Name: Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Impara la microdissezione laser-assistita per isolare cellule vegetali specifiche come le cellule uovo in Boechera. Questo metodo consente di ottenere RNA ad alta integrità per analisi trascrizionali mirate.

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Ringraziamo Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) per aver fornito i semi di Boechera divaricarpa e Sharon Kessler (Università dell'Oklahoma) per la lettura critica e la correzione di bozze. Il lavoro sull'analisi del trascrittoma tipo di cellula specifica per studiare lo sviluppo dei gametofiti e l'apomissi nel laboratorio dell'UG è sostenuto dall'Università di Zurigo, da una borsa di studio della "Deutsche Forschungsgemeinschaft" e dal progetto Marie Curie IDEAGENA to AS, da sovvenzioni della "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" nell'ambito dell'azione COST FA0903 (a UG e AS) e dalla Fondazione nazionale svizzera (a UG).

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<li>Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+the+Arabidopsis+megaspore+mother+cell+uncovers+the+importance+of+RNA+helicases+for+plant+germ+line+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+BIOL%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development.</a> PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).</li>
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<li>Corral, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+apomixis-specific+polymorphism+is+correlated+with+exclusive+exonuclease+expression+in+premeiotic+ovules+of+apomictic+boechera+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species.</a> Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).</li>
<li>Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Arabidopsis+thaliana.+phloem+RNAs+provides+a+search+criterion+for+phloem-based+transcripts+hidden+in+complex+datasets+of+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments.</a> Plant J. 55, 746-775 (2008).</li>
<li>Schmid, M. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Genome+Scale+Quantitative+Biology+in+Arabidopsis+thaliana%22">Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo è adatto a diversi tipi di tessuto cellulare e LAM combinato con trascrittoma analisi per microarrays o RNA-Seq è un valido strumento per acquisire conoscenze in modelli specifici di attività dei geni che regolano i processi di sviluppo o fisiologici 7-11,13,14. Tuttavia, l&#39;idoneità di questo metodo per un dato tipo di cellula dipende criticamente sui problemi strutturali. La cella deve essere chiaramente visibili e senza ambiguità identificabile...

In studi trascrizionali fatto a livello dei tessuti, i trascrittomi di tipi di cellule altamente specializzate, ma rare sono spesso mascherati da i più abbondanti cellule circostanti. Un esempio di tali tipi di cellule altamente specializzate sono le cellule della linea riproduttivo femminile (germinale) in piante. La linea germinale femminile è specificato all&#39;interno di ovuli in via di sviluppo, i precursori di semi all&#39;interno del gineceo del 1,2 fiore. La cellula madre megaspore (MMC) è la prima cellula della linea germinale femminile. Subisce meiosi per formare una tetrade di macrospora ridotti. Tipicamente, solo uno di questi macrospora sopravvive e divide mitoticamente senza citochinesi, cioè, in un sincizio. Questi mitosi sono seguiti da cellularization per formare il gametofito maturo, che in genere si compone di quattro tipi di cellule: tre antipodals, due celle synergid, l&#39;uovo e la cellula centrale. Le cellule uovo e centrali sono i gameti femminili che vengono fecondati da due spermatozoi durante doufecondazione ble per dare origine a un embrione e endosperma del seme 1,2 sviluppo. Nel sessuale sistema modello Arabidopsis thaliana, solo ~ 50 semi si sviluppano per fiore mentre circa 50 - 80 semi si sviluppano per fiori in genere strettamente correlati Boechera. Così, la linea germinale femminile è costituito da pochi tipi di cellule altamente specializzate, che lo rende un ottimo modello per lo studio dei processi di sviluppo, come ad esempio le specifiche e la differenziazione cellulare. Inoltre, approfondimenti sui processi di regolazione genica che regolano la riproduzione delle piante possono essere di valore applicata. Nelle piante, può avvenire sia riproduzione sessuata e asessuata attraverso i semi (apomissia). Mentre riproduzione sessuale genera la diversità genetica in una popolazione, Apomixis conduce alla formazione di progenie clonale che è geneticamente identica alla pianta madre. Pertanto, apomissia ha un grande potenziale per le applicazioni in agricoltura e produzione di sementi, come anche complesse genotipi materni puòessere mantenuta inalterata per diverse generazioni 3,4,5. Perché apomissia non si trova naturalmente in tutte le principali specie coltivate, la progettazione di apomissia nelle colture è di grande interesse 3,4,5. Tuttavia, questo obiettivo a lungo termine è difficile da raggiungere perché la base genetica e molecolare alla base di apomissia non viene compreso in modo sufficientemente dettagliato 6. Per acquisire conoscenze in base trascrizionale che regolano la riproduzione apomittica, specifici per tipo di cellula trascrizionale profilatura mediante microdissezione laser assistita (LAM) e sequenziamento di nuova generazione (NGS) rappresenta un approccio molto potente 7,8. LAM è stata in primo luogo stabilito per l&#39;animale e la ricerca biomedica. Negli ultimi anni LAM è stata anche applicata alla biologia vegetale 6,9,10. A differenza di altri metodi che consentano profilatura dei singoli tipi di cellule e tessuti, LAM non richiede la generazione di linee marcatore 6,9,10. Pertanto, può essere appmentito a qualsiasi tipo di cellula o tessuto senza conoscenza molecolare preventiva. Un altro vantaggio di LAM è che può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula finché la cella può essere riconosciuta in sezioni asciutte base alla posizione e / o caratteristiche strutturali. LAM ha il vantaggio aggiuntivo che vengono utilizzati tessuti fissati, che impedisce variazioni del profilo trascrizionale durante la lavorazione. Il tessuto di interesse, ad esempio, il tessuto floreale, è fissato in un fissativo non reticolazione prima inclusione in paraffina. Incorporare in cera di paraffina può essere effettuata manualmente, seguendo i protocolli stabiliti 9,11. Tuttavia, l&#39;impiego di un processore tessuti automatizzato per la disidratazione e l&#39;infiltrazione con la cera genera risultati riproducibilità in termini di conservazione della qualità dell&#39;RNA e morfologia tissutale. La strategia alternativa di incorporare tessuti in resina è stato anche utilizzato con successo per le analisi specifiche per tipo di cellula da LAM 8. Tuttavia, l&#39;uso di un automprocessatore ated per l&#39;incorporamento in cera è molto tempo efficiente, come molti campioni possono essere trattati contemporaneamente richiedono un minimo di mani-in tempo. Mentre tipicamente alcuna perdita significativa di qualità dell&#39;RNA avviene durante la fissazione e inclusione, la preparazione di sezioni sottili con il microtomo e, in particolare, il montaggio sulle frameslides utilizzati per LAM rimane un punto critico per la conservazione della qualità dell&#39;RNA. Ciò è stato notato in precedenza e l&#39;uso di un sistema di trasferimento nastro è stato descritto per una migliore qualità dell&#39;RNA in questa fase 12. Tuttavia, questo aggiunge un passo tempo supplementare durante la preparazione dei vetrini e richiede anche attrezzature speciali. Il protocollo ottimizzato descritto di seguito produce riproducibile RNA che è di qualità sufficiente per profilatura trascrizionale con GeneChip e Next Generation Sequencing (NGS) si avvicina 7,11,13,14. Inoltre, con il microscopio microdissezione laser utilizzato, un&#39;elevata purezza dei tipi di cellule isolate è rottainely prodotto 7,11,13,14. Il genere Boechera è un sistema modello eccellente per studiare i passaggi chiave della riproduzione apomittica. In Boechera, una varietà di diverse adesioni sessuali e apomittici sono stati identificati e può essere utilizzato per analisi comparative 15,16,17. In un confronto di trascrittomi cellule specifiche per il tipo di cellule della linea germinale femminile da Arabidopsis sessuale e apomittica Boechera, abbiamo identificato geni e vie che sono espressi in modo differenziale, individuando così nuovi aspetti dei processi regolamentari che disciplinano Apomixis 7. Inoltre, questo studio ha verificato l&#39;idoneità di LAM per specifico tipo cellulare trascrizionale analisi di tipi di cellule piccole e rare. Abbiamo già usato questo protocollo per l&#39;analisi dei diversi tipi di cellule in una varietà di specie vegetali, ma specie-e modifiche tessuto-specifici al protocollo può essere richiesto in alcuni casi.

<table><tbody><tr><td>Etanolo</td><td>VWR</td><td>1.009.861.000</td><td>assoluto EMPROVE Ph Eur,BP,USP</td></tr><tr><td>15 ml provette da centrifuga falcon</td><td>VWR</td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizzatore</td><td>Agilent</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% grado di biologia molecolare</td></tr><tr><td>Ambion Tecnologie per la vita in acqua prive di nucleasi</td><td></td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>ASP200 S</td><td>Leica</td><td>14048043624</td><td>processatore di tessuti&nbsp;</td></tr>il <tr><td>cartone</td><td></td><td></td> nero <td>può essere acquistato nelle cartiere speciali</td></tr><tr><td>: guide per telai prive di DNA e RNAsi Micro</td><td>Dissect GmbH</td><td></td><td>1, 4 &; m membrana in PET; può essere acquistato anche da Leica</td></tr><tr><td>Dumond Forcipe</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>essiccatore per lampada</td><td></td><td></td><td></td>a etanolo</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z354074-1EA</td><td>Nalgene Vaccuum Dessicator o apparecchiature simili</td></tr><tr><td>punte per filtri 10&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG AL60010</td><td></td><td>può essere sostituito da punte simili</td></tr><tr><td>Punte filtranti 1.000&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG AL60010</td><td></td><td>può essere sostituito da puntali simili</td></tr><tr><td>puntali con filtro 20&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG AL60020</td><td></td><td>può essere sostituito da punte simili</td></tr><tr><td>Punte con filtro 200&nbsp; &micro; l</td><td>Axon Lab AG</td><td>AL60200</td><td>può essere sostituito da punte simili</td></tr><tr><td>pinze di precisione</td><td>VWE</td><td>232-1221</td><td></td></tr><tr><td>supporto per vetrini</td><td>in vetro Huber & Co.AG</td><td>10.0540.01</td><td>F&auml; rbek&auml; melletto</td></tr><tr><td>per colorazione in vetro</td><td>Hellendahl Huber & Co.AG</td><td>10.0570.01</td><td>F&auml; rbekasten</td></tr><tr><td>Modulo di inclusione in paraffina riscaldata Leica</td><td>Leica</td><td>EG 1150 H</td><td>stazione di blocco, dispositivi simili sono adatti</td></tr><tr><td>Tavolo di riscaldamento e asciugatura</td><td>Medax</td><td>15501</td><td>altri modelli e/o fornitori sono adatti</td></tr><tr><td>secchiello per il ghiaccio</td><td>VWR secchiello per il ghiaccio con coperchio&nbsp;</td><td>10146-184</td><td>secchi simili ugualmente adatto</td></tr><tr><td>tavolo luminoso</td><td>UVP An Analytical Jena Company</td><td>TW-26&nbsp;</td><td>transluminatore a luce bianca</td></tr><tr><td>vetrino per microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td> lama per microtomo <td>con bordi tagliati</td></tr><tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>FEAHS35</td><td>lama per microtomo S35 monouso</td></tr><tr><td>MMI Cell Cut Plus Instrument</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge antiaderenti e prive di RNAsi, 2 ml</td><td>di tecnologie per la vita</td><td>AM12475</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Roth</td><td>X882.2</td><td>per istologia</td></tr><tr><td>PicoPure RNA Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>KIT0204</td><td>Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit</td></tr><tr><td>vassoi di bilanciamento in plastica</td><td>Semadeni AG</td><td>2513</td><td></td></tr><tr><td>scatola di plastica</td><td>Semadeni AG</td><td>2971</td><td>Plastikdose PS</td></tr><tr><td>coperchio in plastica per piastra</td><td></td><td></td> riscaldante <td>ago per preparazione fatta in casa</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>631-7159</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNA 6000 Pico</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfughe prive di RNAsi Tecnologie</td> per <td>la vita</td><td>AM12400</td> RNAse ZAP Decontaminazione Soluzioni per la durata Tecnologie <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo rotante semiautomatico&nbsp;</td><td>I</td> dispositivi simili Leica <td>RM2245</td><td>sono ugualmente adatti</td></tr><tr><td>Cassette per schermi Tissue Loc Histo</td><td>Thermo Scientific</td><td>C-1000_AQ</td><td>sono adatte cassette simili di altri fornitori</td></tr><tr><td>Tubi con coperchio adesivo, senza diffusore 500 &; l&nbsp;</td><td>MMI (Molecular Machines and Industries)</td><td>50204</td><td></td></tr><tr><td>Xylol (Isomere) ROTIPURAN</td><td>VWR</td><td>4436.2</td><td>min. 99%, p.a., ACS, ISO SP</td></tr><tr><td>process embedding cassette Leica</td><td></td><td>14039440000</td><td>Leica Jet Cassette I senza coperchio</td></tr><tr><td>Universal Oven</td><td>Memmert</td><td>UF55</td><td>altri modelli e/o fornitori sono adatti</td></tr></tbody></table>

laser-assistita microdissection (lam) come strumento per trascrizionale profiling di tipi di cellule individuali

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

La comprensione dei processi di sviluppo a livello molecolare richiede approfondimenti sulla regolazione trascrizionale, e quindi sul trascrittoma, a livello dei singoli tipi di cellule. Mentre i metodi qui descritti sono generalmente applicabili a un'ampia gamma di specie e tipi di cellule, la nostra ricerca si concentra sulla riproduzione delle piante. La coltivazione delle piante e la produzione di sementi sono di fondamentale importanza per l'alimentazione umana e animale. Una comprensione dettagliata delle reti regolatorie che governano la formazione della linea riproduttiva (linea germinale) e, in ultima analisi, dei semi è una precondizione per la manipolazione mirata della riproduzione delle piante. In particolare, l'ingegnerizzazione dell'apomissia (riproduzione asessuata attraverso i semi) nelle piante coltivate promette grandi miglioramenti, in quanto porta alla formazione di semi clonali geneticamente identici alla pianta madre. Di conseguenza, i tipi cellulari della linea germinale femminile sono di grande importanza per la comprensione e l'ingegnerizzazione dell'apomissia. Tuttavia, poiché le cellule corrispondenti sono profondamente incorporate nei tessuti floreali, è molto difficile accedervi per le analisi sperimentali, compresa la trascrittomica specifica per tipo di cellula. Per superare questa limitazione, sezioni di singole cellule possono essere isolate mediante microdissezione laser-assistita (LAM). Sebbene la LAM in combinazione con la profilazione trascrizionale consenta l'identificazione di geni e percorsi attivi in qualsiasi tipo di cellula con elevata specificità, stabilire un protocollo adeguato può essere difficile. In particolare, la qualità dell'RNA ottenuto dopo LAM può essere compromessa, soprattutto quando si prendono di mira piccole cellule singole. Per aggirare questo problema, abbiamo stabilito un flusso di lavoro per LAM che si traduce in modo riproducibile in un'elevata qualità dell'RNA che è ben adatta per la trascrittomica, come esemplificato qui dall'isolamento di cellule della linea germinale femminile in Boechera apomittica. In questo protocollo vengono descritte le procedure per la preparazione dei tessuti e la LAM, anche per quanto riguarda l'estrazione dell'RNA e il controllo di qualità.

Preparazione del campione e LAM sono fatte in fasi consecutive Un certo numero di passi consecutivi sono necessari per preparare RNA per l&#39;analisi trascrizionale di tipi cellulari selezionati da LAM (Figura 1). Questo inizia con la raccolta dei fiori e la fissazione immediata per garantire che la popolazione RNA rimane invariato dopo la raccolta. Il tessuto è inserito, sezionato, e montate...

Qui presentiamo un protocollo per la microdissezione laser-assistita di specifici tipi di cellule vegetali per la profilazione trascrizionale. Sebbene il protocollo sia adatto a diverse specie e tipi di cellule, l'attenzione si concentra sulle cellule altamente inaccessibili della linea germinale femminile, importanti per la riproduzione sessuale e apomittica nel genere delle crocifere Boechera.

Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo per la LAM è isolare cellule vegetali specifiche per la generazione di RNA ad alta integrità destinato all'analisi trascrizionale. L'attenzione è rivolta a cellule di difficile accesso, come le cellule uovo, in specie sessuali e apomittiche di *Boechera*. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica dello sviluppo vegetale, come la base trascrizionale alla base della riproduzione sessuale e asessuale delle piante attraverso i semi.Il vantaggio principale di questa tecnica è che possono essere eseguiti determinati tipi specifici di stili. Superando l'effetto di mascheramento delle trascrizioni di tipi cellulari rari nell'analisi dei tessuti aterogenetici. Per iniziare questa procedura, utilizzando la stazione di bloccaggio, riempire un vassoio di bilanciamento in plastica fresco preriscaldato con paraffina fusa a 56 gradi Celsius.Sollevare il coperchio del bagno di paraffina e prendere una cassetta alla volta. Trasferire un campione nella paraffina fusa a 56 gradi Celsius in un vassoio di bilanciamento. Procedere rapidamente per evitare che la paraffina si indurisca attorno al campione durante la manipolazione della cassetta.Quindi, posizionare il campione in base al disegno sperimentale utilizzando un ago da preparazione. Ripetere la procedura fino a quando tutti i campioni non sono stati trasferiti. Per preparare sezioni sottili per LAM, su un tavolo illuminato, rimuovere la paraffina con il campione dal vassoio di plastica.Dissezionare un blocco di cera contenente il campione, come un bocciolo o un fiore, utilizzando una lametta priva di RNasi. Successivamente, sciogliere una piccola goccia di cera di paraffina sulla punta di una spatola. E utilizzare la cera calda per fissare il blocco con il campione incorporato sul supporto.Rimuovere la cera in eccesso intorno al campione con una lametta e assicurarsi che il blocco abbia una superficie quadrata con bordi paralleli. Successivamente, impostare la piastra riscaldante a 42 gradi Celsius. Montare in sicurezza il campione sul microtomo.Preparare sezioni di sette micrometri di spessore per le cellule del gametofito maturo di boechera. Successivamente, trasferire i nastri di paraffina lunghi da 10 a 15 centimetri in una scatola di plastica con un cartoncino nero sul fondo, prima di posizionarli sui vetrini per LAM. Per preparare i vetrini per LAM, posizionare da cinque a dieci vetrini con cornice metallica sulla piastra riscaldante con le superfici piatte rivolte verso l'alto.Pipettare da uno a due millilitri di acqua priva di RNasi sulla parte in plastica dei vetrini. Utilizzando una lametta, tagliare i nastri di paraffina in pezzi corti di circa quattro-cinque centimetri. Di lunghezza sufficiente da coprire le finestre in plastica dei vetrini.Quindi, utilizzare una pinzetta e un ago da preparazione per posizionare i listelli di paraffina paralleli tra loro sulla finestra di plastica dei vetrini. Sollevare con attenzione i vetrini da un'estremità per rimuovere l'acqua e riposizionarli. Coprire la piastra riscaldante con un coperchio di plastica senza toccare i vetrini e assicurarsi che il coperchio di plastica permetta lo scambio d'aria.Asciugare le vetrini a 42 gradi Celsius durante la notte. Sotto una cappa chimica, deparaffinare i vetrini in xilolo due volte per 10 minuti ogni volta. Assicurarsi di immergere solo la parte in plastica dei vetrini e mantenere asciutto l'estremità più larga della struttura metallica di ciascun vetrino per facilitarne la rimozione.Lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti nella cappa chimica prima della LAM. In questa procedura, accendere il computer e il microscopio per la LAM. Successivamente, avviare il programma che controlla il microscopio e il laser.Accendere il box di controllo del laser e attivare il laser premendo il pulsante corrispondente sul box di controllo. Successivamente, inserire un cappuccio nel portacappucci. Posizionare il vetrino LAM su un vetrino da microscopia e assicurarsi che la superficie piatta del vetrino con i tessuti attaccati sia rivolta verso il vetrino di vetro.Quindi, posizionare il vetrino nell'apparecchio con il vetrino di vetro rivolto verso il basso. Infine, posizionare il supporto del cappuccio con il cappuccio nell'apparecchio. Selezionare l'obiettivo 4x.Nel programma, spostare il coperchio in posizione aperta. Successivamente, eseguire una scansione del vetrino. Esaminare il vetrino e identificare le strutture di interesse.Individuare e salvare le loro posizioni sul vetrino per poter tornare esattamente alla stessa posizione durante il passaggio di taglio. Quindi, selezionare un obiettivo appropriato. Verificare la posizione del laser premendo una volta il pulsante di scatto del laser.Idealmente, in una parte della membrana senza tessuto. Con il cappuccio in posizione abbassata, utilizzare lo strumento penna manuale per delimitare i bordi del tipo cellulare o del tessuto di interesse. Ad esempio, la cellula uovo.Dissezionarla con il laser premendo "Cut". Per isolare singole cellule, è fondamentale identificarle chiaramente nelle sezioni corrette. Inoltre, le cellule dovrebbero avere un diametro di almeno otto micrometri per rendere possibile un'analisi trascrizionale specifica per tipo cellulare.Si noti che la sezionatura deve essere ripetuta se il bordo attorno alla cellula non &egrave; stato completamente dissezionato, il che di solito &egrave; visibile sullo schermo. In questo caso, si consiglia di impostare il software in modo da eseguire automaticamente due ripetizioni della sezione come procedura standard. Successivamente, sollevare il cappuccio e spostarsi alla prossima posizione di salvataggio con una struttura di interesse e dissezionare la sezione della cellula successiva, fino a quando tutte le cellule di interesse di un vetrino sono state raccolte.Assicurarsi che il cappuccio sia posizionato in modo che la nuova sezione aderisca a una posizione vuota sul cappuccio. Dopo aver isolato i tipi cellulari di interesse da tutti i vetrini, rimuovere il vetrino dall'apparecchio. Posizionare il supporto del cappuccio nella posizione bassa e ispezionare visivamente la superficie del cappuccio.Utilizzare l'obiettivo 4x per escludere contaminazioni non specifiche del campione. Quindi chiudere il cappuccio e congelare le sezioni secche a meno 80 gradi Celsius fino all'uso successivo.Di seguito è riportato il disegno schematico del gametofito femminile maturo. Si tratta di sezioni sottili di ovuli che contengono gametofiti femminili di boechera divaricarpa, in cui le cellule uovo sono chiaramente identificabili grazie alla morfologia caratteristica del gametofito femminile. La qualità dell'RNA ottenuta dalle sezioni delle cellule uovo è risultata simile a quella analizzata nelle aree di tessuto più ampie raccolte dagli stessi vetrini come controlli.La qualità dell'RNA ottenuta era adatta al sequenziamento dell'RNA specifico per tipo cellulare, portando all'identificazione di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittica ma non nella cellula centrale apomittica, nella cellula sinergide o nella cellula iniziale apomittica. Né nelle cellule del gametofito sessuale maturo di arabidopsis thaliana. Altri tipi cellulari e tessutali di specie diverse possono essere analizzati al fine di rispondere ad ulteriori quesiti di genetica dello sviluppo.Come la base molecolare dell'imprinting nell'endosperma e negli embrioni dei semi delle piante. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della genetica dello sviluppo e della riproduzione vegetale per esplorare la base trascrizionale della riproduzione apomittica nel genere Boechera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere RNA di alta qualità per analisi trascrizionali specifiche per tipo cellulare mediante microdissezione assistita da laser.

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Laser Microdissezione Cattura di tessuti di mammiferi

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