Name: Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Scopri l'analisi chase con cicloesimide per studiare la degradazione proteica in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo semplifica la valutazione della stabilità proteica senza isotopi radioattivi.

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Gli autori ringraziano i membri attuali ed ex del laboratorio Rubenstein per aver fornito un ambiente di ricerca favorevole ed entusiasta. Gli autori ringraziano Mark Hochstrasser (Yale University) per la condivisione di reagenti e competenze. E.M.R. ringrazia Stefan Kreft (Università di Costanza) e Jennifer Bruns (Università di Pittsburgh) per aver condiviso la loro inestimabile esperienza nell'analisi cinetica delle proteine. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del National Institutes of Health (R15 GM111713) a E.M.R., un premio per la ricerca ASPiRE della Ball State University a E.M.R., un premio per la ricerca dal capitolo della Ball State University di Sigma Xi a S.M.E. e fondi dall'Ufficio del Rettore e dal Dipartimento di Biologia della Ball State University.

1. La crescita e Harvest delle cellule di lievito <ol><li> Se non analizzando la cinetica di degradazione di una proteina endogena lievito, trasformare ceppo di lievito desiderato (s) con un plasmide codificante la proteina di interesse. Metodi affidabili per il lievito di trasformazione sono stati precedentemente descritti 37. </li><li> Seminare lievito in 5 ml di terreno appropriato (ad esempio, definito (SD) mezzo sintetico selettivo per manutenzione plasmide di cellule trasformate o) medium lievito non selettivo extract-peptone-destrosio (YPD per le cellule non trasformate). Incubare per una notte a 30 ° C, rotante. NOTA: 30 ° C è la temperatura di crescita ottimale per tipica wild-type ceppi di laboratorio di lievito 38. Tuttavia, poiché alcuni ceppi di lievito mutanti non crescono in modo ottimale a 30 ° C e alcune proteine ​​subiscono degradazione dipendente dalla temperatura, le temperature utilizzate per la crescita cellulare del lievito e cicloesimide chase dovrebbero essere determinati empiricamente 39. </li><li> misurare °densità ottica e a 600 nm (OD 600) di ogni cultura durante la notte. NOTA: Le cellule possono essere in fase di crescita logaritmica o stazionaria ma avrebbe minimamente raggiunto una densità che permetterà di diluizione ad una OD 600 = 0.2 in 15 ml di mezzo fresco. </li><li> Diluire le culture durante la notte per un valore di 600 OD di 0,2 a 15 ml di terreno fresco. </li><li> Incubare lievito a 30 ° C, agitando fino a quando le cellule raggiungono fase di crescita medio logaritmica (cioè, un OD 600 tra 0,8 e 1,2). </li><li> Durante la crescita delle cellule di lievito, eseguire le seguenti in preparazione per la procedura cicloesimide chase: <ol><li> Impostare un blocco di calore che può ospitare 15 ml provette coniche da 30 ° C per l&#39;incubazione delle cellule in presenza di cicloesimide. Aggiungere l&#39;acqua ai pozzi del blocco di calore per consentire la distribuzione di calore efficiente alle culture. Aggiungere acqua a ciascun pozzetto tale che un tubo da 15 ml causerà il livello dell&#39;acqua a salire a, ma non troppo pieno, il bordo del pozzo. </li><li> Impostare un secondo blocco di calore che può ospitare provette da 1,5 ml microcentrifuga a 95 ° C per la denaturazione proteica seguenti lisi cellulare. </li><li> medio Pre-caldo crescita fresco (1,1 ml per punto di tempo per la cultura per essere analizzati) a 30 ° C. </li><li> Aggiungere 50 ml 20x stop Mix di pre-etichettati microprovette (un tubo per volta punto per ogni cultura deve essere analizzato). Mettere i tubi in ghiaccio. ATTENZIONE: sodio azide, un ingrediente in 20x arresto Mix, è tossico tramite ingestione o contatto dermico. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e sodio azide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore. </li></ol></li><li> Quando le cellule hanno raggiunto una crescita mid-logaritmica, raccogliere 2,5 OD 600 unità di ogni cultura per ogni punto di tempo per essere analizzato (ad esempio, 7,5 OD 600 unità per analizzare l&#39;abbondanza di proteine ​​a tre punti di tempo). Centrifuga raccolte le cellule in 15 ml provette coniche a 3,000 xg a temperatura ambiente per 2 min. NOTA: Un OD 600 unità è uguale alla quantità di lievito presente in 1 coltura ml ad una OD 600 di 1,0. Il volume di coltura (in ml) necessario per raccogliere X OD 600 unità (V) può essere determinato utilizzando la seguente equazione: V = X OD 600 unità / OD 600 misurato. Ad esempio, per raccogliere 7,5 OD 600 unità di coltura cellulare di lievito ad una OD 600 di 1,0, raccogliere 7,5 OD 600 unità / 1,0 = 7,5 ml coltura di lievito. </li><li> Risospendere ogni pellet di cellule in 1 ml di 30 ° C (pre-riscaldato) mezzo di crescita fresco per 2,5 OD 600 unità di cellule (ad esempio, 3 ml per 7,5 OD 600 unità). </li></ol> 2. Cycloheximide Chase <ol><li> Equilibrare sospensioni cellulari di lievito mediante incubazione per 5 minuti nel blocco C di calore 30 °. </li><li> Preparare un timer a contare da 0:00. </li><li> Per iniziare l&#39;inseguimento cicloesimide, premere il tasto &quot;Start&quot; sul timer. rapidamente,ma attenzione, effettuare le seguenti operazioni: <ol><li> Aggiungere cicloesimide ad una concentrazione finale di 250 mg / ml di sospensione cellulare prima di lievito (ad esempio, aggiungere 37,5 ml di 20 mg / ml di cicloeximide a 3 ml di sospensione cellulare), e vortex brevemente per miscelare. ATTENZIONE: Cicloeximide è un irritante cutaneo ed è tossico tramite l&#39;ingestione orale. Seguire le indicazioni del produttore durante la preparazione, lo stoccaggio, la movimentazione e cicloesimide. In caso di esposizione accidentale, consultare Scheda di sicurezza fornito dal produttore. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;aggiunta di cicloesimide e vortex, trasferire 950 ul (~ 2,4 OD 600 unità) della sospensione di cellule di lievito con cicloesimide aggiunto ad una provetta di pre-etichettati contenente 50 ml mix 20x fermata ghiacciata. Agitare la provetta, e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti. </li><li> Riportare la sospensione cellulare di lievito a 30 ° C. </li></ol></li><li> Ripetere passaggi 2.3.1 attraverso 2.3.3 Per ciascuno dei restanti sospensioni cellulari di lievito a intervalli di tempo regolari (ad esempio, ogni 30 secondi, in modo tale che viene aggiunto al campione cycloheximide 1 # alle 0:00, Esempio # 2 alle 0:30, Esempio # 3 a 1:00 , ecc.). </li><li> Ad ogni punto di tempo successivo, le sospensioni vortice di cellule di lievito e il trasferimento di 950 ml per provette da microcentrifuga etichettati contenenti 50 ml di pre-raffreddata 20x stop Mix. Vortex e cellule di posizione raccolti su ghiaccio. Rientro 15 ml provette coniche a 30 ° C blocco di calore. <ol><li> Ad esempio, per la raccolta di cellule 30 min dopo l&#39;aggiunta cicloesimide (supponendo 30-sec intervalli tra oltre cicloesimide per sospensioni di cellule di lievito all&#39;inizio del corso tempo), vortex e rimuovere 950 ml di sospensione cellulare da Esempio # 1 a 30:00 . Ripetere per esempio # 2 a 30:30, e così via. NOTA: per impedire sedimentazione di lievito, sospensioni cellulari vortice in 15 ml provette coniche circa ogni 5 min durante tutto il corso della caccia. In alternativa, la sospensione cellula di lievitos può essere mantenuta in un bagno di acqua di continuo agitazione per tutta la durata dell&#39;esperimento cicloesimide caccia. </li></ol></li><li> Quando tutti i campioni sono stati raccolti, pellet raccolte le cellule per centrifugazione a 6.500 xg a temperatura ambiente per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. Le cellule sono ora pronti per lisi alcalina. In alternativa, le cellule pellet in azoto liquido e conservare freeze scatto a -80 ° C. </li></ol> 3. Post-alcalina Protein Extraction (Modificata da 16,40) <ol><li> Aggiungere 100 ml di acqua distillata a ciascun pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex. </li><li> Aggiungere 100 pl di 0,2 M NaOH per ogni campione. Mescolare pipettando su e giù o vortex. </li><li> Incubare le cellule in sospensione a temperatura ambiente per 5 min. In questa fase, le cellule di lievito non sono state lisate, e proteine ​​non sono stati rilasciati 40. </li><li> Cellule pellet per centrifugazione a 18.000 xg a carattere localeature per 30 sec. Rimuovere il surnatante pipettando o aspirazione. </li><li> Per lisare cellule, aggiungere 100 ml di tampone campione Laemmli a ciascuna pellet cellulare. Risospendere pipettando su e giù o vortex. NOTA: l&#39;incubazione sequenziale delle cellule con il tampone rilascia NaOH e Laemmli proteine ​​in una forma compatibile con dodecil solfato di sodio-SDS-PAGE (SDS-PAGE) utilizzando un sistema tampone di corsa Tris-glicina. </li><li> Incubare a 95 ° C per 5 minuti per denaturare le proteine ​​completamente. NOTA: incubazione a 95 ° C può non essere adatto per l&#39;analisi di proteine ​​che sono inclini a aggregazione (ad esempio, proteine ​​con diversi segmenti transmembrana). Queste proteine ​​possono diventare insolubile quando incubate a temperature elevate 41. Così, per l&#39;analisi di tali proteine, lisati devono essere incubate a temperature più basse (ad esempio, 37 ° C - 70 ° C) per 10 - 30 minuti, come determinato empiricamente. </li><li> lisati centrifugare a 18.000 xga rotemperatura om per 1 min per far sedimentare il materiale insolubile. Il supernatante (proteina estratta solubilizzati) è pronto per separazione mediante SDS-PAGE e successiva analisi western blot. In alternativa, conservare lisati a -20 ° C. </li></ol> 4. Rappresentante SDS-PAGE e Western Blotting procedura (Adattato da 16) <ol><li> Carico proteine ​​standard di peso molecolare e determinato empiricamente volume di lisati su un gel SDS-PAGE. NOTA: Scegliere la percentuale di acrilamide e bis-acrilammide nel gel SDS-PAGE in base al peso molecolare della proteina di interesse. In generale, più bassi gel percentuali sono più adatti per risolvere superiori proteine ​​peso molecolare. </li><li> Eseguire gel a 200 V fino a quando il fronte del colorante ha raggiunto il bordo inferiore del gel. </li><li> Trasferire proteine ​​dal gel di fluoruro di polivinilidene membrana (PVDF) mediante trasferimento bagnato a 20 V 60 - 90 min a 4 ° C. </li><li> Bloccare membrana incubando in Tris-Buffered Saline (TBS) contenente 5% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora o a 4 ° C durante la notte. NOTA: per evitare la crescita microbica in presenza di una membrana incubate durante la notte, si raccomanda di includere azide di sodio nella soluzione di blocco ad una concentrazione finale di 0,02%. </li><li> Incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse in TBS con 0.1% Tween-20 (TBS / T) e 1% di latte scremato, dondolo, a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. NOTA: Fluorofori sono sensibili alla luce. Pertanto, diluizioni di anticorpi coniugati a fluorofori devono essere preparati al buio, e l&#39;incubazione delle membrane in presenza di anticorpi coniugati a fluorofori e successive fasi di lavaggio dovrebbe avvenire a tenuta di luce (ad esempio, un foglio-avvolto) containers. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> membrana delle immagini con LI-COR Odyssey CLx e software Immagine Studio (o apparecchiature di imaging comparabili e software), seguendo le raccomandazioni del produttore. </li><li> Dopo immagine membrana acquisizione, incubare la membrana con un anticorpo primario specifico per una proteina di controllo di carico in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Incubare a membrana con appropriata anticorpo secondario fluoroforo coniugato in TBS / T con 1% di latte scremato a temperatura ambiente per 1 ora, a dondolo. </li><li> Lavare membrana a temperatura ambiente 3 x 5 minuti con TBS / T, a dondolo. </li><li> Immagine membrana come al punto 4.9. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo documento, un metodo per analizzare la cinetica di degradazione delle proteine ​​è presentato. Questa tecnica può essere facilmente applicata ad una gamma di proteine ​​degradate da una varietà di meccanismi. È importante notare che gli esperimenti cicloesimide chase riferire sulla cinetica di degradazione del pool stato stazionario di una data proteina. Altre tecniche possono essere utilizzate per analizzare la cinetica di degradazione di specifiche popolazioni di proteine. Ad esempio, il destino di degradazi...

Le proteine ​​svolgono funzioni cruciali praticamente in ogni processo cellulare. Molti processi fisiologici richiedono la presenza di una specifica proteina (o proteine) per un determinato periodo di tempo o in particolari circostanze. Organismi quindi controllare e regolare l&#39;abbondanza di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari 1. Ad esempio, cicline (proteine ​​che controllano la divisione cellulare) sono presenti in specifiche fasi del ciclo cellulare, e la perdita di livelli di ciclina regolamentati è stata associata con la formazione di tumore maligno 2. Oltre a regolare i livelli di proteine ​​per soddisfare le esigenze cellulari, le cellule utilizzano meccanismi di controllo della qualità degradativi di eliminare mal ripiegate, non montati, o in altro modo aberranti molecole proteiche 3. Controllo di abbondanza di proteine ​​comporta regolazione sia la sintesi macromolecolari (trascrizione e traduzione) e la degradazione (RNA decadimento e proteolisi). degradazione delle proteine ​​deteriorate o eccessivo contribuisce a molteplici patologie, Tra cui il cancro, fibrosi cistica, malattie neurodegenerative, disturbi cardiovascolari e 4-8. Meccanismi proteolitici rappresentano quindi bersagli terapeutici promettenti per una serie di malattie 9-12. L&#39;analisi delle proteine ​​in un unico punto di tempo (ad esempio, da Western Blot 13, citometria a flusso 14, o microscopia a fluorescenza 15) fornisce un&#39;istantanea di costante abbondanza di proteine ​​stato senza rivelare i relativi contributi di sintesi o degradazione. Allo stesso modo, le analisi giornalista di crescita a base riflettono costanti i livelli di proteina stato più di un periodo di tempo prolungato senza discriminazioni tra le influenze di sintesi e degradazione 15-20. È possibile dedurre il contributo dei processi degradativi a livelli proteici stato stazionario confrontando abbondanza prima e dopo inibendo componenti specifici del meccanismo degradativa (ad esempio, dal farmacologicamente inattivando la proteasome 21 o buttare giù un gene ipotizzato per essere necessari per la degradazione 13). Un cambiamento nei livelli di proteina regime permanente dopo inibendo percorsi degradativi fornisce una forte evidenza per il contributo della proteolisi per il controllo delle proteine ​​dell&#39;abbondanza 13. Tuttavia, una tale analisi ancora non fornisce informazioni per quanto riguarda la cinetica del turnover proteico. Chase Cycloheximide seguita da western blotting supera queste debolezze, consentendo ai ricercatori di visualizzare la degradazione delle proteine ​​nel tempo 22-24. Inoltre, poiché la rilevazione delle proteine ​​seguente cycloheximide Chase è in genere eseguita da western blotting, isotopi radioattivi e passaggi immunoprecipitazione lunghi non sono necessari per cycloheximide caccia, a differenza di molte tecniche di inseguimento di impulso comunemente utilizzate, che sono anche eseguite per visualizzare la degradazione delle proteine ​​25. Cycloheximide è stato identificato come un composto anti-fungine correttalegami prodotte dai Streptomyces batterio gram-positivo griseus 26,27. Si tratta di una molecola cellula-permeabile che inibisce specificamente citosolico eucariote (ma non organelli) Traduzione alterando ribosomiale traslocazione 28-31. In un esperimento cicloesimide chase, cycloheximide viene aggiunta alle cellule, e aliquote di cellule vengono raccolti immediatamente e in punti temporali specifici seguenti aggiunta del composto 22. Le cellule sono lisate, e l&#39;abbondanza di proteine ​​in ogni punto viene analizzato, in genere western blot. Diminuisce in abbondanza di proteine ​​dopo l&#39;aggiunta di cycloheximide può essere tranquillamente attribuita alla degradazione delle proteine. Una proteina instabile diminuirà in abbondanza nel tempo, mentre una proteina relativamente stabile esporrà piccolo cambiamento in abbondanza. Meccanismi di degradazione delle proteine ​​selettivo sono state altamente conservata in tutta Eukarya. Molto di ciò che si conosce la degradazione delle proteine ​​primo è stato appreso inil modello eucariote unicellulare, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito) 25,32-36. Studi con il lievito sono suscettibili di continuare a fornire spunti nuovi ed importanti nella degradazione delle proteine. Un metodo per cicloesimide inseguimento in cellule di lievito seguita da Western blot di abbondanza di proteine ​​è presentato qui.

<table><tbody><tr><td>Ceppi di lievito desiderati, plasmidi, terreni standard e componenti</td><td></td><td></td><td></td>tampone</tr><tr><td>Tubi monouso in vetro borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Incubatore a temperatura regolata (ad es. Incubatore Heratherm Modello IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Tamburo intercambiabile New Brunswick per provette da 18 mm (rullo tubolare)</td>Si consiglia di utilizzare un rullo portaprovette <td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>per mantenere in sospensione colture starter di cellule di lievito durante la notte. In alternativa, se non è disponibile un rullo tubolare, è possibile utilizzare un agitatore a piattaforma in un'incubatrice a temperatura controllata per le colture starter notturne. Un agitatore a piattaforma o un rullo tubolare possono essere utilizzati per mantenere colture più grandi in sospensione.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Tamburo a rulli 120 V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>Per l'uso con il rullo a tubo</td></tr><tr><td>Spettrofotometro SmartSpec Plus</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Centrifuga 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216&nbsp;</td><td>Il rotore venduto con l'unità contiene provette per microcentrifuga da 1,5 e 2,0 ml. Il rotore può essere sostituito con uno che contiene provette coniche da 15 e 50 ml</td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso F-35-6-30 con coperchio e adattatori per centrifuga modello 5430/R, provette coniche da 15/50 ml, 6 posti</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td>Tubo</tr> con <tr><td>tappo a vite serigrafato da 15 ml 17 x 20 mm, polipropilene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Disponibile da una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Tubo flessibile da 1,5 ml, Provette per microcentrifuga naturali e pulite per PCR</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Disponibile presso una varietà di produttori</td></tr><tr><td>Riscaldatori analogici per Dri-Bath Fisher</td><td>Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Si raccomanda di avere a disposizione due riscaldatori (uno per l'incubazione delle cellule durante il trattamento con cicloesimide e uno per l'ebollizione dei lisati per denaturare le proteine). In alternativa, 30 &deg; Il bagnomaria C può essere utilizzato per l'incubazione di cellule in presenza di cicloesimide. Il bagno d'acqua bollente con piastra calda può essere utilizzato alternativamente per denaturare le proteine.</td></tr><tr><td>Blocco riscaldante per 12 provette coniche da 15 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-473-70</td><td>Da utilizzare con il riscaldatore per bagno driico durante l'incubazione di cellule in presenza di cicloesimide.</td></tr><tr><td>Blocco riscaldante per 20 provette coniche da 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-9Q</td><td>Da utilizzare con il riscaldatore Dri-Bath per bollire i lisati per la denaturazione delle proteine.</td></tr><tr><td>SDS-PAGE apparecchiature di esecuzione e trasferimento, alimentatori e apparecchiature di imaging o camere oscure per SDS-PAGE e trasferimento su membrana</td><td></td><td></td><td>Varierà in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Sistema di imaging Western blot (ad es. Li-Cor Odyssey CLx scanner e Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Varierà in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Membrane di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Anticorpi primari (ad es. Fosfoglicerato chinasi (Pgk1) Anticorpo monoclonale, topo (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr><tr><td>Anticorpi secondari (ad es Alexa-Fluor 680 IgG anti-topo di coniglio (H + L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Varia in base al laboratorio e all'applicazione</td></tr></tbody></table>

cicloesimide analisi chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regolamento di abbondanza di proteine ​​è fondamentale per praticamente ogni processo cellulare. Proteina abbondanza riflette l&#39;integrazione delle aliquote di sintesi proteica e la degradazione delle proteine. Molti saggi di relazioni su abbondanza di proteine ​​(per esempio, in tempo unico punto western blotting, citometria a flusso, microscopia a fluorescenza, o saggi di crescita giornalista-based) non consentono la discriminazione degli effetti relativi di traduzione e proteolisi sui livelli di proteine. Questo articolo descrive l&#39;uso di cycloheximide caccia seguita da Western blotting per analizzare specificamente degradazione delle proteine ​​nel modello eucarioti unicellulari, Saccharomyces cerevisiae (in erba lievito). In questo procedimento, cellule di lievito vengono incubate in presenza di cicloesimide inibitore traduzionale. Aliquote di cellule vengono raccolte subito dopo e in punti temporali specifici seguenti aggiunta di cicloesimide. Le cellule sono lisate, e lisati sono separati da gel di poliacrilammide for analisi Western Blot di abbondanza di proteine ​​in ogni punto. La procedura cicloeximide chase permette la visualizzazione della cinetica di degradazione della popolazione stato stazionario di una varietà di proteine ​​cellulari. La procedura può essere utilizzata per studiare i requisiti genetici per e influenze ambientali sulla degradazione delle proteine.

Per illustrare la metodologia caccia cicloesimide, la stabilità del Deg1 -Sec62 (figura 1), un substrato modello di lievito reticolo endoplasmatico (ER) di degradazione associata (ERAD), è stato analizzato 42-44. In ERAD, il controllo di qualità enzimi ubiquitina ligasi covalente attribuiscono catene del piccolo ubiquitina proteine ​​di proteine ​​aberranti localizzate alla membrana ER. Tali proteine ​​polyubiquitylated vengono successivamente rimossi...

L'abbondanza proteica riflette i tassi sia di sintesi proteica che di degradazione proteica. Questo articolo descrive l'uso del chase di cicloesimide seguito da western blotting per analizzare la degradazione delle proteine nell'eucariote unicellulare modello, Saccharomyces cerevisiae (lievito in gemmazione).

Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine ​​in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il degrado della popolazione allo stato stazionario di una proteina specifica in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo può essere utilizzato per determinare i requisiti genetici e gli effetti ambientali sul degrado di una proteina d'interesse. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede isotopi radioattivi né passaggi lunghi di immunoprecipitazione, a differenza delle tecniche di tipo pulse-chase, che vengono anch'esse impiegate per visualizzare il degrado proteico.Questa procedura può essere utilizzata per analizzare sia una proteina endogena del lievito sia una proteina espressa da un plasmide. Nel secondo caso, il ceppo di lievito viene trasformato con un plasmide che codifica per la proteina di interesse seguendo un protocollo standard di trasformazione del lievito. Inoculare il lievito in cinque millilitri di mezzo appropriato.Incubare per tutta la notte a 30 gradi Celsius con rotazione. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 600 nanometri, o OD600, di ciascuna coltura notturna. Diluire le colture fino a un OD600 di 0,2 in 15 millilitri di mezzo fresco.Incubare a 30 gradi Celsius con agitazione fino a quando le cellule non raggiungono la fase di crescita logaritmica media. Mentre le cellule di lievito crescono, prepararsi per la procedura di chase con cicloesamide. Impostare un blocco riscaldante in grado di contenere provette coniche da 15 millilitri a 30 gradi Celsius per l'incubazione delle cellule in presenza di cicloesamide.Per garantire una distribuzione efficiente del calore alle colture, aggiungere acqua in ciascun pozzetto del blocco riscaldante in modo che il livello dell'acqua raggiunga il bordo del pozzetto senza traboccare quando vi si inserisce una provetta conica da 15 millilitri. Impostare un secondo blocco riscaldante, adatto a provette microcentrifuga da 1,5 millilitro, a 95 gradi Celsius per la denaturazione delle proteine successiva alla lisi cellulare. Riscaldare preventivamente il mezzo di crescita fresco a 30 gradi Celsius.Sono necessari 1,1 millilitri di mezzo per ogni punto temporale per ogni coltura da sottoporre a saggio. Aggiungere 50 microlitri di Stop Mix 20x in provette microcentrifuga pre-etichettate. Preparare una provetta per ogni punto temporale per ogni coltura da sottoporre a saggio.Mettere i tubi sul ghiaccio. Quando le cellule di lievito hanno raggiunto una crescita in fase esponenziale media, raccogliere 2,5 unità di OD600 per ogni punto temporale da analizzare. Un'unità di OD600 corrisponde alla quantità di lievito presente in un millilitro di coltura con un OD600 di 1,0.Centrifugare le cellule raccolte in provette coniche da 15 millilitri a 3.000 ×g a temperatura ambiente per due minuti. Rimuovere il soprannatante. Ri-sospendere ogni pellet cellulare in un millilitro di mezzo di crescita fresco a 30 gradi Celsius per ogni 2,5 unità di OD600 di cellule.Prima di iniziare il chase con cicloesimide, equilibrare le sospensioni di cellule di lievito incubandole nel blocco riscaldante a 30 gradi Celsius per cinque minuti. L'aspetto più complesso di questa procedura è la tempistica dell'aggiunta della cicloesimide e del prelievo delle cellule per ogni campione. Per garantire il successo, è fondamentale stabilire e seguire un programma temporale rigoroso per l'aggiunta della cicloesimide e il prelievo delle cellule.Per iniziare il chase con cicloesimide, premere "Start" sul timer. Aggiungere rapidamente ma con attenzione la cicloesimide a una concentrazione finale di 250 microgrammi per millilitro alla prima sospensione cellulare di lievito e vortexare brevemente per omogeneizzare. Trasferire immediatamente 950 microlitri, ovvero circa 2,4 unità di OD600, della sospensione cellulare di lievito contenente la cicloesimide in un tubo da microcentrifuga pre-etichettato contenente 50 microlitri di Stop Mix 20x freddo di ghiaccio.Vortexare il tubo da microcentrifuga e posizionarlo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti. Iniziare la chase con cicloesimide come illustrato per ciascuna delle sospensioni cellulari di lievito rimanenti a intervalli di tempo regolari. In ogni successivo punto temporale, vortexare le sospensioni cellulari di lievito e trasferire 950 microlitri in tubi da microcentrifuga etichettati contenenti 50 microlitri di Stop Mix 20x pre-raffreddato.Agitare con il vortex e mettere le cellule raccolte sul ghiaccio. Per evitare l'aggregazione delle cellule di lievito, agitare con il vortex le sospensioni cellulari nei tubi conici da 15 millilitri all'incirca ogni cinque minuti durante l'intero periodo di chase. Una volta raccolti tutti i campioni, formare un pellet delle cellule raccolte mediante centrifugazione a 6.500 ×g e a temperatura ambiente per 30 secondi.Rimuovere il soprannatante mediante pipettaggio o aspirazione. Le cellule sono ora pronte per la lisi alcalina. Preparare le cellule per la lisi alcalina aggiungendo 100 microlitri di acqua distillata a ogni pellet cellulare e risospendendo mediante pipettaggio su e giù.Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare a ciascun campione. Mescolare mediante vortex. Incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti.A questo stadio, le cellule di lievito non sono state lisate e le proteine non sono state rilasciate. Successivamente, pellettizzare le cellule mediante centrifugazione a 18.000 ×g a temperatura ambiente per 30 secondi. Rimuovere il surnatante per mezzo di pipettaggio o aspirazione.Per lisare le cellule, aggiungere 100 microlitri di tampone campione Laemmli a ogni pellet cellulare. Ri-sospendere aspirando e dispensando ripetutamente con una pipetta. Incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare completamente le proteine.Centrifugare i lisati a 18.000 ×g e a temperatura ambiente per un minuto per formare il pellet del materiale insolubile. Il surnatante, che contiene le proteine estratte e solubilizzate, è pronto per la separazione mediante elettroforesi SDS-PAGE e successiva analisi mediante Western blot. In alternativa, i lisati possono essere conservati a -20 gradi Celsius.La stabilità di Deg1-Sec62, un substrato modello di degradazione associata al reticolo endoplasmatico nel lievito, è stata analizzata mediante la metodica del chase con cicloesimide. La proteina Deg1-Sec62 migra in SDS-PAGE come molteplici forme e viene rapidamente degradata nelle cellule di tipo selvaggio. Pgk1 è un controllo di caricamento la cui abbondanza non varia nelle condizioni saggiate.La perdita del ligasi dell'ubiquitina residente nel RE hrd1 o dell'enzima di coniugazione dell'ubiquitina ubc7 ha stabilizzato in modo significativo la proteina Deg1-Sec62, confermando il ruolo precedentemente osservato di queste proteine nella degradazione di Deg1-Sec62. Cue1 è una proteina transmembrana che ancoraggio ubc7 alla membrana del RE e attiva l'enzima, ma un ruolo di cue1 nella degradazione di Deg1-Sec62 non era stato direttamente indagato. L'osservazione di questo studio secondo cui Deg1-Sec62 risultava stabilizzata in assenza di cue1 ha confermato un ruolo per cue1 nella degradazione associata al RE di Deg1-Sec62.Il risultato ottenuto dal Western blot è stato quantificato utilizzando un software di analisi delle immagini. Per confrontare l'abbondanza della proteina Deg1-Sec62 tra i diversi campioni, è stato determinato per ciascun campione il rapporto tra le intensità del segnale corretto di Deg1-Sec62 e quelle di Pgk1. È importante ricordare che questa procedura fornisce informazioni in modo più diretto sulla cinetica di degradazione di una popolazione stazionaria di una proteina di interesse.Per visualizzare il degrado della popolazione nascente di una proteina di interesse, possono essere utilizzate altre tecniche, come gli esperimenti di tipo pulse-chase. Non dimenticare che cicloesimide e azide di sodio sono estremamente tossici e si devono prendere precauzioni per evitare il contatto diretto con queste sostanze chimiche durante l'esecuzione di questa procedura.

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