Un Tessuto 3D combinata Engineered

Gli obiettivi generali di questo modello combinato di carcinoma polmonare in vitro e in silico sono studiare la sensibilità delle terapie mirate al carcinoma polmonare non a piccole cellule e prevedere l'efficacia di nuove sostanze. Questo sistema di modelli 3D consente il monitoraggio delle risposte specifiche delle cellule a trattamenti mirati o combinazioni dirette. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le previsioni in silico possono facilitare i test preclinici sui farmaci in un ambiente più rilevante dal punto di vista fisiologico.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse entità tumorali, in quanto può essere utilizzata per ottimizzare le previsioni di risposta ai farmaci sulla base di specifici background mutazionali. A dimostrare la procedura sarà Franziska Schmitt, assistente di ricerca, del nostro laboratorio. Per impostare una coltura dinamica, iniziare coltivando il modello tumorale in condizioni di coltura statica, in una corona cellulare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2, in un incubatore convenzionale.

Dopo tre giorni, assemblare un bioreattore autoclavato e inserire nel sistema un sottomucoso biologico dell'intestino tenue con semi più un'impalcatura mucosa. Quindi, aggiungere 45 millilitri di RPMI, integrati con la quantità appropriata di FCS a un pallone e collegare il dispositivo di campionamento senza ago al sistema di tubi tra il bioreattore e il pallone di fluido. Posizionare il bioreattore nell'incubatore e collegarlo alla pompa per coltivare il modello tumorale, per altri 14 giorni, con un flusso medio costante di tre millilitri al minuto.

Per trattare un modello tumorale statico con, Gefitinib, l'11° giorno di coltura nell'incubatore convenzionale, utilizzare prima una pipetta pasteur per rimuovere il vecchio terreno dai pozzetti. Quindi, aggiungere un millilitro di RPMI appena preparato, integrato con FCS e Gefitinib, all'interno di ciascuna corona cellulare e 1,5 millilitri sul fondo di ciascun pozzetto. Per raccogliere i campioni di Elisa da una coltura dinamica, nei giorni dall'11 al 14 di coltura, collegare la siringa al dispositivo di campionamento e rimuovere un millilitro di terreno dal sistema del bioreattore.

Quindi conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non viene eseguita l'Elisa. Per determinare il numero di nuclei positivi per Ki67, utilizzare prima un microscopio invertito per ottenere cinque immagini fluorescenti di colorazione DAPI e cinque Ki67 di colture 2D con un ingrandimento di 20 volte di ciascuna condizione, da sezioni non sovrapposte del campione. Per contare manualmente i nuclei positivi Ki67, apri l'immagine emersa nelle Fiji e seleziona Plugin e Contatore celle, quindi fai clic su inizializza, seleziona un tipo di contatore e fai clic su ciascun nucleo positivo Ki67.

Il numero di celle selezionate verrà visualizzato accanto al tipo di contatore selezionato. Per il conteggio automatico delle celle del numero totale di nuclei nelle immagini 2D, avviare il registratore di macro, aprire un'immagine DAPI e fare clic su immagine, tipo e 8 bit, quindi fare clic su Migliora contrasto e impostare il parametro saturo su uno e normalizzare. Per rendere più nitida l'immagine, impostate la maschera di contrasto, utilizzando un raggio di uno e una maschera di 60.

Per legare l'immagine, fare clic su soglia automatica e scegliere il metodo Reny/Entropia con oggetti bianchi su sfondo nero. Quindi, fare clic su Plugin, seguito da BioVoxxel e dalla funzione irregolare del bacino idrografico, con un raggio di erosione di cinque per separare le celle. Fare clic su Analizza e analizza le particelle e impostare la dimensione su 02 all'infinito e selezionare Riepiloga.

Il numero di celle verrà mostrato nella tabella riassuntiva come conteggi. Quindi, fare clic su Crea per salvare la macro e consentire il conteggio automatico dei nuclei, in ulteriori immagini di colture cellulari 2D. Dopo aver utilizzato i database noti per generare una rete tumorale, aprire il software di analisi della rete appropriato, fare clic su file e nuovo e inserire i modelli tumorali di Jove.

Fare clic su ok, per generare una nuova rete, quindi fare clic su quadrare il primo piano Nord e ok, per visualizzare il recettore in una doppia membrana. Per visualizzare i nodi come rettangoli, fare clic su proteina generica, quindi su EGFR, quindi Ok.To etichettare i nodi nella rete, fare clic con il pulsante destro del mouse per modificare il colore e la forma e impostare i codici colore dei nodi come indicato. Per visualizzare i parametri di lettura come esagoni, selezionare, fenotipo, inserire la proliferazione e fare clic su ok.

Quindi, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona di nuovo cambia colore e forma per impostare il codice colore su 255, 204, 204. Per visualizzare i bordi delle interazioni dei nodi, fare clic su transizione di stato per le frecce di attivazione e su inibizione per le frecce di inibizione smussate. Quindi, fare clic su file e salva con nome e salvare la rete di segnalazione generata, come tumore di Jove models.xml.

Per l'analisi allo stato stazionario dell'equilibrio del sistema, aprire il software SQUAD, fare clic su Carica rete e caricare il file del models. xml del tumore di Jove. Fare clic ed eseguire l'analisi.

Per scrivere un protocollo di simulazione, fare clic su avanzate e pertubator, quindi fare clic su modifica protocollo per simulare la resistenza anti-EGFR. Quindi, fare clic su pertubazione e selezionare lo stato iniziale standard uguale allo stato stazionario quattro. Fare clic su Aggiungi per aggiungere il nuovo impulso costante, quindi selezionare il parametro di stato e impostare l'obiettivo su FLIP, il tempo su zero e il valore su 4.

Fare clic su ok e impostare gli stati per c-MET e Gefitinib, allo stesso modo. Per impostare un valore di stato sul nodo EGFR attivo, fare clic su nodo attivo, quindi fare clic su modifica. Imposta lo stato su 8 e fai clic su ok.

Fare clic su ok per salvare il protocollo. Per visualizzare le curve specifiche, nel pannello delle opzioni, selezionare EGF-EGFR, EGF-EGFR stellare, Mek stellare, caspasi, PI3K, Gegitinib, apoptosi, proliferazione, inibitore di MEk e inibitore di PI3K. Quindi, fare clic su inizializza ed esegui per avviare una simulazione completa della risposta del sistema.

Per simulare un trattamento combinato con inibitori PI3K e Mek, fare clic su modifica protocollo. Successivamente, utilizzando lo stesso parametro del nodo appena dimostrato, fare clic su pertubazione, seguito da aggiungi, per aggiungere un nuovo impulso costante. Quindi, selezionare un parametro di stato e impostare il target su PI3K inibitore, il tempo su zero e il valore su uno, quindi fare clic su ok.

Fare clic su aggiungi, di nuovo, per aggiungere un altro nuovo impulso costante e sotto il parametro state, impostare il target su Mek inibitore, impostare il tempo su zero e il valore su uno, quindi fare clic su ok, seguito di nuovo da ok, per salvare il protocollo. Nel pannello delle opzioni, utilizzando gli stessi nodi per la rappresentazione grafica appena dimostrata, fare clic su inizializza ed eseguire per avviare una simulazione completa della risposta del sistema. Quindi, per terminare la simulazione, fare clic su Reimposta.

Questo sistema di test tumorale 3D, facilita la determinazione dell'indice di proliferazione. E la quantificazione dell'apoptosi utilizzando M30 Elisa. In questo esperimento rappresentativo, ad esempio, solo le cellule tumorali HCC827 mutate nell'EGFR, incubate in condizioni di coltura statica, hanno risposto all'inibizione del fattore di crescita epidermico.

Dall'inibitore della tirosina-chinasi, Gefitinib, come evidente dall'aumento dell'apoptosi osservato nel sistema modello tumorale HCC827. Qui vengono mostrate immagini rappresentative di modelli tumorali statici 3D, con o senza, induttore di transizione epiteliale-mesenchimale, simulazione TGF-beta-1. Si noti l'aumento dell'espressione di vimentina, nelle colture di cellule tumorali trattate.

In condizioni dinamiche, Gefitinib esercita un effetto robusto sulle cellule HCC827 mutate in EGFR, come evidenziato dalla diminuzione delle strutture simili ai tessuti, in presenza dell'inibitore della tirosina-chinasi, rispetto alla coltura controllata non trattata. In questo grafico, si osserva la simulazione del noto drive in mutazione, la co-attivazione di EGFR e c-MET, l'aumento del tasso di proliferazione e una diminuzione del tasso di apoptosi nelle cellule HCC827, nel tempo, che riflettono una resistenza indotta da Gefitinib che correla con l'attivazione di MEK e PI3K. Infatti, la modellazione degli inibitori combinati di PI3K e MEK determina un'inversione dell'effetto di resistenza anti-EGFR, una riduzione della proliferazione e l'induzione dell'apoptosi.

Seguendo questa procedura, altri metodi come il Western Blot o possono essere eseguiti per studiare le vie di segnalazione a valle. Inoltre, sistemi di co-coltura con diversi tipi di cellule possono essere utilizzati anche per analizzare il cross-talk tra varie cellule nel microambiente tumorale. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo di farmaci per esplorare l'efficacia dei farmaci in Silico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come prevedere l'efficacia dei farmaci in gruppi di pazienti stratificati, simulando i cambiamenti di segnalazione e analizzando le risposte del sistema risultanti in diverse mutazioni e background.