Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in Saccharomyces cerevisiae
18 aprile 2016
L'abbondanza proteica riflette i tassi sia di sintesi proteica che di degradazione proteica. Questo articolo descrive l'uso del chase di cicloesimide seguito da western blotting per analizzare la degradazione delle proteine nell'eucariote unicellulare modello, Saccharomyces cerevisiae (lievito in gemmazione).
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare la degradazione della popolazione allo stato stazionario di una specifica proteina in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo può essere utilizzato per determinare i requisiti genetici e gli effetti ambientali sulla degradazione di una proteina di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non sono necessari isotopi radioattivi e lunghe fasi di immunoprecipitazione, a differenza delle tecniche di inseguimento dell'impulso, che vengono utilizzate anche per visualizzare la degradazione delle proteine.
Questa procedura può essere utilizzata per analizzare sia una proteina di lievito endogena che una proteina espressa da un plasmide. Per quest'ultimo, il ceppo di lievito viene trasformato con un plasmide che codifica per la proteina di interesse seguendo un protocollo standard di trasformazione del lievito. Inoculare il lievito in cinque millilitri di terreno appropriato.
Incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 600 nanometri, o OD600, di ciascuna coltura notturna. Diluire le colture a un OD600 di 0,2 in 15 millilitri di terreno fresco.
Incubare a 30 gradi Celsius agitando fino a quando le cellule raggiungono la fase di crescita logaritmica media. Mentre le cellule di lievito crescono, preparati per la procedura di inseguimento della cicloesimide. Impostare un blocco termico che possa ospitare provette coniche da 15 millilitri a 30 gradi Celsius per l'incubazione delle cellule in presenza di cicloesimide.
Per garantire un'efficiente distribuzione del calore alle colture, aggiungere acqua a ciascun pozzetto del blocco termico in modo tale che un tubo conico da 15 millilitri provochi l'aumento del livello dell'acqua, ma non il trabocco, dal bordo del pozzo. Impostare un secondo blocco termico in grado di ospitare provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri a 95 gradi Celsius per la denaturazione delle proteine dopo la lisi cellulare. Pre-riscaldare il terreno di crescita fresco a 30 gradi Celsius.
Sono necessari 1,1 millilitri di terreno per punto temporale per coltura da analizzare. Aggiungere 50 microlitri di 20x Stop Mix alle provette per microcentrifuga pre-etichettate. Preparare una provetta per ogni punto temporale per coltura da analizzare.
Metti i tubi sul ghiaccio. Quando le cellule di lievito hanno raggiunto la metà della crescita logaritmica, raccogliere 2,5 unità OD600 di ciascuna coltura per punto temporale da analizzare. Un'unità OD600 è uguale alla quantità di lievito presente in un millilitro di coltura con un OD600 di 1,0.
Centrifugare le cellule raccolte in provette coniche da 15 millilitri a 3.000 volte g a temperatura ambiente per due minuti. Rimuovere il surnatante. Risospendere ogni pellet di cella in un millilitro di terreno di crescita fresco a 30 gradi Celsius per 2,5 unità OD600 di cellule.
Prima di iniziare la caccia alla cicloesimide, equilibrare le sospensioni di cellule di lievito incubando nel blocco termico a 30 gradi Celsius per cinque minuti. L'aspetto più difficile di questa procedura è la tempistica dell'aggiunta di cicloesimide e della raccolta delle cellule per ogni campione. Garantiamo il successo stabilendo e aderendo a una tabella di marcia per l'aggiunta di cicloesimide e la raccolta di cellule.
Per iniziare la caccia alla cicloesimide, premere Start"sul timer. Aggiungere rapidamente ma con attenzione la cicloesimide a una concentrazione finale di 250 microgrammi per millilitro alla prima sospensione di cellule di lievito e agitare brevemente per mescolare. Trasferire immediatamente 950 microlitri, o circa 2,4 unità OD600, della sospensione cellulare di lievito con l'aggiunta di cicloesimide in una provetta da microcentrifuga pre-marcata contenente 50 microlitri di Stop Mix ghiacciato 20x.
Agitare la provetta della microcentrifuga e metterla sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti. Iniziare la caccia alla cicloesimide come dimostrato per ciascuna delle restanti sospensioni di cellule di lievito a intervalli di tempo regolari. Ad ogni punto successivo, agitare le sospensioni di cellule di lievito e trasferire 950 microlitri in provette da microcentrifuga etichettate contenenti 50 microlitri di 20x Stop Mix pre-raffreddato.
Vorticare e posizionare le cellule raccolte sul ghiaccio. Per evitare l'assestamento delle cellule di lievito, agitare le sospensioni cellulari nei tubi conici da 15 millilitri circa ogni cinque minuti per tutto il corso dell'inseguimento. Quando tutti i campioni sono stati raccolti, pellettare le celle raccolte mediante centrifugazione a 6, 500 volte g e temperatura ambiente per 30 secondi.
Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio o aspirazione. Le celle sono ora pronte per la lisi alcalina. Preparare le cellule per la lisi alcalina aggiungendo 100 microlitri di acqua distillata a ciascun pellet cellulare e risospendere pipettando su e giù.
Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare a ciascun campione. Mescolare a vortice. Incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti.
In questa fase, le cellule di lievito non sono state lisate e le proteine non sono state rilasciate. Quindi, pellettare le celle mediante centrifugazione a 18.000 volte g a temperatura ambiente per 30 secondi. Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio o aspirazione.
Per lisare le cellule, aggiungere 100 microlitri di tampone per campioni Laemmli a ciascun pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù. Incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare completamente le proteine.
Centrifugare i lisati a 18.000 volte g e a temperatura ambiente per un minuto per pellettare il materiale insolubile. Il surnatante, che è una proteina estratta solubilizzata, è pronto per la separazione mediante SDS PAGE e successiva analisi Western blot. In alternativa, i lisati possono essere conservati a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.
La stabilità di Deg1-Sec62, un substrato modello di degradazione associato al reticolo endoplasmatico del lievito, è stata analizzata con la metodologia di inseguimento della cicloesimide. La proteina Deg1-Sec62 migra su SDS PAGE come specie multiple ed è facilmente degradata in cellule wild-type. Pgk1 è un controllo di carico la cui abbondanza non varia nelle condizioni analizzate.
La perdita dell'ubiquitina ligasi hrd1 residente nell'ER o dell'enzima ubc7 coniugato con ubiquitina ha sostanzialmente stabilizzato la proteina Deg1-Sec62, il che conferma il ruolo precedentemente osservato di queste proteine nella degradazione di Deg1-Sec62. Cue1 è una proteina transmembrana che ancora ubc7 alla membrana dell'ER e attiva l'enzima, ma non è stato studiato direttamente un requisito per cue1 nella degradazione di Deg1-Sec62. L'osservazione di questo studio che Deg1-Sec62 era stabilizzato in assenza di cue1, ha confermato un ruolo di cue1 nella degradazione associata all'ER di Deg1-Sec62.
Il risultato del Western blot è stato quantificato utilizzando un software di imaging. Per confrontare l'abbondanza della proteina Deg1-Sec62 tra i campioni, è stato determinato un rapporto tra le intensità del segnale aggiustate di Deg1-Sec62 e Pgk1 per ciascun campione. È importante ricordare che questa procedura riporta più direttamente la cinetica di degradazione di una popolazione allo stato stazionario di una proteina di interesse.
Per visualizzare la degradazione della popolazione nascente di una proteina di interesse, possono essere utilizzate altre tecniche, come gli esperimenti di inseguimento degli impulsi. Non dimenticare che la cicloesimide e l'azoturo di sodio sono estremamente tossici e devono essere prese precauzioni per evitare il contatto diretto con queste sostanze chimiche durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la degradazione delle proteine in Saccharomyces cerevisiae utilizzando il chase con cicloesimide seguito da immunoblotting. La tecnica consente ai ricercatori di analizzare la degradazione di proteine specifiche senza la necessità di isotopi radioattivi o di passaggi lunghi di immunoprecipitazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Decadimento delle proteine
- Biologia cellulare
- Sistemi modello lieviti
Sfondo
- L'abbondanza proteica è influenzata dai tassi di sintesi e di degradazione.
- Il metodo del chase con cicloesimide è utilizzato per studiare la stabilità delle proteine.
- Il blotting Western è una tecnica per rilevare proteine specifiche.
- Comprendere la degradazione proteica è fondamentale per ottenere informazioni sui processi cellulari.
Scopo dello studio
- Visualizzare la degradazione di una proteina specifica nel lievito.
- Determinare i fattori genetici e ambientali che influenzano la degradazione delle proteine.
- Fornire un'alternativa più semplice alle tecniche tradizionali di pulse-chase.
Metodi Utilizzati
- Uso di cicloesamide per inibire la sintesi proteica.
- Analisi mediante Western blot dei livelli proteici nel tempo.
- Trasformazione di lievito con plasmidi che codificano per proteine di interesse.
- Innesto del lievito in un mezzo di crescita appropriato.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del degrado proteico nel lievito.
- Identificazione dei requisiti genetici per il degrado proteico.
- Valutazione degli effetti ambientali sulla stabilità delle proteine.
- Dimostrazione dell'efficienza del metodo rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo del chase con cicloesimide è efficace per lo studio della degradazione delle proteine.
- Questa tecnica semplifica l'analisi della stabilità proteica nel lievito.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della dinamica proteica nelle cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La cinetica di degradazione delle proteine è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Il metodo del chase con cicloesimide consente una valutazione quantitativa della stabilità proteica in un modello geneticamente modificabile, supportando la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi. Questo approccio fornisce una previsione affidabile per la priorizzazione degli obiettivi e la riduzione del rischio associato a ipotesi meccanicistiche prima dello screening dei composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando i tassi di degradazione delle popolazioni proteiche a stato stazionario.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del target attraverso l'analisi di perturbazioni genetiche e ambientali.
- Valore predittivo: Genera dati quantitativi di cinetica di degradazione per informare decisioni relative alla fiducia nel target e al triage del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Produce output standardizzati e riproducibili del western blot per misurazioni temporali della stabilità proteica.
- Scalabilità: Compatibile con test multiplo-condizione per valutare gli effetti di composti sulle vie di degradazione proteica.
- Utilità della piattaforma: Stabilisce una capacità riutilizzabile per valutare l'interazione con il bersaglio mediante modulazione della degradazione in sistemi a base di lievito.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Utilizza Saccharomyces cerevisiae come sistema rilevante per modellare meccanismi conservati di degradazione.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta a studi preclinici attraverso l'analisi del percorso conservato dell'ubiquitina-proteasoma.
- Avanzamento basato sul rischio: Identifica modificatori genetici e ambientali della degradazione per ridurre i rischi associati ai meccanismi del bersaglio prima della validazione nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di un composto promettente, fornendo dati cinetici sulla degradazione che orientano la selezione del bersaglio e gli studi sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando le variabili di degradazione dagli effetti di sintesi.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi per lo screening di composti stabilendo tassi di degradazione di base in ceppi di lievito ingegnerizzati.
- Analisi: Genera letture quantitative di immunoblotting normalizzate rispetto ai controlli di caricamento per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati sulla degradazione ottenuti nel lievito a sistemi mammiferi attraverso componenti conservati del sistema di degradazione associato al reticolo endoplasmatico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per la riduzione del rischio su target in progetti diversi mediante studi di perturbazione genetica e chimica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica quantificando l'emivita delle proteine e identificando le dipendenze dai percorsi di degradazione.
- Valore operativo: Offre un flusso di lavoro standardizzato e privo di isotopi, compatibile con l'infrastruttura standard per il western blot.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo del bersaglio e agli effetti dei composti modulatori sulla stabilità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla trattabilità della degradazione e sulla conservazione del percorso.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione delle colture di lievito, nelle procedure di sicurezza per il cicloesimide e nella quantificazione dei western blot.
- Presuppone l'accesso a blocchi riscaldanti a 30°C e 95°C, centrifughe e apparecchiature standard per SDS-PAGE e western blotting.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la raccolta dei punti temporali, l'efficienza della lisi e le procedure di normalizzazione del segnale.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono sistemi di espressione basati su plasmidi, marcatura con epitopi e compatibilità con librerie di lieviti knock-out.
- I limiti pratici comprendono la tossicità del cicloesimide, possibili effetti fuori bersaglio sulla traduzione e la necessità di una rivelazione entro il range lineare nei western blot.
