Sequenziale Applicazione di vetrini di vetro per valutare la compressione Rigidità della lente Mouse: Strain e morfometriche analisi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la rigidità alla compressione e la geometria delle lenti di topo utilizzando un approccio semplice ed economico. Questo metodo può rispondere a domande chiave nel campo delle lenti. Ad esempio, come diverse perturbazioni genetiche e sperimentali influenzano le proprietà biomeccaniche delle lenti.

I principali vantaggi di questa tecnica sono che è precisa, riproducibile e non richiede attrezzature costose o specializzate. Questo metodo fornisce informazioni sulle proprietà delle lenti dei topi, con una potenziale applicazione a organismi modello più grandi come ratti e conigli. La visualizzazione del metodo è fondamentale perché le fasi di dissezione delle lenti e di applicazione del vetrino coprioggetti sono difficili da apprendere senza dimostrazione.

A dimostrare la procedura sarà Catherine Cheng, una post-doc del mio laboratorio. Inizia la dissezione usando una pinza curva per deprimere il tessuto intorno all'occhio di un topo soppresso portando l'occhio fuori dall'orbita. Quindi, rimuovere l'occhio e metterlo in una capsula di dissezione contenente PBS fresco al microscopio da dissezione.

Taglia il nervo ottico il più vicino possibile al bulbo oculare. E inserire delicatamente e con attenzione una pinzetta sottile e dritta nel bulbo oculare attraverso il foro in cui il nervo ottico esce dalla parte posteriore dell'organo. Praticare con cura un'incisione con le forbici dalla parte posteriore al bordo della cornea, facendo attenzione a non danneggiare il cristallino.

Continuare l'incisione lungo la giunzione tra la cornea e la sclera, almeno a metà del bulbo oculare. E spingere delicatamente sulla cornea per rimuovere la lente dall'occhio attraverso l'apertura. Quindi, utilizzare una pinza diritta a punta fine per rimuovere con cura eventuali detriti di grandi dimensioni ancora attaccati all'obiettivo.

E confermare visivamente che l'obiettivo non sia danneggiato. Almeno due ore prima di iniziare le misurazioni della rigidità, utilizzare una bilancia analitica per pesare almeno 10 vetrini coprioggetto dalla stessa scatola. Determinare il peso medio dei vetrini coprioggetto.

Quindi, pre bagnare i vetrini coprioggetto e uno specchio ad angolo retto in PBS a temperatura ambiente. Durante l'idratazione dei materiali, riempire la camera di misura con 65-75 millilitri di PBS. E posizionare la camera sotto un microscopio da dissezione impostato su un ingrandimento 30X, con illuminazione dal basso e una sorgente di luce a fibre ottiche sui lati sinistro e destro.

Quando i vetrini coprioggetti sono pronti, posizionare lo specchio ad angolo retto nella camera a una distanza costante dal divot che verrà utilizzato per tenere l'obiettivo. Quindi, utilizzando una pinza curva, trasferire con cura le lenti sezionate nella camera di misurazione. Impostare l'alimentazione dell'ottica di alimentazione sull'80% dell'intensità luminosa massima e regolare l'uscita dell'alimentatore in base all'illuminazione ambientale, alle preferenze dell'utente e alla qualità dell'immagine secondo necessità.

Ottenere immagini con vista dall'alto delle lenti scaricate direttamente dall'alto della camera. Quindi, scatta una foto del bordo dello specchio a fuoco, seguita da un'immagine laterale view dell'obiettivo scarico attraverso lo specchio all'esterno del divot. Quindi, posiziona una lente nel divot e verifica che la lente sia posizionata saldamente e dritta all'interno del divot sul suo polo anteriore o posteriore.

Scatta una foto dell'obiettivo nello specchio. Quindi, posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti sulla lente. Dopo due minuti, scattare un'altra immagine laterale dell'obiettivo caricato.

Continuare ad aggiungere i vetrini, ottenendo le immagini della vista laterale due minuti dopo l'aggiunta di ciascun vetrino coprioggetti, fino a quando non sono stati applicati i vetrini coprioggetto in totale. Quindi, rimuovere tutti i vetrini, attendere gli ultimi due minuti e ottenere immagini laterali dell'obiettivo all'interno e all'esterno del divo. E un'immagine dall'alto dell'obiettivo al di fuori del divot.

Per determinare la dimensione del nucleo della lente, posizionare una lente in una capsula di Petri pulita riempita di PBS e utilizzare una pinza fine e diritta per decapsulare delicatamente la lente. Per rimuovere le cellule delle fibre corticali, far rotolare la lente tra le dita guantate. Quindi, sciacquare delicatamente il nucleo della lente nel PBS e riposizionare il nucleo nella camera di misurazione.

Acquisire un'immagine del nucleo della lente attraverso lo specchio ad angolo retto. Infine, per analizzare le immagini, utilizzare l'apposito software di analisi delle immagini per misurare i diametri equatoriali e assiali delle lenti prima e dopo ogni fase di caricamento. Misura anche il diametro del nucleo di ciascuna lente.

In questo esperimento rappresentativo, sono state misurate la rigidità e le dimensioni delle lenti di topo di due, quattro e otto mesi e sono state calcolate le deformazioni assiali ed equatoriali. La deformazione assiale è una funzione logaritmica del carico applicato con una diminuzione statisticamente significativa, dipendente dall'età, delle deformazioni assiali ed equatoriali sotto il carico massimo applicato, indicando che la lente del topo si irrigidisce con l'età. I dati delle immagini raccolti durante questo esperimento sono stati utilizzati anche per determinare diverse altre caratteristiche morfologiche delle lenti.

Come previsto, i diametri assiali ed equatoriali e il volume della lente aumentavano con l'età. Il rapporto d'aspetto indica che la lente ha un diametro equatoriale leggermente maggiore del diametro assiale. E questo parametro non è cambiato con l'età.

Il diametro, il volume e la frazione del nucleo della lente aumentano con l'età, suggerendo che il nucleo della lente si rimodella per aumentare di dimensioni relative con l'invecchiamento della lente. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 30-45 minuti per lente, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante posizionare la lente in modo uniforme all'interno del divot e consentire alla lente di rilassarsi per due minuti tra ogni vetrino coprioggetti aggiuntivo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la rigidità alla compressione e la morfometria delle lenti del mouse utilizzando l'applicazione sequenziale dei vetrini. Questa tecnica precisa, semplice ed economica apre la strada ai ricercatori di lenti per esplorare gli effetti biomeccanici delle mutazioni genetiche nei topi.