Name: Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza allImmagine sviluppo Zebrafish Eye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Scopri la microscopia a foglio di luce per visualizzare lo sviluppo dell'occhio in embrioni di zebrafish con alta risoluzione spaziale e temporale. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale degli eventi morfogenetici.

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Vogliamo ringraziare Tobias Pietzsch per aver fornito il suo potente software open source BigDataViewer. Ringraziamo la Light Microscopy Facility del Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), ovvero Jan Peychl, Sebastian Bundschuh e Davide Accardi per l'assistenza tecnica, la perfetta manutenzione dei microscopi utilizzati nello studio e per i commenti sul manoscritto e H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) per il BigDataServer. Ringraziamo Julia Eichhorn per aver assemblato il Movie 1. I membri del laboratorio Norden e Svea Grieb hanno fornito molti commenti utili sul manoscritto. Jaroslav Icha, Christopher Schmied e Jaydeep Sidhaye sono membri della International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology e studenti di dottorato presso la TU Dresden. Pavel Tomancak è supportato dall'ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development e dallo Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden è supportata dal Programma Scientifico della Frontiera Umana (CDA-00007/2011) e dalla Fondazione Tedesca per la Ricerca (DFG) [SFB 655, A25].

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La pubblicazione di questo video-articolo è supportato da Zeiss.

Morfogenesi è il processo che dà forma l&#39;embrione e, insieme con la crescita e la differenziazione guida la ontogenesi da un ovulo fecondato in un organismo multicellulare maturo. I processi morfogenetici durante lo sviluppo degli animali possono essere analizzati meglio da immagini di esemplari viventi intatti 1-3. Ciò perché tale l&#39;imaging intero embrione conserva tutti i componenti che guidano e regolano lo sviluppo compreso gradienti di molecole di segnalazione, matrice extracellulare, vascolarizzazione, innervazione così come le proprietà meccaniche del tessuto circostante. Per colmare le scale, in cui si verifica la morfogenesi, gli eventi subcellulare veloci devono essere catturato su una scala temporale minuto nel contesto dello sviluppo di tutto il tessuto sopra ore o giorni. Per soddisfare tutte queste esigenze, una moderna implementazione 4 del ortogonali illuminazione piano microscopio 5 è stato sviluppato. In origine, è stato chiamato il piano di illuminazione selettiva Microscopia (SPIM) 4; ora un Term Sheet chiaro che tutto abbraccia microscopia a fluorescenza (LSFM) viene utilizzato in genere. LSFM permette l&#39;imaging ad elevata risoluzione temporale, mentre induce meno fototossicità di scansione laser o disco rotante microscopi confocale 6,7. Al giorno d&#39;oggi, ci sono già molte implementazioni del principio di base foglio di luce di illuminazione ed è stato utilizzato per l&#39;immagine di una grande varietà di esemplari e dei processi precedentemente inaccessibili ai ricercatori 8-11. Per prima cosa vorremmo sottolineare alcuni vantaggi chiave di LSFM rispetto agli approcci confocale microscopia convenzionale: Per acquisire risultati significativi Dall&#39;imaging vivo esperimenti microscopiche, è importante che l&#39;osservazione influisce solo minimamente il campione. Tuttavia, molti organismi, tra cui zebrafish sono molto sensibili alla esposizione alla luce laser, il che rende difficile per l&#39;immagine di loro in un microscopio confocale con elevata risoluzione temporale senza fototossicità efdifetti come in fase di stallo o ritardato 6,7 sviluppo. LSFM è attualmente la tecnica di imaging di fluorescenza con minimi effetti dirompenti sul campione 7. Poiché il sottile foglio leggero laser illumina solo la parte del campione che viene esposta in un particolare punto di tempo, il foglio microscopio ottico è usando fotoni molto efficiente. Di conseguenza, la bassa esposizione alla luce permette più a lungo le osservazioni time-lapse di esemplari sani, ad esempio 12-17. Inoltre, grazie alla minima invasività della LSFM, il numero di immagini acquisite non è più dettata dalla quantità di luce che il campione può tollerare, ma piuttosto da quanti dati possono essere elaborati e memorizzati. Sulla stessa linea di mantenere il campione in condizioni fisiologiche vicino, LSFM viene fornito con il montaggio del campione strategie alternative ben si adatta per gli embrioni dal vivo. Nelle tecniche LSFM, gli embrioni sono tipicamente inseriti all&#39;interno di una colonna sottile di bassa agarosio percentuale. il mounting in cilindri agarosio permette la completa libertà di rotazione, in modo che il campione può essere osservato dalla angolo perfetto (in LSFM denominato vista) e da diverse viste simultaneamente. Imaging MultiView e la successiva fusione MultiView è utile in particolare per i grandi campioni di scattering e permette loro cattura ad alta risoluzione isotropo. Una sintesi di altre possibili strategie di montaggio LSFM può essere trovato nel manuale operativo del microscopio ufficiale, nel capitolo dedicato alla preparazione del campione scritto dal laboratorio di E. Reynaud. È una lettura consigliata, soprattutto se l&#39;obiettivo è quello di diversi campioni dell&#39;immagine quanto descritto qui. L&#39;acquisizione delle immagini in LSFM è grande campo, a base di fotocamera, al contrario di scansione laser microscopio confocale. Ciò si traduce in un rapporto segnale rumore (SNR) per le immagini acquisite superiore e può essere estremamente veloce (decine a centinaia di fotogrammi al secondo). L&#39;elevata sensibilità del LSFM permette inoltre di imaging di samp debolmente fluorescenteles, come fattori di trascrizione espressi a livelli endogeni 18 o, in un prossimo futuro, le proteine ​​endogene marcati usando CRISPR / Cas9. L&#39;elevato SNR è anche importante per il successo analisi dell&#39;immagine valle. L&#39;alta velocità è necessario non solo per catturare processi intracellulari rapidi, ma anche per l&#39;immagine dell&#39;intero embrione da viste multiple abbastanza veloce. Una fusione armoniosa delle visualizzazioni multiple può essere raggiunto solo se il fenomeno osservato non cambia durante l&#39;acquisizione di queste diverse pile z provenienti da viste separate. I vantaggi di LSFM tipicamente non va a scapito della qualità dell&#39;immagine. La risoluzione laterale di LSFM è leggermente peggiore rispetto alla risoluzione di un microscopio confocale. Questo perché gli obiettivi di rilevazione utilizzati in LSFM hanno una minore apertura numerica (di solito 1,0 o inferiore) rispetto a 1.2-1.3 di acqua o immersione silicio obiettivi su configurazioni confocale standard. Inoltre, grazie al rilevamento ampio campo in LSFM (Absence di un foro), c&#39;è più luce fuori fuoco rispetto ad un microscopio confocale. La quantità di out-of-focus luce è determinato dallo spessore foglio leggero. Tuttavia, questi svantaggi sono compensati dal SNR superiore in LSFM. In pratica, questo si traduce in immagini di qualità simili rispetto a, per esempio filatura disco acquisizione confocale 15. Di conseguenza, ciò consente l&#39;estrazione affidabile di caratteristiche come membrane cellulari o nuclei, per esempio, per cell lineage tracing 15,19. La risoluzione assiale LSFM è determinata, oltre all&#39;obiettivo rilevamento, dallo spessore foglio leggero. La risoluzione assiale LSFM può in alcuni casi superare la risoluzione dei microscopi confocale. In primo luogo, il miglioramento della risoluzione viene quando il foglio leggero è più sottile rispetto alla risoluzione assiale dell&#39;obiettivo rilevamento, che tipicamente si verifica per grandi campioni viste con obiettivo a basso ingrandimento. Il secondo modo, come il LSFM può achIEVE migliore risoluzione assiale, è la fusione MultiView, in cui le informazioni ad alta risoluzione XY Da diversi punti di vista si combina in un&#39;unica serie di immagini. Lo stack fusa risultante ha una risoluzione isotropa avvicina i valori di risoluzione nella direzione laterale 20,21. La strategia per la registrazione delle molteplici vista sulla vicenda descritta in questo articolo si basa sull&#39;utilizzo di perle di polistirene fluorescenti come marcatori fiduciari incorporati nel agarosio intorno al campione 20,21. Come risultato della commercializzazione LSFM, questa tecnica è ora disponibile per una vasta comunità di scienziati 22. Pertanto, la motivazione per la scrittura di questo protocollo è quello di rendere questa tecnologia accessibile a biologi dello sviluppo che mancano di esperienza pratica in LSFM e per ottenere questi scienziati iniziato a utilizzare questa tecnologia con i loro campioni. Il nostro protocollo utilizza il microscopio foglio di luce commerciale, che costituisce un concettualmente semplice microscopio tcappello è facile da usare. Vorremmo inoltre segnaliamo altri protocolli più recenti per l&#39;imaging zebrafish con configurazioni LSFM casa costruita, che potrebbero essere adatti per rispondere a particolari domande 23-25. Un&#39;altra opzione ingresso al LSFM sono le piattaforme aperte 26,27, che utilizzano i principi di accesso aperto per portare la microscopia foglio di luce per una comunità più ampia. La documentazione sia l&#39;hardware e gli aspetti del software può essere trovato alla http://openspim.org e https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/. In questo protocollo, si usa il pesce zebra teleosteo come sistema modello per studiare i processi di sviluppo con LSFM. Morfogenesi dell&#39;occhio zebrafish è un esempio che sottolinea molti dei vantaggi di LSFM. LSFM è già stato utilizzato in passato per indagare lo sviluppo degli occhi in Medaka 28 e in zebrafish 29,30. Alla fase iniziale di sviluppo dell&#39;occhio è complicato per orientare l&#39;embrione in modo corretto per la microscopia convenzionale,come il tuorlo ingombranti non consente l&#39;embrione a giacere sul lato con il suo occhio rivolto verso l&#39;obiettivo. Tuttavia, con il montaggio LSFM in una colonna di agarosio, il campione può essere riproducibile posizionato. Inoltre, durante la transizione da vescicola ottica allo stadio tazza ottica, l&#39;occhio eseguono importanti riarrangiamenti morfogenetiche accompagnati dalla crescita, che richiede catturando una grande z stack e un grande campo di vista. Anche per queste sfide LSFM è superiore a confocale convenzionale. Il processo di formazione tazza ottica è tridimensionale, quindi è difficile da comprendere e visualizzare esclusivamente da immagini da una visualizzazione. Questo rende l&#39;imaging MultiView con risoluzione isotropo vantaggioso. Dopo la formazione tazza ottica, la retina diventa sempre più sensibile all&#39;esposizione laser. Così, la fototossicità bassa associata a LSFM è un grande vantaggio per l&#39;imaging a lungo termine. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l&#39;imaging di uno a tre giorni embrioni di zebrafish unlarve ND con focus sullo sviluppo dell&#39;occhio. Il nostro metodo permette la registrazione di filmati time-lapse che copre fino a 12-14 ore con alta risoluzione spaziale e temporale. È importante sottolineare che, mostriamo anche una pipeline per l&#39;elaborazione dei dati, che è un passo essenziale per LSFM, come questa tecnica genera invariabilmente grandi insiemi di dati, spesso nella gamma terabyte.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Lightsheet Z.1</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Roth</td><td></td><td>6351.1</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Sigma</td><td>A4018 o A9414</td><td></td></tr><tr><td>Etile 3-amminobenzoato metanosolfonato (MESAB/MS-222/Tricaina)</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>N-Feniltiourea (PTU)</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Perle fluorescenti rosse da 500 nm F-Y 050</td><td>Millipore (Estapor)</td><td>80380495</td><td></td></tr><tr><td>20 &mu; l (1&nbsp; mm diametro interno, marcato nero) capillari</td><td>marca</td><td>701904</td><td>venduti come pezzo di ricambio per transferpettor</td></tr><tr><td>Pistoni con punta in teflon per 20&nbsp; &mu; l capillari</td><td>Marca</td><td>701932</td><td>venduti come ricambio per transferpettor</td></tr><tr><td>Vetrini circolari diametro 18 mm, spessore selezionato 0,17&nbsp; mm</td><td>Thermo scientific (Menzel-Glaser)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>O-ring per finestre camera 17&times; </td> Pinzetta per microscopia <td></td><td></td><td>Carl Zeiss</td> da 1,5 mm</tr><tr><td>, stile 55</td><td>Dumont</td><td>0209-55-PO</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe Luer-Lock da 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>300865</td><td></td></tr><tr><td>Cavo di prolunga da 150 cm per infusione compatibile con siringhe Luer-Lock Becton</td><td>Dickinson</td><td>397400</td><td></td></tr><tr><td>Links</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collegamento 1 Applicazione</td><td></td><td></td> di ricostruzione Multiview<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration</a> <a href="http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction">http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction</a></td></tr><tr><td>Link 2 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer"> https://github.com/bigdataviewer</a></td></tr><tr><td>Link 3 BigDataViewer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataViewer">http://fiji.sc/BigDataViewer</a></td></tr><tr><td>Link 4 Problemi</td><td></td><td></td> dell'applicazione per la ricostruzione multiview<td><a href="https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues">https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues</a></td></tr><tr><td>Collegamento 5 BigDataViewer-issues</td><td></td><td></td><td><a href="https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues">https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues</a></td></tr><tr><td>Collegamento 6 BigDataServer</td><td></td><td></td><td><a href="http://fiji.sc/BigDataServer">http://fiji.sc/BigDataServer</a></td></tr></tbody></table>

utilizzando tecnica luce microscopia a fluorescenza all&#39;immagine sviluppo zebrafish eye

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

La microscopia a fluorescenza su foglio di luce (LSFM) sta guadagnando sempre più popolarità come metodo per visualizzare lo sviluppo embrionale. I principali vantaggi di LSFM rispetto ai sistemi confocali sono la bassa fototossicità, le strategie di montaggio delicate, l'acquisizione rapida con un elevato rapporto segnale/rumore e la possibilità di acquisire campioni da varie angolazioni (viste) per lunghi periodi di tempo. L'imaging da più viste libera tutto il potenziale di LSFM, ma allo stesso tempo può creare set di dati di dimensioni terabyte. L'elaborazione di tali set di dati è la sfida più grande dell'utilizzo di LSFM. In questo protocollo delineiamo alcune soluzioni a questo problema. Fino a poco tempo fa, la LSFM veniva eseguita principalmente in laboratori che avevano l'esperienza necessaria per costruire e gestire i propri microscopi a foglio di luce. Tuttavia, negli ultimi tre anni sono diventate disponibili diverse implementazioni commerciali di LSFM, che sono multiuso e facili da usare per qualsiasi biologo dello sviluppo. Questo articolo è rivolto principalmente a quei ricercatori che non sono sviluppatori di tecnologia LSFM, ma che desiderano utilizzare LSFM come strumento per rispondere a specifiche domande di biologia dello sviluppo. 
Qui, usiamo l'imaging dello sviluppo dell'occhio del pesce zebra come esempio per introdurre il lettore alla tecnologia LSFM e dimostriamo le applicazioni di LSFM su più scale spaziali e temporali. Questo articolo descrive un protocollo sperimentale completo che inizia con il montaggio di embrioni di zebrafish per LSFM. Delineiamo quindi le opzioni per l'imaging utilizzando il microscopio a foglio ottico disponibile in commercio. È importante sottolineare che spieghiamo anche una pipeline per la successiva registrazione e fusione di set di dati multiview utilizzando una soluzione open source implementata come plug-in Fiji. Sebbene questo protocollo si concentri sull'imaging dell'occhio di zebrafish in via di sviluppo e sull'elaborazione dei dati da una particolare configurazione di imaging, la maggior parte delle intuizioni e dei suggerimenti per la risoluzione dei problemi qui presentati sono di uso generale e il protocollo può essere adattato a una varietà di esperimenti di microscopia a foglio leggero.

LSFM è un metodo ideale per l&#39;imaging processi di sviluppo attraverso le scale. Diverse applicazioni sono compilate qui che mostra l&#39;imaging sia a breve che a lungo termine delle strutture intracellulari, così come le cellule ei tessuti interi. Questi esempi dimostrano anche che LSFM è uno strumento utile a vari stadi di sviluppo dell&#39;occhio dalla formazione tazza ottico al neurogenesi nella retina. Film 1 serve come illustrazione dell&#39;approccio generale LSFM, prima che mostra una vista ingrandita di un embrione intatto nel incorporamento cilindro agarosio in campo chiaro e successivamente mostra una vista dettagliata della retina nel canale di fluorescenza. <img alt="film 1" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie1.jpg" /> Film 1:. LSFM della retina zebrafish Per illustrare l&#39;approccio LSFM, questo film mostra prima nel campo chiaro che l&#39;embrione è ripreso intatto all&#39;interno di ungarose cilindro prima di passare a fluorescenza. Successivamente si è dimostrato che il grande campo di vista permette l&#39;osservazione di tutta la retina. Successivamente, il film mostra una piccola regione ingrandita della retina per evidenziare la buona risoluzione subcellulare. Un Ath5: gap-GFP 37 transgenico zebrafish è stato utilizzato per l&#39;imaging. Questo transgene etichette diverse neuroni della retina (principalmente cellule gangliari e precursori dei fotorecettori). La parte di fluorescenza del film è stato catturato come una singola registrazione con illuminazione a doppia faccia con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W con 5 min intervalli di vista. La proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron viene mostrato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie1.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Movie 2 dimostra, come gli eventi intracellulari molto veloci possono essere catturati con alta risoluzione; in questo caso la crescita dei microtubuli ala loro più finisce nelle cellule progenitrici neuronali della retina. Le informazioni contenute nel film consente per il monitoraggio e la quantificazione dei microtubuli, più fine la crescita. <img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie2.jpg" /> Movie 2:. Dinamica dei microtubuli in una singola cella Questo film consente di catturare in crescita più punte di microtubuli etichettati dal più la punta proteina marcatore EB3-GFP 38. La proteina è espressa in una singola cellula progenitrice retinica. I microtubuli sono in crescita prevalentemente nella direzione da apicale al basale (dall&#39;alto in basso). La velocità media delle comete Eb3 stata misurata come 0.28 ± 0.05 micron / sec. Il punto luminoso nella parte apicale della cellula espositiva attività nucleazione dei microtubuli alto è il centrosoma. Il tipo di embrione selvaggio è stato iniettato con HSP70: EB3-GFP plasmide DNA. Il film è stato acquisito 4 ore dopo shock termico (15 minuti a 37 ° C) a circa 28 hrpost fertilizzione (HPF) come una singola registrazione con illuminazione singola faccia vista utilizzando gli intervalli di tempo oggettivo e 1 sec 63X / 1.0 W. La singola cellula è stata ritagliata da un campo visivo che copre la maggior parte della retina. L&#39;intensità massima è indicata la proiezione di due fette. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie2.mp4" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a> La figura 3 mostra, come le strutture intracellulari possono essere seguite per molte ore. Qui, il centrosoma entro translocating cellule gangliari della retina (RGCs) viene catturato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig3.jpg" /> Figura 3:. Localizzazione Centrosome durante la traslocazione cellule gangliari retiniche Questo montaggio di un esperimento time-lapse mostra la posizione del centrosoma durante la maturazione della retina cellule gangliari (RGC).Nei progenitori neuronali centrosoma è localizzata nella punta estrema del processo apicale (01:00). Durante la divisione cellulare, i due centrosomi servono come pali per il fuso mitotico (2,25). Questa divisione si traduce in una cellula figlia che si differenzia in un RGC e una seconda cellula figlia che diventa un precursore dei fotorecettori. Dopo divisione, il corpo cellulare del RGC trasloca nel lato basale della retina, mentre il processo apicale rimane attaccato al lato apicale. Una volta che la RGC raggiunge il lato basale, il suo processo apicale stacca e il centrosoma viaggia con esso (6,15). Il centrosoma può essere seguita mentre gradualmente ritraendo insieme con il processo apicale (6:50, 7:20, 8:10). Nel l&#39;ultimo fotogramma (08:55) il cellule gangliari sta crescendo un assone dal suo lato basale, mentre il centrosoma è ancora localizzato apicale. L&#39;espressione del mosaico è stata realizzata per iniezione plasmide DNA in tipo selvaggio embrione in uno stadio delle cellule. Le cellule vengono visualizzati dal Ath5: GFP-CAAX (verde) construct, che etichette RGCs e altri neuroni. I centrosomi (frecce) sono etichettati da Centrin-tdTomato 29 espressione (magenta). Il lato apicale della retina è nella parte superiore dell&#39;immagine e il lato basale in basso. Viene mostrata la proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron. Le immagini sono state ritagliate da un film che copre l&#39;intera retina. Il film inizia a circa 34 ore dopo la fecondazione (HPF). A z pila è stata acquisita ogni 5 minuti con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta 10 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In figura 4 è mostrato, come singola comportamento cellulare può essere estratto dai dati catturando tutto il tessuto come nel film 1. Traslocazione di RGC può essere facilmente tracciati e il suo processo apicale e basalees seguito. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig4.jpg" /> Figura 4:. Translocation di una singola cellula gangliare retinica La traslocazione RGC da apicale a lato basale della retina avviene dopo la mitosi terminale come descritto in figura 3 L&#39;RGC è etichettato con espressione del Ath5:. Gap-GFP 37 transgene. Viene mostrata la proiezione massima intensità di un grosso volume di 30 micron. Le immagini sono state ritagliate da un film che copre l&#39;intera retina. Il film inizia a circa 34 HPF. A z pila è stata acquisita ogni 5 minuti con l&#39;obiettivo 40X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta il 5 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5 dimostra la capacità di MultiView LSFM per catturare sc tessutiprocessi morfogenetici ale con risoluzione cellulare sull&#39;esempio di ottica morfogenesi tazza, durante il quale ottica vescicole si trasforma in una coppa ottica. La qualità dell&#39;immagine può essere notevolmente migliorata mediante imaging multiview, quando l&#39;immagine finale è combinata dalle informazioni su 5 viste diverse (in questo caso) in una z stack con risoluzione isotropica. Questa figura illustra il miglioramento della qualità di immagine dopo la fusione medio ponderato e l&#39;ulteriore aumento di contrasto e risoluzione dopo MultiView deconvoluzione. La figura mostra due fette ottici in diversi orientamenti attraverso il set di dati. Inoltre, un montaggio dal set di dati deconvolved mostra la morfogenesi coppa ottica nel corso del tempo. Tutti i punti di tempo sono poi mostrati in Movie 3. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53966/53966fig5.jpg" /> Figura 5: Confronto tra qualità dell&#39;immagine tra visualizzazione singola e due metodi di multiview fusione. (A) Una fetta ottica di visualizzare i dati riportati da singoli vista laterale e (B) vista dorsale. artefatti banda e il degrado del segnale più all&#39;interno del campione sono evidenti. Anche una parte dell&#39;immagine visibile nei dati fuse (CF) non è stato catturato in questa vista particolare. (C) La stessa fetta ottica, ora come MultiView fuso i dati riportati dalla vista laterale e (D) vista dorsale. Si noti che gli artefatti banda sono soppressi e strutture profonde nel campione sono meglio risolti. (E) La stessa fetta ottica ora come MultiView deconvolved dati mostrati alla vista laterale e (F) vista dorsale. Si noti la maggiore contrasto e la risoluzione in modo che le singole membrane cellulari e nuclei possono essere ben distinti. La risoluzione non si deteriora notevolmente più profonda all&#39;interno del campione. Il set di dati è stata acquisita con illuminazione a doppia faccia da 5 viste di circa 20 gradi. Lo Z pile di abil 100 micron con 1,5 micron dimensione del passo sono stati acquisiti ad ogni vista in intervalli di 10 min per 10 ore, con l&#39;obiettivo 20X / 1.0 W. immagini di ingresso per la fusione MultiView e deconvoluzione sono stati giù campionati 2 × per accelerare l&#39;elaborazione delle immagini. 15 iterazioni del deconvoluzione multivista sono stati eseguiti. (G) Il montaggio mostra una parte ritagliata del vista dorsale dai dati deconvolved per evidenziare gli eventi morfogenetici durante lo sviluppo dell&#39;occhio presto dalla vescicola ottica alla fase coppa ottica. I due strati della vescicola ottica, che sono inizialmente simili epiteli colonnare, si differenziano in distinte popolazioni cellulari. Lo strato distale vicino l&#39;epidermide diventa neuroepitelio della retina (RN) e lo strato prossimale vicino al tubo neurale diventa l&#39;epitelio pigmentato retinico (RP). Le cellule del allungato RN e invaginate per formare la coppa ottica (1:40-05:00); Allo stesso tempo le cellule RP appiattiscono. L&#39;ectoderma superficiale è indotto a formare una lente (01:40), whinvaginates ich più tardi (05:00). Il film inizia alle 17 HPF. Il tempo è mostrato in hh: mm. Tutte le membrane cellulari sono etichettati dal β-actina: ras-GFP transgene e tutti i nuclei sono etichettati dal HSP70: H2B-RFP transgene. barra della scala rappresenta 30 micron. FB prosencefalo, lente LE, OP placode olfattiva, RN neuroepitelio retina, RP dell&#39;epitelio pigmentato retinico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/53966fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/53966/53966movie3.jpg" /> Film 3: Optic tazza morfogenesi mostrato con un&#39;unica vista e due metodi di fusione MultiView Il filmato time-lapse illustra il processo completo di ottica morfogenesi tazza dalla vescicola ottica alla fase coppa ottica.. Essa mostra una sola fetta ottica dalla vista laterale (in alto) e una sola fetta ottica dalla vista dorsale (in basso). Le cellule del sviluppo vescicola ottica subiscono riarrangiamenti complessi per formare finalmente la coppa ottica emisferica con neuroepitelio retina interna ed esterna dell&#39;epitelio pigmentato retinico. Una lente è formata da ectoderma superficie. Si invagina insieme al neuroepitelio e si siede in tazza ottica. Tutte le membrane cellulari sono etichettati dalla espressione della β-actina: ras-GFP (green) transgene ed i nuclei sono etichettati con HSP70: H2B-RFP (magenta). Il film inizia a circa 17 HPF. Il set di dati è stata acquisita con illuminazione a doppia faccia da 5 vedute circa 20 gradi l&#39;uno dall&#39;altro e az pile di circa 100 micron sono stati acquisiti ogni 10 minuti con l&#39;obiettivo 20X / 1.0 W. Il tempo è mostrato in hh: mm. Barra della scala rappresenta 50 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53966/Movie3-final.mp4" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

La microscopia a fluorescenza a foglio luminoso è uno strumento eccellente per l'imaging dello sviluppo embrionale. Consente la registrazione di lunghi filmati time-lapse di embrioni vivi in condizioni quasi fisiologiche. Dimostriamo la sua applicazione per l'imaging dello sviluppo dell'occhio di zebrafish su ampie scale spazio-temporali e presentiamo una pipeline per la fusione e la deconvoluzione di set di dati multiview.

Utilizzando tecnica LUCE microscopia a fluorescenza all&#39;Immagine sviluppo Zebrafish Eye

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è quello di visualizzare lo sviluppo oculare dell'embrione di Zebrafish al microscopio a foglio ottico ed elaborare il set di dati multiview acquisiti in Figi tramite il plug-in dell'applicazione di ricostruzione multiview. Questo metodo può aiutarti a comprendere gli eventi morfogenetici nello sviluppo animale. Il vantaggio principale di questo metodo è che è possibile osservare eventi morfogenetici nell'embrione in via di sviluppo con un'alta risoluzione spaziale e temporale.Il principale vantaggio della microscopia a foglio luminoso sono la bassa fototossicità del metodo, i tempi di acquisizione rapidi con cui è possibile visualizzare il campione e che è possibile visualizzare il campione da varie angolazioni, le cosiddette visualizzazioni. L'acquisizione del campione da diverse viste ci permette di superare il degrado del segnale e dell'asse impostato. Queste diverse immagini possono quindi essere utilizzate e registrate utilizzando microsfere fluorescenti attorno al campione.Possiamo ricostruire il volume tridimensionale raggiungendo la risoluzione isotropa. Sebbene dimostriamo l'uso della microscopia a foglio di luce per lo sviluppo degli occhi di Zebrafish, questo metodo può essere utilizzato anche per rispondere a varie domande nella biologia dello sviluppo e nelle neuroscienze utilizzando vari organismi modello. Per iniziare, avvitare l'obiettivo di rilevamento nel microscopio mantenendo coperti gli obiettivi illuminanti.Quindi, stappare gli obiettivi e far scorrere con cautela la camera del campione nel microscopio. Fissare la camera serrando la vite. Quindi, collegare la sonda di temperatura e il blocco Peltier al microscopio.I due tubi che fanno circolare il liquido di raffreddamento per il blocco Peltier sono compatibili con entrambi i connettori e possono funzionare in entrambi gli orientamenti. Quindi, utilizzare una siringa per caricare la camera attraverso la siringa con la soluzione fino al bordo superiore delle finestre della camera e verificare la presenza di perdite. Ora, accendi il microscopio, il computer e l'incubazione.Avviare il software operativo del microscopio e impostare la temperatura di incubazione a 28,5 gradi Celsius. Mentre la temperatura è richiesta per un'ora, preparare il campione. Iniziate con la preparazione dell'agarosio.Sciogliere un'aliquota preparata da un millilitro di agarosio con punto di fusione basso all'1% in E tre mezzo a 70 gradi Celsius. Dopo circa 15 minuti, trasferire 600 microlitri di agarosio fuso in un tubo fresco da 1,5 millilitri e aggiungere 250 microlitri di terreno E tre, 50 microlitri di 0,4% MS 222 e 25 microlitri di soluzione madre di perle fluorescenti a vortice. Posizionare il tubo in un blocco riscaldante a circa 39 gradi Celsius per lasciare che l'agarosio si avvicini al suo punto di gelificazione.Quindi, spingere gli stantuffi con punta in teflon verso il basso fino al fondo dei capillari di vetro di un millimetro di diametro interno. Preparane cinque. Ora, agita brevemente la miscela di agarosio e poi trasferisci cinque embrioni con la minima quantità di liquido.Quindi, inserire un capillare e aspirare prima una testa dell'embrione. La testa deve entrare prima della coda e non ci possono essere bolle d'aria. Aspirare una soluzione sufficiente in modo che ci siano circa due centimetri di agarosio sopra l'embrione e un centimetro di agarosio sotto di esso.Aspirare un embrione in ogni capillare prima di procedere. Questo passaggio richiede un po' di pratica per essere padroneggiato. Preparati utilizzando embrioni non preziosi.Quando l'agarosio si solidifica completamente, conservare i campioni in terreno E tre appoggiando i capillari a una parete del becher con plastilina con l'apertura inferiore in soluzione. Ora assembla il supporto del campione. Per prima cosa, inserisci due manicotti di plastica della giusta misura l'uno contro l'altro nello stelo.Gli spacchi sulle maniche devono essere rivolti verso l'esterno. Quindi, fissare una vite di fissaggio. E inserire il capillare attraverso il supporto fino a quando la banda di colore nero diventa visibile sull'altro lato.Evitare di toccare lo stantuffo. Quindi serrare la vite di fissaggio. Quindi, spingere un centimetro di agarosio fuori dal capillare e tagliarlo.Quindi inserire lo stelo nel disco portacampioni. Prima di caricare il disco campione, verificare che lo stadio si trovi nella posizione più alta nel software di controllo. Quindi, utilizzare le guide per far scorrere il supporto e il campione verso il basso nel microscopio.Ora, immagina l'esempio scelto come descritto nel protocollo di testo. L'elaborazione dei dati avviene in Figi. È una distribuzione di ImageJ.Prima di iniziare, Figi dovrebbe essere aggiornato. Salvare il set di dati dell'immagine acquisita in un'unica cartella. I file intermedi dell'elaborazione delle immagini verranno salvati nella stessa cartella.Ora avvia l'applicazione di ricostruzione multi-vista. Quindi, definisci un nuovo set di dati. Seleziona l'opzione Zeiss Lightsheet Z.1 Dataset LOCI Bioformats e crea un nome per il file di dati di output.Quindi selezionare il primo file CZI del set di dati. I metadati verranno caricati automaticamente. Nei metadati dell'immagine, controlla che il numero degli angoli, i canali, le illuminazioni e la dimensione del voxel siano tutti impostati correttamente.Dopo aver premuto OK, si apre una finestra di registro, la finestra di Esplora impostazioni della vista e una finestra della console. L'esploratore di configurazione delle viste fornisce un'interfaccia facile da usare. Seleziona i file che devono essere elaborati e premi il tasto destro del mouse.Si aprirà una nuova finestra che mostra le diverse fasi di elaborazione man mano che vengono eseguite. Nell'angolo in alto a destra ci sono i pulsanti info e salva. Info visualizza un riepilogo del contenuto del file di dati salvato e premendo Salva si salvano i risultati dell'elaborazione.In caso contrario, il programma non salva i risultati delle fasi di elaborazione. Per salvare nuovamente l'intero set di dati, selezionare innanzitutto tutti i file premendo Ctrl+A e facendo clic con il pulsante destro del mouse. Selezionare quindi Risalva set di dati e Come HDF5.È quindi necessario selezionare una conferma dell'azione di salvataggio. Dopo alcuni minuti, per ogni punto temporale, il programma indicherà quando il nuovo salvataggio è completo. Quindi, procedi con il rilevamento dei punti di interesse nei dati.Seleziona tutti i punti temporali premendo Ctrl+A e fai clic con il pulsante destro del mouse. Per selezionare, rilevare i punti di interesse. Dalle opzioni, selezionare differenza di gaussiana.E seleziona, campiona le immagini prima della segmentazione. Nella finestra successiva, scegli le impostazioni di rilevamento. Dalle opzioni di localizzazione dei subpixel, selezionare l'adattamento quadratico tridimensionale.Quindi, nella specifica del punto di interesse, selezionare interattivo. Per l'opzione XY con campionamento verso il basso, selezionare la risoluzione Z corrispondente. E per il campionamento verso il basso Z, selezionare 1x.Quindi, eseguire l'operazione selezionando l'opzione Java di calcolo sulla CPU. Dalla finestra pop-up, selezionare una vista per testare i parametri. Una volta caricata la vista, regola la luminosità e il contrasto premendo Ctrl+Maiusc+C sulla tastiera.Inoltre, per il rilevamento del tallone, attiva l'opzione cerca il verde massimo. Ora osserva la segmentazione come anelli verdi attorno ai rilevamenti. Regolare i valori di differenza di gaussien per i parametri sigma uno e soglia per segmentare in modo ottimale le perline con il numero minimo di falsi positivi.Ogni cordone deve essere rilevato una sola volta. Dopo aver determinato i parametri ottimali, premere Fine. Dopo che il computer ha caricato, ogni singola vista del punto temporale e segmentato le perline, il programma emette un file di registro con il numero di perline rilevate per visualizzazione.Dovrebbero esserci tra le 600 e le diverse migliaia di perline per vista. In caso contrario, i parametri di rilevamento devono essere modificati. Questo è un processo complicato.La piramide di rilevamento è raramente accurata al primo tentativo e i ripristini possono variare tra i punti temporali di un film. Rilassare il fresco rileverà tutte le vere perle e consentirà più falsi positivi può aiutare. Se nessuna combinazione della piramide funziona, è necessario acquisire un nuovo set di dati utilizzando diverse perle fluorescenti.Procedere ora con la registrazione dei rilevamenti e l'esecuzione di una deconvoluzione multivista dallo stack. LSFM è un metodo ideale per l'imaging dei processi di sviluppo su più scale, dalle strutture intercellulari alle cellule e agli interi tessuti, per lunghi periodi di tempo. Eventi intercellulari molto veloci possono essere catturati ad alta risoluzione, come la crescita di microtubuli nelle cellule neuroprogenitrici.Da un unico filmato, è possibile quantificare la crescita dei microtubuli. Le strutture intracellulari possono essere seguite per molte ore, come il centrosoma all'interno delle cellule gangliari retiniche. Il comportamento di una singola cellula può essere estratto da immagini di interi tessuti, come la posizione trans di una cellula gangliare attraverso la retina.La deconvoluzione multi-vista crea uno stack Z isotropo combinando diverse viste utilizzando la funzione di diffusione dei punti. Ciò fornisce immagini notevolmente migliorate rispetto alle visualizzazioni singole o alle fusioni medie ponderate. Ad esempio, la trasformazione della vescicola ottica in una coppa ottica può essere studiata da fette ottiche in diversi orientamenti attraverso il set di dati mostrato.Inoltre, la buona qualità complessiva dell'immagine, anche all'interno dell'embrione, è evidente. Come quando si osserva la morfogenesi della coppa ottica. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come montare un'immagine di embrioni di pesce zebra in un microscopio a foglio luminoso.E come elaborare set di dati multi view in Figi. Una volta padroneggiato, ci vorranno circa due ore per iniziare un esperimento time lapse su microscopio a foglio luminoso. La successiva analisi dei dati richiederà molto più tempo.Potrebbe essere utile utilizzare un cluster di computer per tale attività. Suggerimenti più pratici, consigli per la risoluzione dei problemi e collegamenti ad altre risorse sono disponibili nel protocollo di testo. Prima dell'esperimento deve essere disponibile una capacità di archiviazione sufficiente e un chiaro piano di elaborazione dei dati.In caso di problemi, domande o richieste future, fare riferimento al sito Web delle rispettive funzionalità o ai problemi di file sui rispettivi repository github.

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