Laser-assistita Microdissection (LAM) come strumento per trascrizionale Profiling di tipi di cellule individuali
10 maggio 2016
Qui presentiamo un protocollo per la microdissezione laser-assistita di specifici tipi di cellule vegetali per la profilazione trascrizionale. Sebbene il protocollo sia adatto a diverse specie e tipi di cellule, l'attenzione si concentra sulle cellule altamente inaccessibili della linea germinale femminile, importanti per la riproduzione sessuale e apomittica nel genere delle crocifere Boechera.
L'obiettivo generale di questo protocollo per la LAM è isolare cellule vegetali specifiche per la generazione di RNA ad alta integrità destinato all'analisi trascrizionale. L'attenzione è rivolta a cellule di difficile accesso, come le cellule uovo, in specie sessuali e apomittiche di *Boechera*. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della genetica dello sviluppo vegetale, come la base trascrizionale alla base della riproduzione sessuale e asessuale delle piante attraverso i semi.
Il vantaggio principale di questa tecnica è che possono essere eseguiti determinati tipi specifici di stili. Superando l'effetto di mascheramento delle trascrizioni di tipi cellulari rari nell'analisi dei tessuti aterogenetici. Per iniziare questa procedura, utilizzando la stazione di bloccaggio, riempire un vassoio di bilanciamento in plastica fresco preriscaldato con paraffina fusa a 56 gradi Celsius.
Sollevare il coperchio del bagno di paraffina e prendere una cassetta alla volta. Trasferire un campione nella paraffina fusa a 56 gradi Celsius in un vassoio di bilanciamento. Procedere rapidamente per evitare che la paraffina si indurisca attorno al campione durante la manipolazione della cassetta.
Quindi, posizionare il campione in base al disegno sperimentale utilizzando un ago da preparazione. Ripetere la procedura fino a quando tutti i campioni non sono stati trasferiti. Per preparare sezioni sottili per LAM, su un tavolo illuminato, rimuovere la paraffina con il campione dal vassoio di plastica.
Dissezionare un blocco di cera contenente il campione, come un bocciolo o un fiore, utilizzando una lametta priva di RNasi. Successivamente, sciogliere una piccola goccia di cera di paraffina sulla punta di una spatola. E utilizzare la cera calda per fissare il blocco con il campione incorporato sul supporto.
Rimuovere la cera in eccesso intorno al campione con una lametta e assicurarsi che il blocco abbia una superficie quadrata con bordi paralleli. Successivamente, impostare la piastra riscaldante a 42 gradi Celsius. Montare in sicurezza il campione sul microtomo.
Preparare sezioni di sette micrometri di spessore per le cellule del gametofito maturo di boechera. Successivamente, trasferire i nastri di paraffina lunghi da 10 a 15 centimetri in una scatola di plastica con un cartoncino nero sul fondo, prima di posizionarli sui vetrini per LAM. Per preparare i vetrini per LAM, posizionare da cinque a dieci vetrini con cornice metallica sulla piastra riscaldante con le superfici piatte rivolte verso l'alto.
Pipettare da uno a due millilitri di acqua priva di RNasi sulla parte in plastica dei vetrini. Utilizzando una lametta, tagliare i nastri di paraffina in pezzi corti di circa quattro-cinque centimetri. Di lunghezza sufficiente da coprire le finestre in plastica dei vetrini.
Quindi, utilizzare una pinzetta e un ago da preparazione per posizionare i listelli di paraffina paralleli tra loro sulla finestra di plastica dei vetrini. Sollevare con attenzione i vetrini da un'estremità per rimuovere l'acqua e riposizionarli. Coprire la piastra riscaldante con un coperchio di plastica senza toccare i vetrini e assicurarsi che il coperchio di plastica permetta lo scambio d'aria.
Asciugare le vetrini a 42 gradi Celsius durante la notte. Sotto una cappa chimica, deparaffinare i vetrini in xilolo due volte per 10 minuti ogni volta. Assicurarsi di immergere solo la parte in plastica dei vetrini e mantenere asciutto l'estremità più larga della struttura metallica di ciascun vetrino per facilitarne la rimozione.
Lasciare asciugare i vetrini per 10 minuti nella cappa chimica prima della LAM. In questa procedura, accendere il computer e il microscopio per la LAM. Successivamente, avviare il programma che controlla il microscopio e il laser.
Accendere il box di controllo del laser e attivare il laser premendo il pulsante corrispondente sul box di controllo. Successivamente, inserire un cappuccio nel portacappucci. Posizionare il vetrino LAM su un vetrino da microscopia e assicurarsi che la superficie piatta del vetrino con i tessuti attaccati sia rivolta verso il vetrino di vetro.
Quindi, posizionare il vetrino nell'apparecchio con il vetrino di vetro rivolto verso il basso. Infine, posizionare il supporto del cappuccio con il cappuccio nell'apparecchio. Selezionare l'obiettivo 4x.
Nel programma, spostare il coperchio in posizione aperta. Successivamente, eseguire una scansione del vetrino. Esaminare il vetrino e identificare le strutture di interesse.
Individuare e salvare le loro posizioni sul vetrino per poter tornare esattamente alla stessa posizione durante il passaggio di taglio. Quindi, selezionare un obiettivo appropriato. Verificare la posizione del laser premendo una volta il pulsante di scatto del laser.
Idealmente, in una parte della membrana senza tessuto. Con il cappuccio in posizione abbassata, utilizzare lo strumento penna manuale per delimitare i bordi del tipo cellulare o del tessuto di interesse. Ad esempio, la cellula uovo.
Dissezionarla con il laser premendo "Cut". Per isolare singole cellule, è fondamentale identificarle chiaramente nelle sezioni corrette. Inoltre, le cellule dovrebbero avere un diametro di almeno otto micrometri per rendere possibile un'analisi trascrizionale specifica per tipo cellulare.
Si noti che la sezionatura deve essere ripetuta se il bordo attorno alla cellula non è stato completamente dissezionato, il che di solito è visibile sullo schermo. In questo caso, si consiglia di impostare il software in modo da eseguire automaticamente due ripetizioni della sezione come procedura standard. Successivamente, sollevare il cappuccio e spostarsi alla prossima posizione di salvataggio con una struttura di interesse e dissezionare la sezione della cellula successiva, fino a quando tutte le cellule di interesse di un vetrino sono state raccolte.
Assicurarsi che il cappuccio sia posizionato in modo che la nuova sezione aderisca a una posizione vuota sul cappuccio. Dopo aver isolato i tipi cellulari di interesse da tutti i vetrini, rimuovere il vetrino dall'apparecchio. Posizionare il supporto del cappuccio nella posizione bassa e ispezionare visivamente la superficie del cappuccio.
Utilizzare l'obiettivo 4x per escludere contaminazioni non specifiche del campione. Quindi chiudere il cappuccio e congelare le sezioni secche a meno 80 gradi Celsius fino all'uso successivo.
Di seguito è riportato il disegno schematico del gametofito femminile maturo. Si tratta di sezioni sottili di ovuli che contengono gametofiti femminili di boechera divaricarpa, in cui le cellule uovo sono chiaramente identificabili grazie alla morfologia caratteristica del gametofito femminile. La qualità dell'RNA ottenuta dalle sezioni delle cellule uovo è risultata simile a quella analizzata nelle aree di tessuto più ampie raccolte dagli stessi vetrini come controlli.
La qualità dell'RNA ottenuta era adatta al sequenziamento dell'RNA specifico per tipo cellulare, portando all'identificazione di 236 geni espressi nella cellula uovo apomittica ma non nella cellula centrale apomittica, nella cellula sinergide o nella cellula iniziale apomittica. Né nelle cellule del gametofito sessuale maturo di arabidopsis thaliana. Altri tipi cellulari e tessutali di specie diverse possono essere analizzati al fine di rispondere ad ulteriori quesiti di genetica dello sviluppo.
Come la base molecolare dell'imprinting nell'endosperma e negli embrioni dei semi delle piante. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della genetica dello sviluppo e della riproduzione vegetale per esplorare la base trascrizionale della riproduzione apomittica nel genere Boechera. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ottenere RNA di alta qualità per analisi trascrizionali specifiche per tipo cellulare mediante microdissezione assistita da laser.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo di microdissezione assistita da laser (LAM) per isolare cellule vegetali specifiche, concentrandosi sulle cellule della linea germinale femminile in specie di Boechera. La tecnica è stata ideata per generare RNA ad alta integrità per il profilo trascrizionale, contribuendo alla comprensione della riproduzione vegetale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Genetica dello sviluppo vegetale
- Analisi del profilo trascrizionale
- Biologia riproduttiva
Sfondo
- L'isolamento di specifiche cellule vegetali è fondamentale per lo studio della dinamica trascrizionale.
- Cellule di difficile accesso, come le cellule uovo, sono importanti per comprendere la riproduzione sessuale e apomittica.
- Questo metodo affronta le difficoltà nell'analizzare tipi cellulari rari.
- Fornisce informazioni sulla base trascrizionale della riproduzione attraverso i semi.
Scopo dello studio
- Isolare cellule vegetali specifiche per l'estrazione di RNA ad alta integrità.
- Indagare i meccanismi trascrizionali alla base della riproduzione vegetale.
- Migliorare la comprensione della riproduzione sessuale e asessuale nelle piante.
Metodi Utilizzati
- Tecnica di microdissezione assistita da laser (LAM).
- Utilizzo di una stazione di bloccaggio e cera paraffinica per l'isolamento delle cellule.
- Concentrazione su cellule della linea germinale femminile in specie di Boechera.
- Analisi trascrizionale delle cellule isolate.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di cellule uovo da specie di Boechera.
- RNA ad alta integrità ottenuto per analisi successive.
- Informazioni sui profili trascrizionali delle cellule riproduttive.
- Il metodo dimostra potenzialità per applicazioni più ampie nella genetica vegetale.
Conclusioni
- Il protocollo LAM è efficace per l'isolamento di cellule vegetali specifiche.
- Permette nuove possibilità di ricerca nella biologia riproduttiva delle piante.
- Questa tecnica può contribuire a chiarire la base genetica della riproduzione nelle piante.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La microdissezione assistita da laser (LAM) consente l'isolamento di RNA ad alta integrità da tipi cellulari rari e difficilmente accessibili, come le cellule uovo delle piante, risolvendo un collo di bottiglia fondamentale nel profilo trascrizionale applicato alla genetica dello sviluppo. Fornendo dati trascrittomici specifici per tipo cellulare, la LAM supporta una riduzione meccanicistica dei rischi nella validazione degli obiettivi e aumenta la fiducia predittiva nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta. Questa capacità è direttamente applicabile agli sforzi di ricerca e sviluppo nel settore biofarmaceutico volti a comprendere sistemi biologici complessi attraverso una precisa dissezione molecolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'attività trascrizionale in tipi cellulari specifici per chiarire la funzione genica e il coinvolgimento nei percorsi biologici.
- Valore operativo: Riduce i segnali di confondimento derivanti da tessuti eterogenei, migliorando la specificità del bersaglio e la riduzione del rischio biologico.
- Valore predittivo: Favorisce l'identificazione di bersagli basata su ipotesi, collegando profili molecolari a risultati fenotipici in contesti cellulari definiti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera input di RNA purificato adatti a saggi trascrizionali successivi, inclusi il sequenziamento dell'RNA e la qPCR, a partire da cellule microdissecate.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per la preparazione dei campioni che mantiene l'integrità dell'RNA, consentendo prestazioni costanti nei saggi.
- Scalabilità: Facilita la preparazione di campioni biologici validati per campagne di screening ad alto rendimento rivolte a popolazioni cellulari rare.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega il profiling trascrizionale nella fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo informazioni molecolari specifiche per tipo cellulare e rilevanti per la malattia.
- Allineamento dei Biomarcatori: Favorisce l'identificazione di firme trascrizionali che potrebbero fungere da biomarcatori predittivi o farmacodinamici nei modelli preclinici.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di proseguimento o interruzione riducendo l'incertezza meccanicistica nei percorsi del bersaglio grazie a una risoluzione cellulare precisa.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
LAM si inserisce nel percorso della scoperta precoce consentendo l'isolamento preciso di cellule bersaglio prima dell'analisi trascrizionale, supportando l'identificazione dei candidati principali grazie a una chiara comprensione meccanicistica e orientando le attività precliniche mediante set di dati allineati ai biomarcatori.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi consentendo il profilo trascrizionale di specifici tipi cellulari di interesse.
- Screening: Produce estratti di RNA standardizzati e di alta qualità adatti a saggi trascrizionali quantitativi e al profilo di risposta ai composti.
- Analisi: Fornisce misurazioni dell'espressione genica specifiche per tipo cellulare che permettono un confronto accurato tra condizioni sperimentali ed effetti dei trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati molecolari ottenuti da cellule isolate alla continuità preclinica attraverso firme trascrizionali conservate e validazione funzionale.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una capacità di piattaforma adattabile applicabile a più progetti che studiano tipi cellulari rari o inaccessibili in tessuti complessi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica grazie a dati specifici per tipo cellulare.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione della preparazione dei campioni per flussi di lavoro trascrizionali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo l'eliminazione precoce dei rischi associati agli obiettivi sulla base di un contesto biologico preciso.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio dei candidati fornendo una giustificazione meccanicistica più chiara per il loro avanzamento.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in istologia, microscopia e tecniche di dissezione basate su laser.
- È subordinato all'accesso a sistemi di microdissezione laser, ambienti privi di RNasi e kit di estrazione dell'RNA compatibili.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per la preparazione dei vetrini, la sezionatura e i parametri di dissezione, al fine di garantire coerenza.
- Deve tenere conto della variabilità nel rendimento e nella qualità dell'RNA quando si lavora con tipi cellulari piccoli o fragili, come indicato nella fonte.
- È limitato dalla necessità di protocolli di sezionatura e colorazione ottimizzati per mantenere la morfologia del tessuto e l'integrità dell'RNA durante le procedure.
