Name: Un Tessuto 3D combinata Engineered In Vitro / In Silico Polmone tumore per predire lefficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Scopri un modello 3D di tumore polmonare combinato in vitro/in silico per predire l'efficacia dei farmaci target nel cancro polmonare non a piccole cellule. Questo approccio integrato migliora i test preclinici.

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Questa ricerca è stata sponsorizzata dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF, concessione BD247) dell&#39;Ospedale dell&#39;Università di Wuerzburg e il programma Bayern Fit (concesso a Heike Walles).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Abbiamo stabilito un combinato in vitro / in sistema di prova del tumore silico per le previsioni di trattamento biomarker-guidata. Il modello in vitro valuta diversi aspetti importanti azioni composti come cambiamenti di proliferazione delle cellule tumorali e apoptosi su una determinata sfondo mutazionale che possono anche essere simulati in silico 17. Qui, vi presentiamo il protocollo standardizzato per la generazione di modello di tumore 3D e test composti compresa la q...

L&#39;industria farmaceutica sta affrontando alti tassi di attrito fino al 95% nel campo del trattamento del cancro in fase clinica causando costi enormi 1-5. Una ragione di questo deficit è il fatto che attualmente efficacia di potenziali nuovi composti è valutata in screening su larga scala su colture cellulari 2D su linee cellulari di cancro o in modelli animali. I modelli animali hanno una maggiore complessità, ma ci sono differenze cruciali tra i topi e gli uomini 6,7. Negli ultimi dieci anni, modelli di cancro 3D utilizzando diversi approcci sono stati generati per colmare il divario tra la cultura 2D delle linee di cellule di cancro e di un complesso 6,8,9 vivo del tumore. L&#39;impatto ambientale 3D sulla differenziazione cellulare e anche sul segnale è stato dimostrato in diversi studi anni fa (ad es., Da Mina Bissell) 10,11. Oggi, molti modelli di coltura cellulare 3D sono disponibili, come le culture sferoide, idrogeli o chip microfluidica 12-16. Anche se These modelli migliorano la complessità rispetto ai sistemi di coltura convenzionale 2D, la maggior parte essi mancano di un microambiente tessuto che è noto per avere effetti tumorali di supporto e anche gli impatti efficacia del farmaco. Per risolvere questo problema, abbiamo generato un modello di tumore 3D basata su una impalcatura biologica chiamato SISmuc (piccolo intestino-sottomucosa + mucosa) che è derivato da un digiuno suina decellularized. In tal modo, l&#39;architettura dei tessuti e importanti componenti della ECM come diversi collageni nonché la struttura membrana basale sono conservati 17. Questa caratteristica unica è fondamentale per la generazione modello di tumore di carcinomi che derivano da epiteli e costituiscono circa l&#39;80% dei tumori solidi. Inoltre, il tasso di proliferazione nel nostro modello di tumore tissutale è ridotta rispetto ai tassi artificialmente elevati raggiunti nella cultura 2D. Come proliferazione è un parametro importante per valutare l&#39;efficacia dei farmaci, droga test è abilitato nel nostro modello più similecondizioni per in vivo Tumori 17. Al fine di valutare il potenziale del nostro modello per prevedere biomarcatore-dipendente efficacia dei farmaci correttamente, i dati qui presenti per due diverse linee di cellule di cancro al polmone che si differenziano per il loro stato di EGFR -biomarker. Questo stato mutazionale ha iniziato ad essere determinato di routine in pazienti con NSCLC. Trattamenti mirati con TKIs come l&#39;EGFR, inibitore della gefitinib contro i tumori recanti un attivando mutazione dell&#39;EGFR mostrano risultati superiori rispetto a quelli con la chemioterapia a base di platino 18-21. Abbiamo stabilito diverse tecniche di read-out che sono rilevanti per la valutazione dell&#39;efficacia composto. Inoltre, dopo il TGF-beta-1 stimolazione siamo in grado di indagare le azioni composti nelle cellule tumorali che hanno iniziato il processo di EMT, che è pensato per essere un passo importante nella trasformazione maligna 22,23 e che è collegato a resistan di drogace 24. Il modello di tumore 3D consentire il monitoraggio delle risposte specifiche delle celle a trattamenti mirati, la chemioterapia, o combinazioni di farmaci con buoni contrasti. Per migliorare ulteriormente e velocizzare droga screening e ad incontrare resistenza, è completato da una simulazione in silico. Sulla base di alcuni esperimenti, la risposta tumorale può essere previsto in silico per quanto riguarda il risultato per una gamma completa di farmaci e loro combinazioni.

<table><tbody><tr><td>Cattedra di Bioreattori</td><td>di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)</td><td>Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corone cellulari</td><td>Cattedra di ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>per la coltura 3D statica</td></tr><tr><td>CellDesigner</td><td>http://www.celldesigner.org/</td><td>-</td><td>Questo software è stato utilizzato per disegnare la rete.</td></tr><tr><td>Soluzione madre tampone di citrato (10x)</td><td>produzione interna</td><td></td><td>42 g/L di acido citrico monoidrato, 17,6 g/L di pellet di idrossido di sodio in acqua deionizzata, pH 6,0, conservati a RT.&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di lavoro tampone citrato</td><td>in produzione</td><td></td> propria <td>Soluzione madre tampone citrato al 10% in acqua demineralizzata, conservata presso RT.</td></tr><tr><td>Acido citrico monoidrato</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>1002441000</td><td>utilizzato per il tampone citrato</td></tr><tr><td>Vetrini copritutto</td><td>VWR, Darmstadt (GER)</td><td>631-1339</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-GTM</td><td>SouthernBiotech, Birmingham (USA)</td><td>SBA-0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Banche dati come KEGG, HPRD e QIAGEN (Genes & Pathways)</td><td>http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/</td><td>-</td><td>Per generare la topologia di rete sono stati utilizzati diversi database di letteratura conosciuta.</td></tr><tr><td>Femmina Luer Lug Style Tee Mednet</td><td>, M&uuml; nster (GER)</td><td>FTLT-1</td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Femmina Luer Thread Style con 5/16" Hex a 1/4-28 UNF Thread</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>SFTLL-J1A&nbsp;</td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Siero Fetale di Vitello Bio</td><td>& SELL, Feucht (GER)</td><td>FCS. ADD.0500</td><td>Gefitinib non inattivato a caldo</td></tr><tr><td></td><td>Absource Diagnostics GmbH, M&uuml; nchen (GER)</td><td>S1025-100 mg</td><td>100 mM soluzione madre con</td></tr><tr><td>pallone di vetro DMSO (Schott, GER) fornito con raccordo per tubo flessibile in vetro</td><td>Weckert, Kitzingen (GER)</td><td>su misura</td><td></td></tr><tr><td>Histofix 4% (Paraformaldehyd)</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>P087.1</td><td></td></tr><tr><td>Raccordo per tubo flessibile</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>CC-9</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per bioreattori</td><td>Cattedra di Ingegneria Tissutale e Medicina Rigenerativa, W&uuml; rzburg (GER)</td><td></td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>M30 CytoDeathTM ELISA</td><td>Peviva, Bromma (SWE)</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Maschio Luer Integral Lock Ring</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>MTLL230-J1A</td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Camera di umidità</td><td>su misura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Topo anti Pan-Citocheratina</td><td>Sigma-Aldrich, Monaco di Baviera (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>C2562-2ML</td><td>Clone C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3
+M20+A53-B/A2, usato 1/100 per immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Valvola tamponabile senza ago Femmina Luer</td><td>Mednet, M&uuml; nster (GER)</td><td>NVFMLLPC</td><td>Configurazione del bioreattore, per il campionamento, sterilizzato a raggi gamma</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 10 rosso 37 x 3 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>21444</td><td>O-ring grande, Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>O-Ring MVQ 70 rosso 27 x 2,5 mm</td><td>Arcus Dichtelemente, Seevetal (GER)</td><td>19170</td><td>O-ring piccolo, Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Dako, Amburgo (GER)</td><td>S002</td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td>Carl Roth, Karlsruhe (GER)</td><td>6642.6</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER)</td><td></td>Configurazione <td>del bioreattore</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich, Monaco di Baviera (GER)&nbsp; &nbsp;</td><td>D8537-6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>Cassetta per tubi pompa</td><td>Ismatec, Wertheim (GER)</td><td>IS 3710</td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Rabbit anti Ki67</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab16667</td><td>Clone SP6, utilizzato per 1/100 per IF</td></tr><tr><td>Rabbit anti Vimentin</td><td>Abcam, Cambridge (UK)</td><td>ab92547</td><td>utilizzato 1/100 per IF</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Life technologies, Darmstadt (GER)</td><td>61870-044</td><td>caldo in 37 &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Tubo in silicone</td><td>Carl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)</td><td>HC66.1</td><td>Configurazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>30620-1KG-R</td><td>utilizzato per il tampone citrato</td></tr><tr><td>SQUAD</td><td></td> <td>http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-Questo</td> <td>software è stato utilizzato per eseguire le simulazioni semiquantitative.</td></tr><tr><td>Filtro dell'aria sterile, pori 0,2 e micro; m</td><td>Sartorius Stedium Biotech, G&ouml; ttlingen (GER)</td><td>16596-HYK</td><td>Installazione del bioreattore</td></tr><tr><td>Siringa Luer Lok 5 ml</td><td>BD Biosciences, Heidelberg (GER)</td><td>309649</td><td>per il campionamento del bioreattore</td></tr><tr><td>Piastre per test di coltura tissutale: 6-,&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 12, 24, 96 pozzetti</td><td>TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)</td><td>92006, 92012, 92024, 92048&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Il fattore di crescita trasformante-beta 1 (TGF-&beta; 1) con</td><td>carrier Cell Signaling, Francoforte (GER)</td><td>8915LC</td><td>soluzione madre in tampone sterile citrato pH 3.0</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich, M&uuml; nchen (GER)</td><td>P7949-500ml</td><td>per il lavaggio del tampone di colorazione immunofluorescente</td></tr></tbody></table>

un tessuto 3d combinata engineered<em&gt; in vitro</em&gt; /<em&gt; in silico</em&gt; polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici sfondi mutazionali

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

Nel presente studio, abbiamo combinato un 3D polmone modello in vitro tumore con un modello in silico per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di uno specifico background mutazionale. Il modello è generato su un ponteggio suina decellularized che riproduce le caratteristiche tessuto-specifici per quanto riguarda la composizione della matrice extracellulare e l&#39;architettura tra cui la membrana basale. Abbiamo standardizzato un protocollo che permette la generazione di tessuto tumorale artificiale entro 14 giorni di cui tre giorni di trattamento farmacologico. Il nostro articolo fornisce diversi descrizioni dettagliate di 3D lettura le tecniche di screening, come la determinazione del indice di proliferazione Ki67 colorazione, l&#39;apoptosi da surnatanti da M30-ELISA e la valutazione dei epiteliale di transizione mesenchimale (EMT), che sono strumenti utili per valutare l&#39;efficacia delle composti terapeutici. Abbiamo potuto dimostrare rispetto alla cultura 2D una riduzione della proliferazione nel nostro modello di tumore in 3D che è relatcato alla situazione clinica. Nonostante questa proliferazione più bassa, il modello previsto EGFR risposte farmacologiche -targeted correttamente in base allo stato biomarker come dimostra il confronto delle linee cellulari di carcinoma del polmone HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) e A549 (EGFR wild-type, KRAS - mutato) trattati con il gefitinib inibitore della tirosin-chinasi (TKI). Per studiare le risposte farmacologiche di cellule tumorali più avanzate, abbiamo indotto EMT da un trattamento a lungo termine con TGF-beta-1 come valutato dal vimentina / immunofluorescenza pan-citocheratina. Un flusso-bioreattore è stato impiegato per regolare la cultura a condizioni fisiologiche, che ha migliorato la generazione dei tessuti. Inoltre, mostriamo l&#39;integrazione di risposta ai farmaci in seguito al trattamento con Gefitinib o TGF-beta-1 stimolazione - apoptosi, indice di proliferazione e EMT - in un valore booleano nel modello di silico. Inoltre, spieghiamo le risposte come farmaco di cellule tumorali con uno specifico background mutazionale e conteggioerstrategies contro la resistenza possono essere previsti. Siamo sicuri che il nostro 3D nell&#39;approccio vitro in particolare con la sua espansione in silico fornisce un valore aggiunto per il test anti-droga preclinica in condizioni più realistiche che in coltura cellulare 2D.

Sulla base del ponteggio SISmuc (Figura 2A a C), abbiamo stabilito un protocollo operativo standardizzato per la generazione, la stimolazione e il trattamento di un sistema di test tumorale 3D (Figura 2D). Questo modello permette la determinazione dell&#39;indice di proliferazione e la quantificazione dell&#39;apoptosi usando M30-ELISA come mostrato in Figura 1 e Figura 3, rispettivamente. Figura 3 mostr...

Presentiamo un modello tridimensionale (3D) di cancro del polmone basato su un'impalcatura biologica di collagene per studiare la sensibilità verso terapie mirate al cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC). Dimostriamo diverse tecniche di lettura per determinare l'indice di proliferazione, l'apoptosi e lo stato di transizione epitelio-mesenchimale (EMT). I dati raccolti sono integrati in un modello in silico per la previsione della sensibilità ai farmaci.

Un Tessuto 3D combinata Engineered<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Polmone tumore per predire l&#39;efficacia della droga in specifici Sfondi mutazionali

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Gli obiettivi generali di questo modello combinato di carcinoma polmonare in vitro e in silico sono studiare la sensibilità delle terapie mirate al carcinoma polmonare non a piccole cellule e prevedere l'efficacia di nuove sostanze. Questo sistema di modelli 3D consente il monitoraggio delle risposte specifiche delle cellule a trattamenti mirati o combinazioni dirette. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le previsioni in silico possono facilitare i test preclinici sui farmaci in un ambiente più rilevante dal punto di vista fisiologico.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse entità tumorali, in quanto può essere utilizzata per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di specifici background mutazionali. A dimostrare la procedura sarà Franziska Schmitt, assistente di ricerca, del nostro laboratorio. Per impostare una coltura dinamica, iniziare coltivando il modello tumorale in condizioni di coltura statica, in una corona cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, in un incubatore convenzionale.Dopo tre giorni, assemblare un bioreattore autoclavato e inserire nel sistema un sottomucoso biologico dell'intestino tenue con semi

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Vi presentiamo la procedura per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo a microfluidi che ricrea eterogenei microambienti...

Dispositivo Microfluidic per ricreare un microambiente tumorale<em&gt; In Vitro</em

Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

Gli xenotrapianti di glioblastoma multiforme derivati da pazienti possono essere miniaturizzati in microtumori viventi utilizzando il sistema di coltura di biogel umano 3D. Questo test tumorale 3D in vivo è adatto per i test di risposta ai farmaci e la profilazione molecolare, compresa l'analisi cinematica.

Generazione di Microtumors Uso 3D Biogel Umano Sistema Cultura e cellule di glioblastoma paziente-derivato per Kinomic Profiling and Drug Testing risposta

Questo protocollo descrive la fabbricazione di microcryogels elastico 3D macroporosa integrando microfabbricazione con tecnologia cryogelation. Durante il caricamento con cellule, microtissues 3D vengono generati, che possono essere facilmente iniettate in vivo per facilitare la terapia rigenerativa o assemblati in matrici per in vitro screening di farmaci di alto-rendimento.

Microtissues 3D per la terapia rigenerativa iniettabile e droga di High-throughput Screening

L'ipossia è un segno distintivo del microambiente tumorale e svolge un ruolo cruciale nella progressione del cancro. Questo articolo descrive il processo di fabbricazione di un cancro ipossico su chip basato sulla tecnologia di stampa cellulare 3D per ricapitolare una patologia del cancro correlata all'ipossia.

Cancro ipossia stampato in cellule 3D su chip per ricapitolare la progressione patologica del cancro solido

Questo documento descrive i metodi per la generazione, il trattamento farmacologico e l'analisi di espianti derivati dal paziente per valutare le risposte ai farmaci tumorali in un sistema modello preclinico vivo, rilevante per il paziente.

Espianti tumorali derivati dal paziente come piattaforma preclinica "live" per prevedere la resistenza ai farmaci nei pazienti

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Questo protocollo fornisce metodi per generare tessuti muscolari cardiaci e scheletrici ingegnerizzati in 3D e descrive il loro uso nelle modalità di screening preclinico dei farmaci. I metodi descritti utilizzano un sistema di rilevamento magnetico per facilitare la valutazione simultanea di 24 tessuti in parallelo.

Test preclinici di farmaci in tessuti muscolari ingegnerizzati 3D scalabili

Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.

Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci

Questo protocollo presenta un modello tumore-on-a-chip fisiologicamente rilevante per eseguire ricerche di base e traslazionali sul cancro umano ad alto rendimento, facendo progredire lo screening dei farmaci, la modellazione delle malattie e gli approcci di medicina personalizzata con una descrizione delle procedure di carico, manutenzione e valutazione.

Creazione di un modello fisiologico di microtumore vascolarizzato umano per la ricerca sul cancro

Questo studio presenta un modello ortotopico di carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) basato sull'inoculazione intrapolmonare di sferoidi multicellulari di cellule fluorescenti A549-iRFP. Il modello ricapitola gli stadi clinici del NSCLC e risponde al cisplatino, secondo il monitoraggio dinamico in vivo della fluorescenza a lunghezza d'onda lunga.

Costruzione di un modello ortotopico di xenotrapianto di carcinoma polmonare non a piccole cellule che imita la progressione della malattia e predice le attività farmacologiche

Scopri un modello 3D di tumore polmonare combinato in vitro/in silico per predire l'efficacia dei farmaci target nel cancro polmonare non a piccole cellule. Questo approccio integrato migliora i test preclinici.

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