Coculture saggi per studiare macrofagi e microglia stimolazione del glioblastoma Invasion

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di modellare l'interazione delle cellule di glioblastoma con microglia e macrofagi durante l'invasione in un saggio in vitro. Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del microambiente tumorale, come ad esempio quali composti o trattamenti possono interferire con l'interazione del cancro con i macrofagi, un tipo di cellula del microambiente durante la progressione verso la malignità. Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che è relativamente facile da eseguire e può essere completata in un tempo ragionevole e sembra modellare accuratamente l'invasione del glioblastoma in vivo.

Inizia differenziando la linea cellulare di interesse usando l'acetato di mirito, come segue. In primo luogo, piastra due o tre volte da 10 a 5 cellule THP-1 in 1,5 millilitri di terreno in una piastra di coltura a sei pozzetti. Subito dopo la piastratura, aggiungere 100 nanomolari di PMA e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per 48 ore.

Dopo 48 ore, rimuovere il PMA aspirando il terreno, lavare una volta con one-X PBS e aggiungere il terreno fresco. Incubare per altre 48 ore fino a quando le cellule sono pronte per l'uso nel saggio. Quindi equilibrare le camere pre-rivestite della matrice posizionandole in un pozzetto contenente 500 microlitri di terreno senza siero e quindi aggiungendo 500 microlitri di terreno privo di siero verso l'alto.

Incubare le camere per due ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Successivamente, aspirare delicatamente il terreno dai recipienti di coltura contenenti le linee cellulari di glioblastoma marcate in fluorescenza e la microglia e i macrofagi. Quindi aggiungere 500 microlitri di EDTA e PBS da due millimolari e incubare per cinque-10 minuti nell'incubatore per colture tissutali.

Raccogliere le cellule in cinque millilitri di terreno contenente lo 0,3% di albumina sierica bovina e centrifugare per cinque minuti a 120 volte G.Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un terreno appropriato a una concentrazione di una volta 10 per la sesta cellula per millilitro. Utilizzare l'emocitometro per contare le cellule. Quindi, aggiungere 500 microlitri del terreno appropriato contenente lo 0,3% di BSA ai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.

Quindi rimuovere il mezzo dalle camere equilibrate e posizionare le camere nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti. Se gli inibitori vengono utilizzati per studiare il loro effetto sull'invasione del glioma stimolata da macrofagi o microglia, aggiungere la concentrazione appropriata sia nella parte inferiore che in quella superiore della camera. A seconda della linea cellulare utilizzata, mescolare le cellule di glioblastoma e le cellule di microglia o glioma di topo e le cellule dei macrofagi secondo i dettagli nella parte scritta del protocollo.

Aggiungere la miscela di cellule nella camera superiore e incubare per 24-48 ore, a seconda del tipo di cellula. Dopo l'incubazione, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera mediante delicata aspirazione. Quindi posizionare le camere in 3,7% di formaldeide in PBS per fissarle.

Lasciare le camere in fissativo per 15 minuti a temperatura ambiente. Infine, rimuovere il fissativo mediante aspirazione delicata e sostituirlo con 500 microlitri di one-X PBS. Innanzitutto, scongelare la miscela di matrice a quattro gradi Celsius durante la notte.

Successivamente, preparare una concentrazione di matrice di 10 milligrammi per millilitro nel terreno appropriato su ghiaccio. Quindi, raccogliere le cellule marcate per la sospensione nella matrice come mostrato in precedenza. Quindi pipettare 1,5 volte 10 al quinto GL261 in un volume di 150 microlitri più cinque volte 10 al quarto di microglia in 50 microlitri in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri.

Aggiungere due volte 10 alla quinta cella GL261 in un volume di 200 microlitri in una provetta separata da 1,5 millilitri. Far girare le cellule in una microfuga per cinque minuti a 120 volte G.Quindi, risospendere le cellule in 200 microlitri di matrice fredda su ghiaccio. Per questo passaggio è fondamentale avere la vaschetta del ghiaccio pronta nella cappa, tenere i tubi sul ghiaccio, le punte in frigorifero, assicurarsi che tutto sia raffreddato in modo da evitare la polimerizzazione prematura del gel maturo.

Dopo la risospensione, posizionare 50.000 cellule in un volume di 50 microlitri al centro del compartimento superiore di un inserto della camera con pori di otto micron. Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 30 minuti per consentire la polimerizzazione. Dopo 30 minuti, aggiungere 200 microlitri di terreno privo di siero nella camera superiore e 700 microlitri di siero contenente terreno di crescita cellulare nel pozzetto inferiore.

Dopo l'incubazione per 48 ore, rimuovere le cellule dalla parte superiore della camera mediante aspirazione delicata. Fissare le camere come prima e sostituire il fissativo con 500 microlitri di one-X PBS prima di eseguire l'imaging delle cellule. Questa immagine rappresentativa mostra l'invasione di cellule GL261 che esprimono mCherry in assenza di microglia.

Le cellule sono state piastrate su camere rivestite di matrice e incubate per 48 ore. Le immagini sono state scattate utilizzando un obiettivo 10X e la barra della scala rappresenta 400 micron. Qui le cellule GL261 sono state combinate con la microglia.

È stato quantificato il numero di cellule invasive GL261 che attraversano il filtro. Come si vede qui, la cocoltura della linea cellulare di glioblastoma di topo GL261 con la microglia ne aumenta l'invasione fino a 10 volte nel saggio 2D. Questa immagine mostra l'effetto degli inibitori farmacologici sull'invasione di GL261 stimolata dalla microglia rispetto al controllo con DMSO.

I dati mostrati provengono da sei esperimenti indipendenti. Questo test è stato impiegato con successo anche utilizzando linee cellulari umane. Le cellule U87 placcate su camere rivestite di matrice e colorate con verde CMFDA vengono mostrate dopo un'incubazione di 24 ore.

Qui le cellule U87 sono state piastrate con macrofagi THP1 differenziati. Questa immagine mostra la quantificazione del saggio contando solo le cellule U87 invasive. La linea cellulare di macrofagi umani THP1 ha stimolato l'invasione delle cellule di glioblastoma U87.

I dati mostrati sono i valori medi di 10 esperimenti indipendenti. Questa immagine tratta da un saggio di invasione 3D della cocoltura di GL261 e microglia è un composito di una serie Z di immagini e mostra le cellule GL261 colorate con verde CMFDA incorporato nella sola matrice. Qui le cellule GL261 sono state co-coltivate con microglia murina marcata con rosso CMPTX.

Qui sono mostrate le celle GL261 sul lato inferiore del filtro, che sono determinate per essere invasive. Il numero totale di cellule GL261 invasive è stato determinato e normalizzato a quello delle cellule GL261 in monocoltura. I dati mostrati rappresentano la media di tre esperimenti indipendenti eseguiti in duplicato.

Quindi, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata dall'inizio alla fine in circa due ore. E i risultati finali dell'esperimento possono essere ottenuti dopo 48 ore. Quindi, durante l'esecuzione di questa tecnica, è molto importante avere tutto raffreddato e a quattro gradi, compresi i tubi e le pipette.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire il glioblastoma nei saggi di invasione di cocoltura della microglia macrofagica.