione rispetto al esone 2 del gene Bcrp1. Nota: L&#39;analisi eseguita su 15 aprile 2015 ha individuato 14 EST murini che allineata con Bcrp1 esone 2. Questi sono elencati nella tabella 1. </li></ol></li><li> Identificare la posizione della sequenza EST che è 5 &#39;to esone 2 del gene Bcrp1. Il gene del mouse Bcrp1 si trova nel cromosoma 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104). <ol><li> Sulla homepage BLAST sotto il sottotitolo &quot;Blast Specialized&quot;, selezionare &quot;Allinea due (o più) sequenze utilizzando BLAST (bl2seq).&quot; </li><li> Incollare il file di testo dagli appunti nella casella di ricerca e digitare 372099104 nella casella sequenza di soggetto. Ottimizza per &quot;sequenze altamente simili&quot; nell&#39;ambito del programmaselezione e BLAST eseguire. </li><li> Una volta visualizzata la finestra dei risultati, visualizzare gli allineamenti graficamente cliccando su &quot;Grafica&quot; nella finestra &quot;allineamenti&quot;. Utilizzare le frecce destra e sinistra e zoom per concentrarsi su Bcrp1 / ABCG2 e gli allineamenti di sequenze. </li><li> Salvare gli allineamenti di sequenza: selezionare &quot;ALL&quot; nella casella &quot;Descrizione&quot;, poi sotto il &quot;download&quot; a discesa selezionare &quot;Hit tabella (CSV),&quot; e quindi fare clic su &quot;continua&quot;. Questo file contiene l&#39;allineamento di sequenze di Bcrp1 esone 2 e l&#39;allineamento di tutte le sequenze EST con similarità di sequenza a Bcrp1 exon2 relative alla numerazione dei nucleotidi nel topo cromosoma 6 contig. Ogni sequenza completa EST potrebbe generare più allineamenti che abbracciano le regioni 5 &#39;e 3&#39; to esone 2 comprese le sequenze che si sovrappongono con Bcrp1 esone 2. </li><li> Poiché la posizione di estremità 5 &#39;dell&#39;esone 2 corrisponderà al nucleotide 58.655.638 nel cromosoma 6 contig, designare questo come+1, Quindi calcolare la posizione delle sequenze parziali di ciascun EST 5 &#39;a 58.655.638. I risultati per le 14 EST sono riportati nella tabella 1. Nota: Fare attenzione ad analizzare le sequenze EST che sono 5 &#39;a +1 (ad esempio, avere un valore negativo nucleotide) come potenziali primi esoni. Ad esempio, in due delle EST che allineati con Bcrp1 esone 2 mostrato nella Tabella 1 (AI647825 e AI664571) la sequenza rimanente era 3 &#39;to esone 2. </li></ol></li></ol> Funzione 2. Valutazione di Bcrp1 Alternative Promotore <ol><li> Progettazione di giornalista costrutti per Bcrp1 E1U, E1A, E1B e promotori E1C <ol><li> Utilizzando la sequenza di E1U ottenuto dalla ricerca nel database EST, designare i primi 5 &#39;nucleotide di E1U come +1. </li><li> Ottenere un cromosoma artificiale batterico (BAC) clone di topo cromosoma 6 che contiene la sequenza genica Bcrp1 / ABCG2 e la sequenza di almeno 100 kb a monte dellaBcrp1 / ABCG2 gene (vedi elenco dei materiali e attrezzature). <ol><li> Identificare un adatto vettore giornalista come la luciferasi giornalista plasmide pGL3-base. </li><li> Determinare i polylinker nel vettore giornalista. KpnI, Saci Mlu1, NheI, Smal, XhoI, BglII e HindIII sono i siti di restrizione endonucleasi nel sito di clonazione multiplo del vettore pGL3-base, nel 5 &#39;a 3&#39; orientamento. Nota: La sequenza dei siti di digestione è disponibile da cataloghi di prodotti di aziende che producono gli enzimi di restrizione. </li><li> Identificare tutti i siti di digestione della esone E1U e la regione 2 kb 5 &#39;di E1U utilizzando programmi software come DNA5. Individuare almeno due siti di digestione nel polylinker pGL3-base che non si trovano in E1U o la regione a monte 2 kb. Nota: assicurarsi di scegliere un sito di restrizione polylinker per il primer in avanti che sta a monte di quello scelto per il primer inverso per assicurare che il wil insertol è nella corretta posizione. </li></ol></li><li> Preparare in avanti e primer per PCR che contengono sequenze per i siti multipli di restrizione sito di clonazione endonucleasi PGL3-base selezionati che utilizzano i servizi di sintesi del gene / primer commerciali o software selezione di primer (vedi elenco dei materiali e attrezzature) retromarcia. Selezionare un primer in avanti trova ~ 2 kb a monte della sequenza di E1U e un primer inverso all&#39;interno della sequenza E1U. I primers utilizzati nei autori lavoro precedente incorporati un sito SacI nel primer forward, e un sito NheI nel primer reverse, e amplificate la regione genomica da circa -1.906 al +64 con il primo 5 &#39;nucleotide di E1U specificato come + 1 (vedi al punto 2.1.1), e sono fornite in riferimento 16. <ol><li> PCR amplifica la regione genomica E1U l&#39;utilizzo di questi fondi, 0,01-1 mg del BAC, e la PCR master mix contenente Taq polimerasi ad alta fedeltà (vedi elenco di materiali e attrezzature) con denaturazione a95 ° C per 30 sec, quindi 35 a 40 cicli di PCR, con estensione a 72 ° C (2 minuti), e ricottura e temperature di fusione in base alle caratteristiche di fusione dei primer utilizzati. Nota: L&#39;uso di alta fedeltà Taq polimerasi è essenziale per le regioni promotrici sequenziamento che hanno un elevato contenuto di GC. Quando si utilizzano grandi frammenti di DNA genomico, come un tasso alcolemico come modello, la struttura secondaria del DNA genomico può rendere difficile per primer PCR per legare. Se questo problema si pone, migliori risultati PCR possono essere ottenuti se il modello DNA genomico lungo viene tagliata delicatamente per sonicazione prima della reazione di PCR. </li><li> Rilevare la lunghezza del prodotto di PCR amplificato confrontando contro una scaletta DNA 1 kb usando 0,8% TAE gel di agarosio. </li></ol></li><li> Digerire il prodotto PCR ottenuto e il vettore pGL3-Basic, utilizzando l&#39;endonucleasi di restrizione specifica per i siti di digestione di restrizione introdotte nel primer avanti e indietro secondo instructions forniti con gli enzimi di restrizione digestione. <ol><li> Purificare le reazioni di digestione mediante gel SV commerciale e kit per la PCR Clean-Up Systems (vedi Lista dei Materiali e attrezzature), seguendo il protocollo kit di 21. <ol><li> Verifica digestione e linearizzazione del vettore confrontando il vettore uncut usando elettroforesi su gel di agarosio, quindi tagliare e purificare il DNA band vettore digerito. Misurare la concentrazione del prodotto purificato PCR e il vettore purificato mediante spettrometria UV (vedi elenco dei materiali e attrezzature). </li></ol></li></ol></li><li> Preparare il giornalista costrutto E1U legando il purificato, enzima di restrizione digerito prodotto di PCR e pGL3-Basic lucciola luciferasi giornalista vettore (contenuta nel kit di analisi giornalista, vedere elenco dei materiali e macchinari) a inserto: rapporti di vettore di 11, 21 e 31, utilizzando il &quot;T4 DNA ligasi kit legatura rapida&quot; come da istruzioni del kit 22, producendo in tal modo la E1U reporter costrutto, chiamato pGL3-E1U. <ol><li> Utilizzare il plasmide pGL3-E1U per trasformare i batteri per espandere clonale pGL3-E1U seguenti istruzioni nel kit di clonazione TA (vedi elenco dei materiali e attrezzature). </li><li> Conferma l&#39;orientamento e la fedeltà dell&#39;inserto mediante analisi di sequenza. </li></ol></li><li> Preparare giornalista costrutti per E1A, E1B e E1C utilizzando la metodologia simile a quella per E1U. Confermare la fedeltà degli inserti di sequenziamento come nella sezione 2.1.5.2. Nota: Gli inserti promotore per E1A, E1B e E1C dovrebbe essere di circa -1875 / + 10, -1847 / + 60, e -1904 / + 83 rispetto al primo 5 &#39;nucleotide (designato come +1) di E1A, E1B, o E1C rispettivamente. </li></ol></li><li> Metodi di analisi Reporter Nota: Strategia generale di saggi Reporter: il promotore putativo (5 &#39;upstream regione) di un gene viene inserito nel sito di clonazione multiplo di un vettore vuoto &quot;reporter&quot; che contiene un &quot;reporter gene &quot;(ad esempio, lucciola luciferasi) a valle del sito di clonaggio multiplo. Il vettore viene poi trasfettato in cellule eucariotiche che esprimono il gene di interesse. I fattori trans-acting che promuovono l&#39;espressione del gene di interesse in queste cellule deve attivare la promotore nel vettore giornalista transfettate, causando espressione di luciferasi di lucciola, che può essere facilmente quantificato con un saggio luminescenza. <ol><li> Selezionare la linea cellulare appropriata da utilizzare per il saggio giornalista. Nota: Per valutare l&#39;attività del promotore E1U alternativa giornalista costrutto, è necessario trasfezione che costruiscono in cellule che esprimono Bcrp1 sotto il controllo del promotore E1U. La linea cellulare murina Sertoli TM4 (vedi elenco dei materiali e macchinari) esprime la proteina Bcrp1 e Bcrp1 mRNA contenente E1U, così come E1A, E1B, e E1C 5. Come controllo negativo, considerare l&#39;utilizzo di una linea cellulare che non esprime la proteina Bcrp1 o mRNA. </li><li> Cultura ce TM4lls in piastre da 24 pozzetti ad una densità iniziale di 200.000 cellule / pozzetto in una miscela 1: 1 di mezzo F12 di Ham modificandoli mezzo di Dulbecco Eagle con bicarbonato di sodio 1,2 g / L, 15 mM HEPES integrato con 5% siero di cavallo, 2,5% siero fetale bovino, penicillina (100 UI / ml), e streptomicina (100 ug / ml), a 37 ° C, 5% CO 2, come descritto in precedenza 5. </li><li> Sei ore dopo aver piazzato le cellule in coltura, trasfezione le cellule con 0,2 mcg di vettore vuoto pGL3-base o con 0,2 mg di pGL3 vettore contenente il E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 delezione costruire insieme a 4 ng di prl-TK (un Renilla luciferasi che esprimono vettore) come controllo interno, utilizzando un kit trasfezione del DNA commerciale e il protocollo 23 del produttore (vedi elenco dei materiali e attrezzature) . </li><li> 30 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto della crescita della culturEd transfettate cellule. Lavare le cellule una volta con 200 ml di PBS, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. <ol><li> Misurare lucciola e Renilla attività luciferasi utilizzando un kit commerciale secondo i protocolli 24 del produttore. </li></ol></li><li> Esprimere l&#39;attività per ciascun tubo come il rapporto tra l&#39;attività della luciferasi di lucciola diviso per il (luciferasi Renilla) controllo interno; risultati complessivi sono generalmente espressi come attività di ciascuna giornalista costrutto rispetto a quello delle cellule trasfettate con il vuoto pGL3 vettore di base, che è dato un valore 1. </li></ol></li></ol>

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<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Bulun, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aromatase+expression+in+breast+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue.</a> Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).</li>
</ol>

Douglas D. Ross e l&#39;Università del Maryland, Baltimora titolari di diritti di brevetto per BCRP umana.

La maggior parte dei metodi e dei risultati rappresentativi presentati sono descritti nel precedente lavoro intitolato &quot;B crp1 trascrizione nei testicoli del mouse è controllato da un promotore a monte di un romanzo primo esone (E1U) regolato da steroidea fattore-1&quot;, che è stato pubblicato nel 2013 5 . Oltre ai risultati rappresentativi raffigurati, la carta precedente fornito stime delle alternative prima utilizzazione esone usando 5&#39;-RACE metodologia PCR e RT-PCR. Inoltre, in-sili...

Più della metà dei geni umani sono regolati dai promotori alternativi 1. Ogni promotore alternativa può contenere elementi regolatori che possono essere diverse da quelle degli altri promotori alternativi. Il promotore (s) utilizzato in un tessuto può differire da quelli utilizzati in un altro tessuto. Ad esempio, è possibile che l&#39;attivazione di un dato percorso di segnalazione può attivare il promotore alternativa a un gene utilizzata in un tessuto, ma non hanno alcun effetto o reprimere un promotore alternativa separato per lo stesso gene che viene utilizzata in un altro tessuto. L&#39;espressione del gene Bcrp1 è governato da promotori alternativi. Bcrp1 è il ortologo murino del gene materno Resistenza Cancer Protein (BCRP). BCRP è un trasportatore di ATP-binding cassette (ABC), ABCG2 2, 3 formalmente designato. Come una proteina di membrana apicale, BCRP funzioni / Bcrp1 di efflusso una vasta gamma di substrati naturali e xenobiotici <sup&gt; 3, 4. Negli esseri umani e topi, BCRP / Bcrp1 è altamente espresso negli organi farmacologicamente rilevanti come fegato (canalicoli biliari), intestino e reni, nonché organi con barriere sangue-tessuto come placenta, cervello e testicoli 2, 5 - 12. L&#39;espressione di BCRP / Bcrp1 in ematopoietiche e di altre cellule staminali, comprese le cellule staminali del cancro, può conferire resistenza di queste cellule di xenobiotici e cancro farmaci chemioterapici 3. Nel lavoro presto per capire la regolazione dell&#39;espressione BCRP in cellule normali e neoplastiche, 5 &#39;rapida amplificazione del cDNA estremità (5&#39;-RACE) analisi di BCRP mRNA è stata eseguita per determinare il suo sito di inizio della trascrizione esatta 13. Non solo erano più siti di inizio della trascrizione trovati; anche incontrato erano tre forme alternative di primo esone, che a sua BCRP è tradotto. Queste alternative primi esoni - designati E1a, E1b, E1c - sono stati espressi in modo diverso in una varietà di tessuti umani. Due ulteriori varianti primo esone sono stati scoperti in una ricerca BLAST del database EST umana utilizzando il secondo esone del BCRP 13. Quattro partite rivelato un primo esone&gt; 70 kb a monte dell&#39;esone 2 che sono stati designati E1U; altre quattro partite hanno rivelato BCRP mRNA che mancava di un primo esone del tutto, che sono stati designati E1 13. La presenza di esoni capo alternativi è considerato una manifestazione di utilizzo promotore alternativa 14. Nei topi, quattro alternative primi esoni di Bcrp1 sono descritte che può corrispondere ai promotori alternativi che governano BCRP 1 trascrizione in diversi tessuti di topo; questi esoni / promotori sono designati E1U, E1A, E1B e E1C, e si trovano a circa 70, 58, 15, e 5 kb a monte Bcrp1 esone 2 5, 15. L&#39;isoforma E1A mRNA è risultata predominante in MurinLe cellule staminali ematopoietiche e, cuore, polmone, milza e cervello, mentre l&#39;isoforma E1B è stata espressa in nell&#39;intestino del mouse, le cellule del fegato fetale, e precursori eritroidi nel midollo osseo 5, 15. Il promotore a monte E1B ha dimostrato di essere il principale promotore di alternativa di governo Bcrp1 trascrizione nell&#39;intestino del mouse, regolato almeno in parte, da fosfo-ciclico-AMP risposta elemento binding protein (p-CREB) e un elemento di risposta CREB unico per quella alternativa promotore Bcrp1 16. L&#39;isoforma E1C mRNA è prevalentemente espresso nel fegato murino adulti e reni 5. L&#39;isoforma E1U è rilevabile nella maggior parte dei tessuti esaminati eccetto testicolo murino, dove è l&#39;isoforma predominante espresso 5. Bcrp1 espresso in testicoli di ratto si trova in entrambe le somatiche (giunzioni strette endoteliali, cellule myoid peritubulari, e cellule di Sertoli) e le cellule germinali (nel endotelio seminifero, dove si può proteggere spermatidi fase tardo-4). il region monte E1U contiene un elemento di risposta funzionale per steroidea factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA e di proteine ​​sono marcatamente ridotti nei testicoli di topi knockout Sertoli cellule specifiche SF-1, suggerendo che l&#39;espressione Bcrp1 in cellule di Sertoli murine è controllato da SF-1 5. I protocolli presentati metodi dettaglio per rilevare alternative primi esoni del Bcrp1 in-silico, e di stabilire saggi luciferasi-based per i promotori putativi monte dalle prime esoni alternativi individuati.

<table><tbody><tr><td colspan="4">MATERIALI E KIT BIOLOGICI COMMERCIALI:</td></tr><tr><td>Kit RLM-RACE di prima scelta</td><td>Ambion Inc., Austin, TX, attualmente disponibile tramite Life Technologies</td><td>AM1700</td><td>Kit PCR 5'-RACE</td></tr><tr><td>Kit di clonazione TOPO TA</td><td>Life Technologies</td><td>K450001</td><td>Questo kit contiene i batteri TOP10 chimicamente competenti E. coli.</td></tr><tr><td>Kit di legatura rapida T4 DNA ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Taq- DNA polimerasi</td><td>Sigma-Aldrich/Roche</td><td>3553400001/RMB-4738284001&nbsp;</td><td>Contiene una miscela di enzimi polimerasi Taq ad alta fedeltà</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione del DNA XtremeGENE HP</td> Kit di dosaggio <td>reporter Roche</td><td>6366236001</td><td></td></tr><tr><td>Dual-luciferase</td><td>Promega</td><td>E1910</td><td>Include il vettore reporter vuoto pGL3-basic (luciferasi di lucciola), il vettore che esprime la luciferasi renilla pRLTK e altri vettori di controllo.</td></tr><tr><td>QIAprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Per miniprep plasmidico - isolamento e purificazione del DNA plasmidico da colonie batteriche,</td></tr><tr><td>vettore pCR2.1</td>, <td>parte del kit</td><td></td><td></td>di clonaggio TOPO TA, luciferasi</tr><tr><td>basica pGL3-contenente il vettore</td><td>Promega</td><td>E1751</td><td></td></tr>, <tr><td>pRL-TK, Renilla, luciferasi che esprime il vettore</td><td>Promega</td><td>E2241</td><td></td></tr>, <tr><td>cromosoma artificiale batterico</td><td>Centro risorse BACPAC, Bambini s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA</td><td>RP23-285A12 e RP24-314E24</td><td>http://bacpac.chori.org/clones.htm</td></tr><tr><td colspan="4">REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Life Technologies</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&reg; Sistema di pulizia SV Gel e PCR&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Utile per purificare i prodotti PCR dopo la digestione con endonucleasi di restrizione</td></tr><tr><td>CRYOVIALS Denville</td><td>Scientific</td><td>V9012</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">SOFTWARE:</td></tr><tr><td>Ensembl software</td><td>Progetto Ensembl</td><td>http://Ensembl.org&nbsp;</td><td>Il progetto Ensembl produce banche dati genomiche per vertebrati e altre specie eucariotiche e rende queste informazioni disponibili gratuitamente online.</td></tr><tr><td>Software di sabbiatura</td><td>NCBI</td><td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Rete & PAGE_TYPE=BlastHome</td><td></td></tr><tr><td>Primer 3 software</td><td>Simgene</td><td>http://simgene.com/Primer3</td><td>Utile per la progettazione di primer per 5'-RACE PCR</td></tr><tr><td>NCBI Database nucleotidico</td><td>NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">LINEE CELLULARI:</td></tr><tr><td>TM4 cellule di Sertoli murino</td><td>ATCC, Manassas, Virginia</td><td>CRL-1715&commercio;</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">INSTRUMENTS:</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Turner Biosystems</td><td>TD-20/20</td><td>Questo è un luminometro relativamente economico, azionato manualmente. Sono disponibili anche sistemi automatizzati dello stesso produttore che utilizzano piastre da 96 pozzetti.</td></tr><tr><td>Spettrofotometri NanoDrop</td><td>Thermo Scientific, Inc.</td>Lo spettrofotometro <td>NanoDrop 2000</td><td>può utilizzare quantità molto piccole di campione</td></tr><tr><td>DU 800 UV/VIS spettrofotometro e software per l'analisi degli acidi nucleici II</td><td>BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA</td><td>DU 800</td><td></td></tr></tbody></table>

i metodi per scoprire alternative uso promotore e regolazione trascrizionale di murine bcrp1

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

L&#39;espressione genica in diversi tessuti è spesso controllata da promotori alternativi che risultano nella sintesi di mRNA con uniche - di solito non tradotte - primi esoni. Bcrp1 (ABCG2), il ortologo murino della ABC trasportatore Breast Cancer Resistenza Protein (BCRP, ABCG2), ha almeno quattro promotori alternativi che sono designati dai corrispondenti quattro primi esoni alternativi prodotte: E1U, E1A, E1B, e E1C. Qui, in-silico protocolli vengono presentati per prevedere l&#39;utilizzo promotore alternativa per Bcrp1. Inoltre, metodi di analisi giornalista sono descritti per produrre costrutti reporter per promotori alternativi e per determinare la funzionalità dei promotori putativi monte dei primi esoni alternativi identificati.

Identificazione di BCRP 1 alternativa utilizzo promotore nei testicoli del mouse attraverso l&#39;analisi degli esoni capo Quando il database EST a NCBI era sondato (aprile 2015) utilizzando la procedura descritta nel protocollo 1, le EST scoperto che erano contigui con 5 &#39;dell&#39;esone 2 in BCRP 1 mRNA sono riportati nella tabella 1, in...

Con il murino ABC trasportatore Bcrp1 (ABCG2), come esempio, in-silico protocolli sono presentati per rilevare utilizzo promotore alternativo geni espressi in tessuti di topo, e per valutare la funzionalità dei promotori alternativi identificati mediante saggi del reporter.

I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually ...

L'obiettivo generale di questo insieme di protocolli è rilevare esoni alternativi nel mRNA di un gene come Bcrp1 e stabilire saggi di reporter basati sulla luciferasi per i promotori putativi localizzati a monte degli esoni iniziali alternativi identificati. I metodi informatici utilizzati possono contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della trascrizione e della regolazione, ad esempio come l'espressione del mRNA è controllata in diversi tessuti. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nell'utilizzo di dati genetici pubblicamente disponibili per identificare esoni iniziali alternativi nel mRNA del gene di interesse, il che implica un utilizzo alternativo del promotore.Questo metodo che prepara costrutti reporter ed esegue saggi di reporter può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della regolazione genica, come l'attività funzionale di promotori alternativi ipotetici. Per iniziare questa procedura, ottenere la sequenza dell'esone 2 di Bcrp1 del topo inserendo l'ID di riferimento della sequenza mRNA nella finestra di ricerca del browser genomico Ensembl e fare clic su Vai. Successivamente, selezionare una sequenza completa che contenga 16 esoni. Fare clic sull'opzione Scarica sequenza.Quindi, selezionare il formato FASTA e fare clic su Anteprima. Nella schermata successiva, copiare la sequenza di anteprima dell'esone 2 negli appunti. Accedere alla pagina principale di blast sul sito web del NCBI.Selezionare il genoma del topo. Incollare la sequenza dell'esone 2 dagli appunti nella casella di ricerca. Successivamente, selezionare ESTs dal menu a tendina Database.Ottimizzarlo per sequenze altamente simili e quindi scegliere BLAST. Al termine dell'analisi BLAST, verrà visualizzata la pagina dei risultati. Nella sezione Descrizioni della pagina dei risultati, selezionare Tutti, quindi Scarica, seguito da FASTA nel menu a discesa, e infine scegliere Continua.Apparirà un file di testo. Aprirlo e copiare l'intero contenuto negli appunti. Per identificare la posizione della sequenza EST che si trova a monte dell'esone 2 nel gene Bcrp1, nella homepage di BLAST, sotto il sottotitolo BLAST specializzato, selezionare Allinea due sequenze utilizzando BLAST.Incollare il file di testo dagli appunti nella casella della query e inserire 372099104 nella casella Subject Sequence. Ottimizzare per sequenze altamente simili nella sezione Program Selection ed eseguire BLAST. Una volta visualizzata la finestra dei risultati, esaminare allineamenti in forma grafica cliccando su Graphics nella finestra degli allineamenti.Utilizzare le frecce destra e sinistra e lo zoom per concentrarsi su Bcrp1/ABCG2 e sui allineamenti di sequenza. Quindi, salvare gli allineamenti di sequenza selezionando Tutti nella casella Descrizioni. Nell'elenco a discesa Scarica, selezionare Tabella dei risultati e quindi fare clic su Continua.Poiché la posizione dell'estremità 5' dell'esone 2 corrisponde al nucleotide 58.655.638 nel contig del cromosoma 6, designare questa come più uno e quindi calcolare la posizione delle sequenze parziali di ciascun EST a monte rispetto al 58.655.638. Un passaggio critico di questa procedura è la previsione di multipli esoni iniziali. I promotori alternativi vengono pertanto identificati in questo punto.Utilizzando la sequenza di E1U ottenuta dal database EST, designare il primo nucleotide all'estremità cinque prime di E1U come più uno. Ottenere un clone inverso del cromosoma sei del topo che contenga la sequenza del gene Bcrp1/ABCG2 e la sequenza di almeno 100 chilobasi a monte del gene Bcrp1/ABCG2. Successivamente, identificare un vettore reporter adatto, come il plasmide reporter della luciferasi pGL3-Basic.Determinare i siti di clonaggio multipli nel vettore reporter. I siti di restrizione endonucleasi nel sito di clonaggio multiplo del vettore pGL3-Basic, nell'orientamento da cinque prime a tre prime, sono KpnI, SacI, MluI, NheI, SmaI, XhoI, BglII e HindIII. Successivamente, selezionare la regione di due chilobasi a monte dell'esone E1U e incollare la sequenza in DNA5 prima di eseguire il programma.Verrebbero visualizzati i dettagli dei siti di digestione singoli e multipli. Successivamente, confrontare l'elenco dei siti di digestione della regione E1U con il sito multiplo di clonaggio (MCS) sul vettore pGL3-Basic in un foglio Excel. In seguito, preparare primer forward e reverse per la PCR che contengano siti per enzimi di restrizione, utilizzando servizi commerciali di sintesi di primer genici o software di selezione dei primer.Selezionare un primer diretto posizionato circa due chilobasi a monte della sequenza E1U e un primer inverso all'interno della sequenza E1U. Successivamente, amplificare la regione genomica E1U utilizzando questi primer con da 0,01 a un microgrammo di Bak e una miscela maestra PCR contenente una polimerasi Taq ad alta fedeltà. In seguito, verificare la lunghezza del prodotto PCR amplificato confrontandolo con un marcatore di DNA da un chilobase mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,8% in tampone TAE.In seguito, digerire il prodotto PCR ottenuto e il vettore pGL3-Basic utilizzando endonucleasi di restrizione specifiche per i siti di digestione introdotti nei primer diretto e inverso. Successivamente, verificare la digestione del prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio. Tagliare dal gel di agarosio il vettore digerito e la banda PCR di due chilobasi.Successivamente, estrarre il DNA del vettore digerito e la banda PCR di due chilobasi dai frammenti di gel utilizzando un kit commerciale per la purificazione di gel e PCR. Misurare la concentrazione del prodotto PCR purificato e del vettore purificato mediante spettrometria UV. In seguito, preparare il costrutto reporter E1U legando il prodotto PCR purificato, digerito con enzimi di restrizione, e il vettore reporter di luciferasi di *Photinus pyralis* pGL3-Basic, utilizzando il kit di ligasi T4 DNA per ligazione rapida, ottenendo così il costrutto reporter E1U denominato pGL3 E1U.In questo passaggio, coltivare le cellule TM4 in piastre a 24 pozzetti a una densità iniziale di 200.000 cellule per pozzetto. Sei ore dopo aver posizionato le cellule in coltura, trasfettare le cellule con 0,2 microgrammi di vettore MP pGL3-Basic o con 0,2 microgrammi di vettore pGL3 insieme a quattro nanogrammi di pRL-TK come controllo interno. Trenta ore dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo di crescita dalle cellule trasfettate.Lavare le cellule con PBS, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio. Successivamente, misurare l'attività della luciferasi di firefly e di Renilla utilizzando un kit commerciale. Esprimere l'attività per ogni provetta come rapporto tra l'attività della luciferasi di firefly e il controllo interno.Questo passaggio conferma l'attività funzionale del promotore specifico del testicolo. Di seguito è riportato il saggio del reporter per i promotori E1U, E1A, E1B ed E1C di Bcrp1 nei bulbi, derivati interamente da cellule TM4. I dati sono espressi come luminescenza della luciferasi di lucerna normalizzata rispetto a quella della luciferasi di Renilla.L'asterisco indica una differenza significativa rispetto al controllo con il vettore MP pGL3. Questo grafico mostra gli effetti della mutazione dell'elemento di risposta a SF-1 nella costruzione del reporter Bcrp1 E1U sull'attività della luciferasi. Costruzioni del reporter Bcrp1 contenenti una regione putativa di legame per SF-1 sono state trasfettate in cellule TM4 con e senza espressione forzata di SF-1.Nella figura, a indica una differenza significativa rispetto al controllo del vettore vuoto pGL3; b indica una differenza statisticamente significativa rispetto al costrutto del promotore E1U nelle cellule trasfettate con il vettore. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di selezionare una linea cellulare appropriata per il saggio di reporter. La linea cellulare deve esprimere il gene di interesse sotto il controllo del promotore presente nel costrutto di reporter.Al termine di questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la RT-PCR quantitativa, al fine di facilitare la valutazione dell'utilizzo di promotori alternativi in diversi campioni di tessuto. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come prevedere l'uso di promotori alternativi per un gene di interesse e di come determinare la funzionalità di quel promotore.

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Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine ​​che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.

Genoma Analisi mediante ChIP per identificare Isoform obiettivi specifici per Gene

Il test del reporter genetico è uno strumento consolidato e potente per sezionare la relazione tra le sequenze di DNA e le loro attività di regolazione genica. L'accoppiamento di elementi regolatori candidati a geni reporter che trasportano tag di sequenza identificativi consente una massiccia parallelizzazione di questi saggi.

Saggi Reporter massicciamente parallelo in cellule di mammifero in coltura

Il metodo qui descritto viene utilizzato per indurre la cascata di segnalazione apoptotica a passi definiti al fine di sezionare l'attività di una proteina effettrice batterica anti-apoptotica. Questo metodo può essere utilizzato anche per l'espressione inducibile di proteine pro-apoptotiche o tossiche, o per l'interferenza di dissezione con altre vie di segnalazione.

L&#39;applicazione di un sistema di espressione inducibile per studiare interferenza di fattori batterici di virulenza con segnalazione intracellulare

Elementi regolatori del DNA, come rinforzatori, controllano l'espressione genica contattando fisicamente i promotori di geni bersaglio, spesso attraverso interazioni a lungo raggio cromosomiche, che coprono grandi distanze genomiche. Promotore Capture Hi-C (PCHi-C) identifica interazioni significative tra promotori e regioni distali, che consente l'assegnazione di potenziali sequenze regolatrici a loro geni bersaglio.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

Qui presentiamo un protocollo per lo sviluppo di un sistema inducibile dominante-negativo, in cui tutta la proteina può essere inattivata in modo condizionale reversibilmente overexpressing una versione mutante dominante-negativo di esso.

Inibizione della proteina viscoelastica e reversibile dominante-negativo (DN)

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

Questo protocollo illustra i passaggi necessari per generare un sistema di modello in cui la trascrizione di un gene endogeno di interesse può essere controllata in modo condizionale in animali vivi o celle utilizzando avanzata lac repressore e/o sistemi di attivatore di tet .

Applicazione in vivo del sistema di controllo remoto per la manipolazione dell'espressione genica endogena

La somministrazione diretta di complessi preassemblati di ribonucleoproteina di RNA Cas9/guide è un mezzo veloce ed efficiente per l'editing del genoma nelle cellule ematopoietiche. Qui, utilizziamo questo approccio per eliminare un silenziatore intronico RUNX1 ed esaminare le risposte trascrizionali nelle cellule leucemiche OCI-AML3.

Indagine sul ruolo trascrizionale di un silenziatore intronico RUNX1 di CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein acuta

Qui descriviamo un metodo per la sovraespressione retrovirale e il trasferimento adottivo di cellule murine B-1a per esaminare la migrazione e la localizzazione delle cellule B-1a in vivo. Questo protocollo può essere esteso per diversi saggi funzionali a valle, tra cui la quantificazione della localizzazione cellulare B-1a del donatore o l'analisi dei fattori seminati derivati dalla cellula donatrice durante il trasferimento post-adozione.

Sovraespressione retrovirale di CXCR4 su cellule Murine B-1a e trasferimento adottivo per migrazione mirata di cellule B-1a verso il midollo osseo e la produzione di IgM

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Scopri metodi in silico per identificare l'uso di promotori alternativi nel gene murino Bcrp1 e valutarne la funzionalità mediante saggi reporter a luciferasi. Questa tecnica sfrutta dati genetici pubblici.

I metodi per scoprire alternative Uso Promotore e regolazione trascrizionale di Murine Bcrp1

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