Cicloesimide Analisi Chase di degradazione delle proteine in
18 aprile 2016
L'abbondanza proteica riflette i tassi sia di sintesi proteica che di degradazione proteica. Questo articolo descrive l'uso del chase di cicloesimide seguito da western blotting per analizzare la degradazione delle proteine nell'eucariote unicellulare modello, Saccharomyces cerevisiae (lievito in gemmazione).
L'obiettivo generale di questa procedura è visualizzare il degrado della popolazione allo stato stazionario di una proteina specifica in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo può essere utilizzato per determinare i requisiti genetici e gli effetti ambientali sul degrado di una proteina d'interesse. Il principale vantaggio di questa tecnica è che non richiede isotopi radioattivi né passaggi lunghi di immunoprecipitazione, a differenza delle tecniche di tipo pulse-chase, che vengono anch'esse impiegate per visualizzare il degrado proteico.
Questa procedura può essere utilizzata per analizzare sia una proteina endogena del lievito sia una proteina espressa da un plasmide. Nel secondo caso, il ceppo di lievito viene trasformato con un plasmide che codifica per la proteina di interesse seguendo un protocollo standard di trasformazione del lievito. Inoculare il lievito in cinque millilitri di mezzo appropriato.
Incubare per tutta la notte a 30 gradi Celsius con rotazione. La mattina seguente, misurare la densità ottica a 600 nanometri, o OD600, di ciascuna coltura notturna. Diluire le colture fino a un OD600 di 0,2 in 15 millilitri di mezzo fresco.
Incubare a 30 gradi Celsius con agitazione fino a quando le cellule non raggiungono la fase di crescita logaritmica media. Mentre le cellule di lievito crescono, prepararsi per la procedura di chase con cicloesamide. Impostare un blocco riscaldante in grado di contenere provette coniche da 15 millilitri a 30 gradi Celsius per l'incubazione delle cellule in presenza di cicloesamide.
Per garantire una distribuzione efficiente del calore alle colture, aggiungere acqua in ciascun pozzetto del blocco riscaldante in modo che il livello dell'acqua raggiunga il bordo del pozzetto senza traboccare quando vi si inserisce una provetta conica da 15 millilitri. Impostare un secondo blocco riscaldante, adatto a provette microcentrifuga da 1,5 millilitro, a 95 gradi Celsius per la denaturazione delle proteine successiva alla lisi cellulare. Riscaldare preventivamente il mezzo di crescita fresco a 30 gradi Celsius.
Sono necessari 1,1 millilitri di mezzo per ogni punto temporale per ogni coltura da sottoporre a saggio. Aggiungere 50 microlitri di Stop Mix 20x in provette microcentrifuga pre-etichettate. Preparare una provetta per ogni punto temporale per ogni coltura da sottoporre a saggio.
Mettere i tubi sul ghiaccio. Quando le cellule di lievito hanno raggiunto una crescita in fase esponenziale media, raccogliere 2,5 unità di OD600 per ogni punto temporale da analizzare. Un'unità di OD600 corrisponde alla quantità di lievito presente in un millilitro di coltura con un OD600 di 1,0.
Centrifugare le cellule raccolte in provette coniche da 15 millilitri a 3.000 ×g a temperatura ambiente per due minuti. Rimuovere il soprannatante. Ri-sospendere ogni pellet cellulare in un millilitro di mezzo di crescita fresco a 30 gradi Celsius per ogni 2,5 unità di OD600 di cellule.
Prima di iniziare il chase con cicloesimide, equilibrare le sospensioni di cellule di lievito incubandole nel blocco riscaldante a 30 gradi Celsius per cinque minuti. L'aspetto più complesso di questa procedura è la tempistica dell'aggiunta della cicloesimide e del prelievo delle cellule per ogni campione. Per garantire il successo, è fondamentale stabilire e seguire un programma temporale rigoroso per l'aggiunta della cicloesimide e il prelievo delle cellule.
Per iniziare il chase con cicloesimide, premere "Start" sul timer. Aggiungere rapidamente ma con attenzione la cicloesimide a una concentrazione finale di 250 microgrammi per millilitro alla prima sospensione cellulare di lievito e vortexare brevemente per omogeneizzare. Trasferire immediatamente 950 microlitri, ovvero circa 2,4 unità di OD600, della sospensione cellulare di lievito contenente la cicloesimide in un tubo da microcentrifuga pre-etichettato contenente 50 microlitri di Stop Mix 20x freddo di ghiaccio.
Vortexare il tubo da microcentrifuga e posizionarlo sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni sono stati raccolti. Iniziare la chase con cicloesimide come illustrato per ciascuna delle sospensioni cellulari di lievito rimanenti a intervalli di tempo regolari. In ogni successivo punto temporale, vortexare le sospensioni cellulari di lievito e trasferire 950 microlitri in tubi da microcentrifuga etichettati contenenti 50 microlitri di Stop Mix 20x pre-raffreddato.
Agitare con il vortex e mettere le cellule raccolte sul ghiaccio. Per evitare l'aggregazione delle cellule di lievito, agitare con il vortex le sospensioni cellulari nei tubi conici da 15 millilitri all'incirca ogni cinque minuti durante l'intero periodo di chase. Una volta raccolti tutti i campioni, formare un pellet delle cellule raccolte mediante centrifugazione a 6.500 ×g e a temperatura ambiente per 30 secondi.
Rimuovere il soprannatante mediante pipettaggio o aspirazione. Le cellule sono ora pronte per la lisi alcalina. Preparare le cellule per la lisi alcalina aggiungendo 100 microlitri di acqua distillata a ogni pellet cellulare e risospendendo mediante pipettaggio su e giù.
Aggiungere 100 microlitri di idrossido di sodio 0,2 molare a ciascun campione. Mescolare mediante vortex. Incubare le cellule a temperatura ambiente per cinque minuti.
A questo stadio, le cellule di lievito non sono state lisate e le proteine non sono state rilasciate. Successivamente, pellettizzare le cellule mediante centrifugazione a 18.000 ×g a temperatura ambiente per 30 secondi. Rimuovere il surnatante per mezzo di pipettaggio o aspirazione.
Per lisare le cellule, aggiungere 100 microlitri di tampone campione Laemmli a ogni pellet cellulare. Ri-sospendere aspirando e dispensando ripetutamente con una pipetta. Incubare a 95 gradi Celsius per cinque minuti per denaturare completamente le proteine.
Centrifugare i lisati a 18.000 ×g e a temperatura ambiente per un minuto per formare il pellet del materiale insolubile. Il surnatante, che contiene le proteine estratte e solubilizzate, è pronto per la separazione mediante elettroforesi SDS-PAGE e successiva analisi mediante Western blot. In alternativa, i lisati possono essere conservati a -20 gradi Celsius.
La stabilità di Deg1-Sec62, un substrato modello di degradazione associata al reticolo endoplasmatico nel lievito, è stata analizzata mediante la metodica del chase con cicloesimide. La proteina Deg1-Sec62 migra in SDS-PAGE come molteplici forme e viene rapidamente degradata nelle cellule di tipo selvaggio. Pgk1 è un controllo di caricamento la cui abbondanza non varia nelle condizioni saggiate.
La perdita del ligasi dell'ubiquitina residente nel RE hrd1 o dell'enzima di coniugazione dell'ubiquitina ubc7 ha stabilizzato in modo significativo la proteina Deg1-Sec62, confermando il ruolo precedentemente osservato di queste proteine nella degradazione di Deg1-Sec62. Cue1 è una proteina transmembrana che ancoraggio ubc7 alla membrana del RE e attiva l'enzima, ma un ruolo di cue1 nella degradazione di Deg1-Sec62 non era stato direttamente indagato. L'osservazione di questo studio secondo cui Deg1-Sec62 risultava stabilizzata in assenza di cue1 ha confermato un ruolo per cue1 nella degradazione associata al RE di Deg1-Sec62.
Il risultato ottenuto dal Western blot è stato quantificato utilizzando un software di analisi delle immagini. Per confrontare l'abbondanza della proteina Deg1-Sec62 tra i diversi campioni, è stato determinato per ciascun campione il rapporto tra le intensità del segnale corretto di Deg1-Sec62 e quelle di Pgk1. È importante ricordare che questa procedura fornisce informazioni in modo più diretto sulla cinetica di degradazione di una popolazione stazionaria di una proteina di interesse.
Per visualizzare il degrado della popolazione nascente di una proteina di interesse, possono essere utilizzate altre tecniche, come gli esperimenti di tipo pulse-chase. Non dimenticare che cicloesimide e azide di sodio sono estremamente tossici e si devono prendere precauzioni per evitare il contatto diretto con queste sostanze chimiche durante l'esecuzione di questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la degradazione delle proteine in Saccharomyces cerevisiae utilizzando il chase con cicloesimide seguito da immunoblotting. La tecnica consente ai ricercatori di analizzare la degradazione di proteine specifiche senza la necessità di isotopi radioattivi o di passaggi lunghi di immunoprecipitazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Decadimento delle proteine
- Biologia cellulare
- Sistemi modello lieviti
Sfondo
- L'abbondanza proteica è influenzata dai tassi di sintesi e di degradazione.
- Il metodo del chase con cicloesimide è utilizzato per studiare la stabilità delle proteine.
- Il blotting Western è una tecnica per rilevare proteine specifiche.
- Comprendere la degradazione proteica è fondamentale per ottenere informazioni sui processi cellulari.
Scopo dello studio
- Visualizzare la degradazione di una proteina specifica nel lievito.
- Determinare i fattori genetici e ambientali che influenzano la degradazione delle proteine.
- Fornire un'alternativa più semplice alle tecniche tradizionali di pulse-chase.
Metodi Utilizzati
- Uso di cicloesamide per inibire la sintesi proteica.
- Analisi mediante Western blot dei livelli proteici nel tempo.
- Trasformazione di lievito con plasmidi che codificano per proteine di interesse.
- Innesto del lievito in un mezzo di crescita appropriato.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del degrado proteico nel lievito.
- Identificazione dei requisiti genetici per il degrado proteico.
- Valutazione degli effetti ambientali sulla stabilità delle proteine.
- Dimostrazione dell'efficienza del metodo rispetto alle tecniche tradizionali.
Conclusioni
- Il metodo del chase con cicloesimide è efficace per lo studio della degradazione delle proteine.
- Questa tecnica semplifica l'analisi della stabilità proteica nel lievito.
- I risultati contribuiscono a una migliore comprensione della dinamica proteica nelle cellule.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La cinetica di degradazione delle proteine è fondamentale per la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta. Il metodo del chase con cicloesimide consente una valutazione quantitativa della stabilità proteica in un modello geneticamente modificabile, supportando la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi. Questo approccio fornisce una previsione affidabile per la priorizzazione degli obiettivi e la riduzione del rischio associato a ipotesi meccanicistiche prima dello screening dei composti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando i tassi di degradazione delle popolazioni proteiche a stato stazionario.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale del target attraverso l'analisi di perturbazioni genetiche e ambientali.
- Valore predittivo: Genera dati quantitativi di cinetica di degradazione per informare decisioni relative alla fiducia nel target e al triage del portafoglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Produce output standardizzati e riproducibili del western blot per misurazioni temporali della stabilità proteica.
- Scalabilità: Compatibile con test multiplo-condizione per valutare gli effetti di composti sulle vie di degradazione proteica.
- Utilità della piattaforma: Stabilisce una capacità riutilizzabile per valutare l'interazione con il bersaglio mediante modulazione della degradazione in sistemi a base di lievito.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Utilizza Saccharomyces cerevisiae come sistema rilevante per modellare meccanismi conservati di degradazione.
- Continuità traslazionale: Collega la validazione del bersaglio nella fase di scoperta a studi preclinici attraverso l'analisi del percorso conservato dell'ubiquitina-proteasoma.
- Avanzamento basato sul rischio: Identifica modificatori genetici e ambientali della degradazione per ridurre i rischi associati ai meccanismi del bersaglio prima della validazione nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di un composto promettente, fornendo dati cinetici sulla degradazione che orientano la selezione del bersaglio e gli studi sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi isolando le variabili di degradazione dagli effetti di sintesi.
- Screening: Permette lo sviluppo di saggi per lo screening di composti stabilendo tassi di degradazione di base in ceppi di lievito ingegnerizzati.
- Analisi: Genera letture quantitative di immunoblotting normalizzate rispetto ai controlli di caricamento per l'analisi comparativa tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati sulla degradazione ottenuti nel lievito a sistemi mammiferi attraverso componenti conservati del sistema di degradazione associato al reticolo endoplasmatico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per la riduzione del rischio su target in progetti diversi mediante studi di perturbazione genetica e chimica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica quantificando l'emivita delle proteine e identificando le dipendenze dai percorsi di degradazione.
- Valore operativo: Offre un flusso di lavoro standardizzato e privo di isotopi, compatibile con l'infrastruttura standard per il western blot.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione del progetto riducendo l'ambiguità riguardo al meccanismo del bersaglio e agli effetti dei composti modulatori sulla stabilità.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei bersagli aggiustata in base al rischio, basata sulla trattabilità della degradazione e sulla conservazione del percorso.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione delle colture di lievito, nelle procedure di sicurezza per il cicloesimide e nella quantificazione dei western blot.
- Presuppone l'accesso a blocchi riscaldanti a 30°C e 95°C, centrifughe e apparecchiature standard per SDS-PAGE e western blotting.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la raccolta dei punti temporali, l'efficienza della lisi e le procedure di normalizzazione del segnale.
- Aspetti da considerare per l'adattamento includono sistemi di espressione basati su plasmidi, marcatura con epitopi e compatibilità con librerie di lieviti knock-out.
- I limiti pratici comprendono la tossicità del cicloesimide, possibili effetti fuori bersaglio sulla traduzione e la necessità di una rivelazione entro il range lineare nei western blot.
