Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all'Immagine sviluppo Zebrafish Eye

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di visualizzare lo sviluppo oculare dell'embrione di Zebrafish al microscopio a foglio ottico ed elaborare il set di dati multiview acquisiti in Figi tramite il plug-in dell'applicazione di ricostruzione multiview. Questo metodo può aiutarti a comprendere gli eventi morfogenetici nello sviluppo animale. Il vantaggio principale di questo metodo è che è possibile osservare eventi morfogenetici nell'embrione in via di sviluppo con un'alta risoluzione spaziale e temporale.

Il principale vantaggio della microscopia a foglio luminoso sono la bassa fototossicità del metodo, i tempi di acquisizione rapidi con cui è possibile visualizzare il campione e che è possibile visualizzare il campione da varie angolazioni, le cosiddette visualizzazioni. L'acquisizione del campione da diverse viste ci permette di superare il degrado del segnale e dell'asse impostato. Queste diverse immagini possono quindi essere utilizzate e registrate utilizzando microsfere fluorescenti attorno al campione.

Possiamo ricostruire il volume tridimensionale raggiungendo la risoluzione isotropa. Sebbene dimostriamo l'uso della microscopia a foglio di luce per lo sviluppo degli occhi di Zebrafish, questo metodo può essere utilizzato anche per rispondere a varie domande nella biologia dello sviluppo e nelle neuroscienze utilizzando vari organismi modello. Per iniziare, avvitare l'obiettivo di rilevamento nel microscopio mantenendo coperti gli obiettivi illuminanti.

Quindi, stappare gli obiettivi e far scorrere con cautela la camera del campione nel microscopio. Fissare la camera serrando la vite. Quindi, collegare la sonda di temperatura e il blocco Peltier al microscopio.

I due tubi che fanno circolare il liquido di raffreddamento per il blocco Peltier sono compatibili con entrambi i connettori e possono funzionare in entrambi gli orientamenti. Quindi, utilizzare una siringa per caricare la camera attraverso la siringa con la soluzione fino al bordo superiore delle finestre della camera e verificare la presenza di perdite. Ora, accendi il microscopio, il computer e l'incubazione.

Avviare il software operativo del microscopio e impostare la temperatura di incubazione a 28,5 gradi Celsius. Mentre la temperatura è richiesta per un'ora, preparare il campione. Iniziate con la preparazione dell'agarosio.

Sciogliere un'aliquota preparata da un millilitro di agarosio con punto di fusione basso all'1% in E tre mezzo a 70 gradi Celsius. Dopo circa 15 minuti, trasferire 600 microlitri di agarosio fuso in un tubo fresco da 1,5 millilitri e aggiungere 250 microlitri di terreno E tre, 50 microlitri di 0,4% MS 222 e 25 microlitri di soluzione madre di perle fluorescenti a vortice. Posizionare il tubo in un blocco riscaldante a circa 39 gradi Celsius per lasciare che l'agarosio si avvicini al suo punto di gelificazione.

Quindi, spingere gli stantuffi con punta in teflon verso il basso fino al fondo dei capillari di vetro di un millimetro di diametro interno. Preparane cinque. Ora, agita brevemente la miscela di agarosio e poi trasferisci cinque embrioni con la minima quantità di liquido.

Quindi, inserire un capillare e aspirare prima una testa dell'embrione. La testa deve entrare prima della coda e non ci possono essere bolle d'aria. Aspirare una soluzione sufficiente in modo che ci siano circa due centimetri di agarosio sopra l'embrione e un centimetro di agarosio sotto di esso.

Aspirare un embrione in ogni capillare prima di procedere. Questo passaggio richiede un po' di pratica per essere padroneggiato. Preparati utilizzando embrioni non preziosi.

Quando l'agarosio si solidifica completamente, conservare i campioni in terreno E tre appoggiando i capillari a una parete del becher con plastilina con l'apertura inferiore in soluzione. Ora assembla il supporto del campione. Per prima cosa, inserisci due manicotti di plastica della giusta misura l'uno contro l'altro nello stelo.

Gli spacchi sulle maniche devono essere rivolti verso l'esterno. Quindi, fissare una vite di fissaggio. E inserire il capillare attraverso il supporto fino a quando la banda di colore nero diventa visibile sull'altro lato.

Evitare di toccare lo stantuffo. Quindi serrare la vite di fissaggio. Quindi, spingere un centimetro di agarosio fuori dal capillare e tagliarlo.

Quindi inserire lo stelo nel disco portacampioni. Prima di caricare il disco campione, verificare che lo stadio si trovi nella posizione più alta nel software di controllo. Quindi, utilizzare le guide per far scorrere il supporto e il campione verso il basso nel microscopio.

Ora, immagina l'esempio scelto come descritto nel protocollo di testo. L'elaborazione dei dati avviene in Figi. È una distribuzione di ImageJ.

Prima di iniziare, Figi dovrebbe essere aggiornato. Salvare il set di dati dell'immagine acquisita in un'unica cartella. I file intermedi dell'elaborazione delle immagini verranno salvati nella stessa cartella.

Ora avvia l'applicazione di ricostruzione multi-vista. Quindi, definisci un nuovo set di dati. Seleziona l'opzione Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats e crea un nome per il file di dati di output.

Quindi selezionare il primo file CZI del set di dati. I metadati verranno caricati automaticamente. Nei metadati dell'immagine, controlla che il numero degli angoli, i canali, le illuminazioni e la dimensione del voxel siano tutti impostati correttamente.

Dopo aver premuto OK, si apre una finestra di registro, la finestra di Esplora impostazioni della vista e una finestra della console. L'esploratore di configurazione delle viste fornisce un'interfaccia facile da usare. Seleziona i file che devono essere elaborati e premi il tasto destro del mouse.

Si aprirà una nuova finestra che mostra le diverse fasi di elaborazione man mano che vengono eseguite. Nell'angolo in alto a destra ci sono i pulsanti info e salva. Info visualizza un riepilogo del contenuto del file di dati salvato e premendo Salva si salvano i risultati dell'elaborazione.

In caso contrario, il programma non salva i risultati delle fasi di elaborazione. Per salvare nuovamente l'intero set di dati, selezionare innanzitutto tutti i file premendo Ctrl+A e facendo clic con il pulsante destro del mouse. Selezionare quindi Risalva set di dati e Come HDF5.

È quindi necessario selezionare una conferma dell'azione di salvataggio. Dopo alcuni minuti, per ogni punto temporale, il programma indicherà quando il nuovo salvataggio è completo. Quindi, procedi con il rilevamento dei punti di interesse nei dati.

Seleziona tutti i punti temporali premendo Ctrl+A e fai clic con il pulsante destro del mouse. Per selezionare, rilevare i punti di interesse. Dalle opzioni, selezionare differenza di gaussiana.

E seleziona, campiona le immagini prima della segmentazione. Nella finestra successiva, scegli le impostazioni di rilevamento. Dalle opzioni di localizzazione dei subpixel, selezionare l'adattamento quadratico tridimensionale.

Quindi, nella specifica del punto di interesse, selezionare interattivo. Per l'opzione XY con campionamento verso il basso, selezionare la risoluzione Z corrispondente. E per il campionamento verso il basso Z, selezionare 1x.

Quindi, eseguire l'operazione selezionando l'opzione Java di calcolo sulla CPU. Dalla finestra pop-up, selezionare una vista per testare i parametri. Una volta caricata la vista, regola la luminosità e il contrasto premendo Ctrl+Maiusc+C sulla tastiera.

Inoltre, per il rilevamento del tallone, attiva l'opzione cerca il verde massimo. Ora osserva la segmentazione come anelli verdi attorno ai rilevamenti. Regolare i valori di differenza di gaussien per i parametri sigma uno e soglia per segmentare in modo ottimale le perline con il numero minimo di falsi positivi.

Ogni cordone deve essere rilevato una sola volta. Dopo aver determinato i parametri ottimali, premere Fine. Dopo che il computer ha caricato, ogni singola vista del punto temporale e segmentato le perline, il programma emette un file di registro con il numero di perline rilevate per visualizzazione.

Dovrebbero esserci tra le 600 e le diverse migliaia di perline per vista. In caso contrario, i parametri di rilevamento devono essere modificati. Questo è un processo complicato.

La piramide di rilevamento è raramente accurata al primo tentativo e i ripristini possono variare tra i punti temporali di un film. Rilassare il fresco rileverà tutte le vere perle e consentirà più falsi positivi può aiutare. Se nessuna combinazione della piramide funziona, è necessario acquisire un nuovo set di dati utilizzando diverse perle fluorescenti.

Procedere ora con la registrazione dei rilevamenti e l'esecuzione di una deconvoluzione multivista dallo stack. LSFM è un metodo ideale per l'imaging dei processi di sviluppo su più scale, dalle strutture intercellulari alle cellule e agli interi tessuti, per lunghi periodi di tempo. Eventi intercellulari molto veloci possono essere catturati ad alta risoluzione, come la crescita di microtubuli nelle cellule neuroprogenitrici.

Da un unico filmato, è possibile quantificare la crescita dei microtubuli. Le strutture intracellulari possono essere seguite per molte ore, come il centrosoma all'interno delle cellule gangliari retiniche. Il comportamento di una singola cellula può essere estratto da immagini di interi tessuti, come la posizione trans di una cellula gangliare attraverso la retina.

La deconvoluzione multi-vista crea uno stack Z isotropo combinando diverse viste utilizzando la funzione di diffusione dei punti. Ciò fornisce immagini notevolmente migliorate rispetto alle visualizzazioni singole o alle fusioni medie ponderate. Ad esempio, la trasformazione della vescicola ottica in una coppa ottica può essere studiata da fette ottiche in diversi orientamenti attraverso il set di dati mostrato.

Inoltre, la buona qualità complessiva dell'immagine, anche all'interno dell'embrione, è evidente. Come quando si osserva la morfogenesi della coppa ottica. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come montare un'immagine di embrioni di pesce zebra in un microscopio a foglio luminoso.

E come elaborare set di dati multi view in Figi. Una volta padroneggiato, ci vorranno circa due ore per iniziare un esperimento time lapse su microscopio a foglio luminoso. La successiva analisi dei dati richiederà molto più tempo.

Potrebbe essere utile utilizzare un cluster di computer per tale attività. Suggerimenti più pratici, consigli per la risoluzione dei problemi e collegamenti ad altre risorse sono disponibili nel protocollo di testo. Prima dell'esperimento deve essere disponibile una capacità di archiviazione sufficiente e un chiaro piano di elaborazione dei dati.

In caso di problemi, domande o richieste future, fare riferimento al sito Web delle rispettive funzionalità o ai problemi di file sui rispettivi repository github.