Name: In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Scopri come rilevare l'attività caspasica non apoptotica in Drosophila melanogaster utilizzando il biosensore CaspaseTracker. Questo metodo consente di studiare le funzioni cellulari delle caspasi in organismi viventi.

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Ringraziamo Polan Santos e Darren Obbard per le illustrazioni di Drosophila in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena per l&#39;uso del insectary JHMRI. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Fondazione Life Science Research (HLT), Comitato Università assegni di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Fondazione Life Sciences Research.

1. Preparazione di mosche CaspaseTracker <ol><li> Per preparare CaspaseTracker (DQVD) vola per esperimenti, eseguire questa croce: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS), trasferendo 7-10 femmina vergine (o maschio) mosche trasportano il substrato caspasi biosensore mCD8-DIAP1-GAL4 guidato dal promotore dell&#39;ubiquitina 35 insieme con lo stesso numero di maschio (o femmina) linea G-TRACE, che hanno la seconda bilanciatore cromosoma cyo per evitare letalità della combinazione omozigote di G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS) 34. Inserire vola in un flaconcino alimento fresco con pasta di lievito fresco come fonte proteica. </li><li> Incubare i file a 18 ° C per 5 a 7 giorni (massimo 2 settimane) e quindi rimuovere il genitore aria dal flacone per evitare il sovraffollamento con la nuova progenie, e per impostare nuove fiale di allevamento. </li><li> Continuare incubazione a 18 ° C fino a quando progenie vola Eclose. Selezionare la non cyo [non-cURLy ala] progenie della corretta genotipo di CaspaseTracker, che sono transgenici per CaspaseTracker e G-35 oligoelementi. </li><li> Allo stesso tempo, generare controllo parentale mosche W118 non transgenici e caspasi-insensitive (DQVA) vola in parallelo per verificare specifiche RFP CaspaseTracker e GFP fluorescenza. </li><li> Eseguire la PCR genotipizzazione per confermare i file con CaspaseTracker utilizzando i primer: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producendo un prodotto di 3.897 bp. Per la genotipizzazione loci G-Trace, utilizzare i seguenti primer per GFP (474 ​​bp), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; per RFP (258 bp), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e per Flpase (655 bp), 5&#39;-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TCT TTG CTG TCA C. Per la genotipizzazione GAL4 nel vettore pUWR (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto, colorazione e montaggio <ol><li> Per dissezioni mosca, evitare tessuti dissezionati di attaccarsi alle punte di plastica per pipette e provette da centrifuga, consigli cappotto e tubi con albumina 1% di siero bovino (BSA) disciolti in acqua. </li><li> Dissect vola su un cuscinetto di silicone con pinze. <ol><li> Per evitare di danneggiare le punte delle pinze su una superficie dura quando si esegue la dissezione, eseguire la dissezione su una superficie di silicio. Per la realizzazione di lastre di dissezione silicone, sciogliere il silicio nel kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Materials List). Dopo la fusione il silicone, aggiungere 3 a 4 mL di un tessuto di diametro piatto di coltura 60mm. piatti di silicio possono essere riutilizzati. </li><li> Anestetizzare una mosca con CO 2, e trasferirlo ad una piastra in silicone con 1 ml di PBS freddo. Introdurre la CO 2 ad un flacone contenente il volo usando una cerbottana, e quindi trasferire al volo t anestetizzatoOA Pad che ha una fornitura di CO 2. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere la testa mosca, ed una seconda coppia di pinze per tirare torace nella direzione opposta per scollegare la testa mosca dal corpo di rivestimento senza danneggiare la connessione tra la testa e foregut. </li><li> Usare 2 paia di pinze per rimuovere le ali e le gambe dal torace. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere il torace, e un altro paio di pinze per tirare l&#39;addome per separarlo dal torace di nuovo senza danneggiare la connessione tra il foregut e midgut. </li><li> Sezionare organi interni compreso il cervello, intestino, tubuli malpighiani e le ovaie, come precedentemente dimostrato. 39-41 </li><li> Rimuovere tutti i pezzi della cuticola e gli organi di grasso con una pinza da questi tessuti producono forti autofluorescenza. La pazienza e la pratica sono tenuti a preparare un sistema di organi completo come mostrato. </li></ol></li><li> Trasferimento tessuti sezionati a 1,5 ml provette da centrifuga, e fissare i tessuti with 0,5 mL di 4% paraformaldeide in PBS (tampone fosfato salino) a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti con rotazione al buio per evitare sbiancamento RFP e GFP nei tessuti. Evitare la fissazione prolungata che può compromettere le successive risultati di colorazione. </li><li> Rimuovere la paraformaldeide delicatamente pipettando e lavare 3 volte con 0,5 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) a RT. </li><li> Permeabilize i tessuti con 0,5 ml PBST a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento. incubazione più brevi possono causare permeabilizzazione e il compromesso di colorazione risultati incompleti. <ol><li> Se è necessario ridurre la colorazione di fondo, non incubando tessuti in 0,5 mL PBST con 1% BSA, invece di PBS. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte con 0,5 mL PBST. </li><li> Per macchiare nuclei e filamentosa actina (F-actina), si applicano 0,5 ml PBST con 10 mg / mL di Hoechst 33342 blu colorante nucleare e 0,3 micron Alexa Fluor 633 falloidina F-actina macchia e incubare simultaneamente con i tessuti per 1 ora a RT with leggera rotazione nel buio. Evitare colorazione prolungata in quanto ciò aumenterà lo sfondo. <ol><li> Per immunocolorazione, incubare fisso e permeabilizzate tessuti con 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml di PBS notte a 4 ° C, macchia con diluizione 1: 100 di anticorpi anti-ELAV o con diluizione 1: 200 di anticorpi anti-caspasi-3 notte a 4 ° C (300 mL). Seguire dal corrispondente anticorpo secondario diluito 1: 100 e incubare per 1 a 3 ore a RT. Vedere Materiali Lista per specifiche informazioni di anticorpi. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte, ognuna per 5 min in 0,5 mL PBST con rotazione dolce. </li><li> Con una pipetta, rimuovere tutti PBST, e poi aggiungere 200 microlitri anti-candeggina agente di montaggio (vedi materiali) per coprire completamente i tessuti per 1-3 ore a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la notte. tessuti ottimali che hanno completamente assorbito l&#39;agente di montaggio si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Pre-pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70% e trasferire i tessuti con l&#39;agente di montaggio per i glass slitta. </li><li> Posizionare con cura un vetrino di vetro sopra i tessuti. Applicare vaselina per il vetrino e la polizza di copertura per evitare di distruggere il tessuto da sovracompressione. Rimuovere l&#39;agente di fissaggio in più con la carta velina. </li><li> Sigillare la polizza di copertura mediante l&#39;applicazione di smalto lungo i bordi del vetrino per evitare la fuoriuscita di agenti di montaggio dai tessuti. </li></ol> 3. Microscopia confocale <ol><li> Utilizzare un confocale epi-microscopio a fluorescenza invertito. Tuttavia, microscopi up-destra possono anche essere utilizzati. Per i tessuti di immagine utilizzando piastrelle, mantenere la temperatura ambiente stabile per evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy a causa della dilatazione termica e la contrazione dei componenti. sistemi di controllo ambientale e sistemi di compensazione attenzione deriva aiutano ad evitare questo problema a causa di perdita di termo-equilibrio del sistema microscopio. </li><li> Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Prendete un paio di immagini di prova con bassa risoluzione (125 x 125 pixel) unad determinare il numero appropriato di piastrelle necessarie per coprire l&#39;intera regione di interesse (ROI). </li><li> Impostare il sistema di scansione microscopio per catturare immagini con risoluzione di scansione ad esempio 500 x 500 pixel. Selezionare l&#39;obiettivo come un 20X NA 0.8 o un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 per analizzare i tessuti attraverso vetrino, in modo che ciascuna delle immagini (piastrelle) sovrapposizioni del 20% su tutti i lati. </li><li> Impostare la sequenza di immagini da più lungo al più breve lunghezze d&#39;onda di eccitazione, come la luce di lunghezza d&#39;onda lunga provoca inferiore fotometabolismo. La sequenza dalla più lunga alla più corta lunghezza d&#39;onda di eccitazione è: (i) 633 nm per falloidina F-actina e per gli anticorpi caspasi attivate, (ii) 561 nm per RFP, (iii) 488 nm per GFP, e (iv) 405 nm per Hoechst macchia nucleare. </li><li> Durante l&#39;imaging, minimizzare l&#39;esposizione delle cellule alla eccitazione laser fluorescente durante il processo di imaging per evitare fotometabolismo riducendo l&#39;intensità del laser per ottenere immagini di alta qualità di tessuti. </li><li> Dopo iomaghi sono raccolti, l&#39;unione delle immagini utilizzando il software microscopio. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui illustriamo la costruzione e funzionamento interno di CaspaseTracker che facilitano il rilevamento di una diffusa attività di caspasi basale nei tessuti sani. I passaggi critici per rilevare l&#39;attività della caspasi non apoptotica in vivo sono: 1) la generazione di mosche con il transgene biosensore, 2) verificare la funzione giornalista specifiche caspasi con opportuni controlli, 3) praticando tecniche di dissezione di osservare tutti i sistemi di organi interni di adulti Drosophila, e 4) atti...

Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l&#39;adesione molte proteine ​​intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. 1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l&#39;apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemioterapia. 5 un diverso insieme di caspasi può causare la morte cellulare da processi non apoptotici distinte per stimolare l&#39;immunità innata. 6 Perciò, maggior parte della ricerca sulle caspasi è concentrata sulla loro funzioni pro-morte. È interessante notare che le prove nelle prime fasi del campo ha rivelato che gli stessi caspasi responsabili della promozione della morte cellulare hanno anche non-morte funzioni. Studi pionieristici hanno dimostrato che caspasi sono coinvolte in diverse funzioni cellulari in cellule sane, tra cui la regolazione della proliferazione cellulare e la migrazione durante l&#39;embriogenesi. 7-9 Caspases sono necessari per l&#39;individualizzazione spermatid in Drosophila 10,11, per bloccare un percorso di morte cellulare necroptotic alternativa nei topi 12,13, e per l&#39;elaborazione microRNA in C. elegans. 14,15 In forse la più lunga vissuto cellule, i neuroni, caspasi e altri macchinari apoptotica sono implicati nella regolazione dell&#39;attività neuronale da potatura terminazioni sinaptiche, un processo che si ritiene essere essenziale per rafforzare altri sinapsi per l&#39;apprendimento e la memoria 16. 18 E &#39;possibile che caspasi facilitare la potatura sinaptica da un tipo di mini-apoptosi di minuscole proiezioni neuronali senza morte cellulare intero. 19 Tuttavia, caspasi possono avere funzioni alternative non correlati ad eventi apoptosi-like. 20,21 duplice ruolos nella vita e la morte non sono riservate caspasi; BCL-2 proteine della famiglia e citocromo c hanno ruoli in energetica cellulari in cellule sane, ma sono anche parte del nucleo via apoptotica che viene attivato da molti tipi di stress cellulare. 22-25 Anche se non è provato, sembra logico che l&#39;evoluzione ha legato giorno : i processi di morte-posti di lavoro all&#39;interno delle stesse molecole per garantire la tempestiva eliminazione delle cellule inadatti o indesiderabili. Allo stato attuale, i meccanismi molecolari di attività caspasi non-apoptotica non sono comprese, e la misura dell&#39;attività di caspasi non apoptotica durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti non è noto. Una sfida importante è la difficoltà nel distinguere giornaliere di posti di lavoro da death-lavori di caspasi. In contrasto con l&#39;apoptosi e pyroptosis, quando l&#39;attività delle caspasi è amplificato da una cascata proteolitica, si prevede che i giorno-lavori di caspasi che si verifichi a livelli molto più bassi di attività enzimatica, probabilmente al di sotto di rilevamento da molti Techn disponibileologies. Prima del lavoro qui presentato, altri svilupparono una varietà di biosensori caspasi per scopi diversi. I biosensori SCAT (ad esempio, ECFP-DEVD-Venere) individuare rapidamente l&#39;attività della caspasi in tempo reale in cellule in coltura e tessuti animali utilizzando FRET. 26,27 Al caspasi scissione, la frazione GFP nucleare mirato di Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subisce rilocalizzazione subcellulare in pochi minuti quando la sua membrana plasmatica-tether viene scisso dalla caspasi. 28 allo stesso modo, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) rilocalizza dal citoplasma al nucleo su caspasi scissione. 29,30 Altro di recente, il cromoforo in iCasper è stato abilmente progettato per fluorescenza quando spaccati dalla caspasi, permettendo la rilevazione di attività biosensore in tempo reale nei neuroni di embrioni di Drosophila, ma soprattutto in associazione con la morte delle cellule di sviluppo. morte 31 caspasi-dipendente dei neuroni olfattivi durante l&#39;invecchiamento, è stato demonstvotata da immuno-rilevamento della forma caspasi-spaccati di biosensori CPV (ad esempio, mCD8-PARP-Venere). 32,33 È importante sottolineare che la forma attiva della caspasi-3 è stato rilevato in assenza di morte cellulare da immunostain sensibile a spine di neuroni in coltura, e nel soma utilizzando la fluorescenza caspasi-dipendente del colorante CellEvent giornalista nucleare, ma sono stati riscontrati a causa di foto-tossicità difficoltà, anche se la morte cellulare è stata ritardata fino a dopo l&#39;eliminazione della colonna vertebrale. 19 Pertanto, sono necessari nuovi biosensori caspasi per rilevare e tenere traccia delle cellule con l&#39;attività delle caspasi basale in vivo. Per superare queste difficoltà, abbiamo generato un romanzo a due biosensore colore caspasi, designato CaspaseTracker. Questa strategia combina una versione modificata del Drosophila caspasi-sensitive Apoliner biosensore 28 con la Drosophila G-TRACE sistema FRT ricombinasi 34 per etichettare definitivamente e monitorare le cellule in vivo. &lt;sup&gt; 35 Il sistema G-TRACE GAL4-attivato permette di livelli molto bassi di caspasi per attivare CaspaseTracker, con conseguente espressione RFP nel citoplasma e l&#39;espressione GFP nucleare mirata permanente in una cella che ha mai sperimentato l&#39;attività delle caspasi. 35 Questo sistema può etichettare cellule per tutta la vita in animali interi utilizzando Drosophila melanogaster, un sistema modello trattabili e ampiamente utilizzati per lo studio delle caspasi e morte cellulare. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumabili e reagenti</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont pinzetta di grado biologico, acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Vetrini a goccia sospesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sonde</td> <td>molecolariH1399</td><td>Colorazione del DNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Sonde</td><td>molecolari</td> della falloidina <td>A22284</td><td>Colorazione dell'actina</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-elav di ratto-Elav-7E8A10</td><td>Studi sullo sviluppo Banca dell'ibridoma (DSHB)</td><td>ID del registro degli anticorpi:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Colorazione per Drosophla ELAV pan-neuronale</td></tr><tr><td>Caspasi-3 (Asp175) anticorpo Cell</td><td>Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Colorazione per frammento attivo di caspasi-3</td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>per preservare i fluorofori&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>per preservare i fluorofori&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico SylGard 182</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Codice prodotto: 0001023934</td><td>per piastre</td></tr><tr> di dissezione<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscopio Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila Illuminatore</td></tr> per <tr><td>microscopio a doppio collo d'oca in fibra ottica, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Sorgente luminosa</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Le caspasi sono i mediatori chiave della morte cellulare apoptotica attraverso la loro attività proteolitica. Quando le caspasi vengono attivate nelle cellule a livelli rilevabili dalle tecnologie disponibili, si presume generalmente che l'apoptosi si verifichi poco dopo. Le caspasi possono scindere molti componenti funzionali e strutturali per causare una rapida e completa distruzione cellulare in pochi minuti. Tuttavia, l'accumulo di prove indica che nelle cellule sane normali le stesse caspasi hanno altre funzioni, presumibilmente a livelli enzimatici più bassi. Gli studi sull'attività delle caspasi non apoptotiche sono stati ostacolati dalle difficoltà di rilevare bassi livelli di attività delle caspasi e di tracciare il destino cellulare finale in vivo. Qui, illustriamo l'uso di un reporter di caspasi ultrasensibile, CaspaseTracker, che etichetta in modo permanente le cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in animali interi. Questo biosensore CaspaseTracker in vivo a due colori per Drosophila melanogaster esprime transitoriamente la proteina fluorescente rossa (RFP) per indicare l'attività della caspasi recente o in corso ed esprime in modo permanente la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in qualsiasi momento in passato ma che non sono morte. È importante sottolineare che questo biosensore in vivo caspasi-dipendente rivela prontamente la presenza di attività caspasica non apoptotica nei tessuti dei sistemi di organi in tutto il moscerino adulto. Ciò è dimostrato utilizzando dissezioni dell'intera montatura di singoli moscerini per rilevare l'attività del biosensore in cellule sane in tutto il cervello, l'intestino, i tubuli malpighiani, il cardias, i dotti ovarici e altri tessuti. CaspaseTracker rileva l'attività delle caspasi non apoptotiche nelle cellule longeve, poiché l'attività dei biosensori viene rilevata nei neuroni adulti e in altri tessuti almeno 10 giorni dopo l'attivazione della caspasi. Questo biosensore funge da strumento importante per scoprire i ruoli e i meccanismi molecolari dell'attività delle caspasi non apoptotiche negli animali vivi.

Ci sono due componenti fondamentali che permettono CaspaseTracker per rilevare l&#39;attività delle caspasi nelle cellule sane normali (Figura 1A). Il primo di questi è un 146 aminoacidi polipeptide caspasi-cleavable modello della caspasi biosensore Apoliner (Figura 1b). 28 Questo polipeptide è derivato da DIAP1 (Drosophila inibitore di apoptosi) contenente un singolo sito caspasi naturale che è scisso durante l&#39;apoptosi tipicamen...

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare e monitorare l'attività delle caspasi non apoptotiche in animali vivi, utilizzando Drosophila melanogaster come modello. Le caspasi sono proteasi che scindono numerosi componenti cellulari inducendo la morte cellulare apoptotica. Pertanto, la presenza di caspasi attive all'interno delle cellule è spesso considerata indicativa di una morte cellulare imminente.Tuttavia, crescenti evidenze indicano che le stesse caspasi responsabili della morte cellulare svolgono anche ruoli normali nelle cellule sane. E questi ruoli quotidiani delle caspasi includono la regolazione dell'attività neuronale, delle funzioni mitocondriali e persino la soppressione di percorsi alternativi di morte cellulare. Esistono due principali difficoltà nello studio dei ruoli quotidiani delle caspasi.Prima di tutto, i livelli basali normali di attività delle caspasi sono generalmente al di sotto dei limiti di rilevamento delle tecnologie disponibili. In secondo luogo, anche quando l'attività basale delle caspasi è rilevabile, è difficile distinguerla dall'attività delle caspasi che porterà alla morte cellulare nel prossimo futuro. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un caspase tracker: un biosensore per le caspasi più sensibile, in grado di marcare in modo permanente le cellule che hanno superato l'attivazione delle caspasi.Questo biosensore ci permetterà di rilevare e tracciare le cellule con attività caspasi non apoptotiche e di studiarne le funzioni in animali vivi. Il sistema biosensore per il tracciamento in vivo delle caspasi in Drosophila è costituito da due componenti: il trascrittore Gal4 attivabile dalle caspasi e il reporter fluorescente attivato da Gal4 noto come G-Trace.I moscerini con biosensore della caspasi vengono incrociati con moscerini G-Trace per generare moscerini CaspaseTracker che segnalano l'attività della caspasi mediante fluorescenza rossa e verde. L'attività della caspasi viene rilevata nei moscerini figli quando il biosensore viene scisso dalle caspasi attive alla sequenza DQVD, liberando Gal4 dalla membrana plasmatica. Gal4 rilasciato si trasloca nel nucleo e induce l'espressione della proteina fluorescente rossa, RFP, finché le caspasi non diventano inattive.Tuttavia, Gal4 induce anche l'espressione della ricombinasi FLP, portando a un'espressione continua della GFP mirata al nucleo per tutta la durata della vita della cellula. Un biosensore di controllo presenta una mutazione, DQVA, nel sito di scissione della caspasi. Per iniziare, incrociare moscerini transgenici portatori del biosensore Gal4 sensibile alla caspasi con moscerini portatori del reporter fluorescente G-Trace.Accoppiare da sette a dieci femmine vergini del biosensore con da sette a dieci maschi appena schiusi di moscerini G-Trace in un flacone con alimento fresco. Un importante controllo negativo è rappresentato dalla versione del biosensore insensibile alle caspasi, che presenta una singola mutazione puntiforme nel residuo di aspartato necessario per il taglio da parte delle caspasi. Utilizzare la stessa procedura di accoppiamento per queste mosche di controllo.Dopo aver allestito gli incroci, mantenere le provette a 18 gradi Celsius. Durante lo sviluppo delle larve e prima che nascano nuove mosche figlie, trasferire le mosche parentali in nuove provette per continuare a produrre nuova prole. Quando le mosche figlie emergono, raccogliere quelle con ali dritte, non ricurve.Questo fenotipo indica che questi insetti portano transgeni sia per il biosensore della caspasi che per il reporter fluorescente G-Trace. Successivamente, seguendo protocolli consolidati, dissezionare gli insetti per isolare i tessuti molli interni sia dagli insetti con tracciamento della caspasi che dai controlli. Per iniziare, preparare le punte per pipetta e le provette per centrifuga che non aderiscano ai tessuti dissecati.Per eseguire questa procedura, rivestire le punte e le provette con un percento di albumina sierica bovina disciolta in acqua. Per fissare i tessuti dissecati, caricare le provette trasparenti rivestite con zero virgola cinque millilitri di paraformaldeide fresca al quattro percento in PBS e trasferire i tessuti appena dissecati in queste provette. Successivamente, posizionare i tessuti a temperatura ambiente al buio per evitare il fotoblecamento e incubare per 20-30 minuti con una rotazione delicata, in modo da bagnare i tessuti con il fissativo evitando al contempo danni agli stessi.Fixazioni più lunghe possono portare a una colorazione subottimale dei tessuti. Per rimuovere il paraformaldeide e avviare la permeabilizzazione della membrana dei tessuti fissati, rimuovere delicatamente la soluzione di paraformaldeide con una punta di pipetta rivestita e lavare i tessuti tre volte con 0,5 mL di PBST. Per completare la permeabilizzazione dei tessuti e bloccare il legame non specifico nelle successive procedure di colorazione, incubare i tessuti in 0,5 mL di PBST contenente l'1% di BSA a 4 °C durante la notte al buio, con rotazione delicata.Il giorno successivo, rimuovere la soluzione di PBST con BSA lavando i tessuti permeabilizzati tre volte con zero virgola cinque millilitri di PBST. Per aiutare a visualizzare le diverse strutture dei tessuti, eseguire una colorazione simultanea del DNA nucleare e dell'F-actina citoplasmatica incubando i tessuti preparati in zero virgola cinque millilitri di PBST contenente il colorante nucleare blu Hoechst 33342 e la fallocidina coniugata ad AlexaFluor 633 per l'F-actina, per un'ora a temperatura ambiente con rotazione delicata. Rimuovere l'eccesso di colorante lavando i tessuti tre volte con zero virgola tre millilitri di PBST.Incubare ogni lavaggio per cinque minuti a temperatura ambiente con rotazione delicata. Rimuovere con attenzione, mediante punta di pipetta fine, tutta la soluzione dai tessuti nel tubo. Per preservare il segnale fluorescente durante l'acquisizione delle immagini, aggiungere 200 microlitri di agente di montaggio anti-sbiadimento che ricopra completamente i tessuti.Incubare i tessuti da una a tre ore a temperatura ambiente oppure a quattro gradi celsius durante la notte. Idealmente, i tessuti che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio affonderanno sul fondo del tubo. Prima di montare i tessuti, pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70%.Applicare vaselina sul vetrino e sul coprioggetto per evitare di danneggiare i tessuti a causa di una compressione eccessiva. Successivamente, trasferire i tessuti con il mezzo di montaggio sul vetrino. Rimuovere qualsiasi eccesso di mezzo di montaggio utilizzando carta assorbente.Infine, sigillare il vetrino coprioggetto applicando lo smalto per unghie lungo tutti i bordi. Per iniziare, posizionare il vetrino portaoggetto sulla piastra di un microscopio invertito. E acquisire le immagini delle cellule utilizzando un obiettivo Plan-Apocromatico 20x con un'apertura di zero virgola otto.Acquisire alcune immagini di prova a bassa risoluzione per verificare un piano di affiancamento delle immagini che copra la regione di interesse, in questo caso l'intero sistema di organi interni della mosca. Impostare la sequenza di immagini iniziando con la lunghezza d'onda di eccitazione più lunga e terminando con quella più corta. Ciò ridurrà al minimo lo sbiancamento fotoindotto, che aumenta a lunghezze d'onda più corte.Successivamente, acquisire immagini a una risoluzione adeguatamente elevata. Ogni immagine deve sovrapporsi del 10% a quella successiva per garantire un corretto affiancamento. Acquisire da due a otto scansioni di imaging per ogni campo per ridurre il rumore di fondo.Per eliminare l'ombra tra le immagini affiancate nel contrasto di interferenza differenziale (DIC), acquisire un'immagine DIC di riferimento in una regione vuota. Successivamente, eseguire la correzione dell'ombra sull'immagine affiancata utilizzando l'immagine DIC di riferimento. Questo è un moscerino dissecato appena schiuso con tracciatore delle caspasi, che mostra bocca, foregut, crop, midgut, hindgut, ano, ovidotto e ovaie.Mediante microscopia confocale, l'attività delle caspasi è visualizzata come fluorescenza RFP che indica un'attività caspasi recente, e come fluorescenza GFP che indica un'attività caspasi passata. Immagini ingrandite rivelano l'attività del biosensore RFP e GFP nel lobo ottico, nella cardia, nel mesentero, nel retto e nell'ovidotto. Specifiche cellule lungo i tubuli di Malpighi mostrano in modo evidente sia RFP che GFP, indicando un'attività caspasi persistente.Al contrario, non &egrave; stata espressa alcuna attivit&agrave; del biosensore RFP o GFP nelle camere ovariche, anche se il biosensore &egrave; stato espresso nelle cellule muscolari tra le camere ovariche, come indicato dalla colorazione doppia con la colorazione per l'actina F. Tuttavia, le cellule delle camere ovariche sono in grado di attivare le caspasi se le mosche vengono trattate con uno stimolo di morte cellulare come la privazione di cibo o lo shock termico, che provoca la distruzione del nucleo e un'ampia attivazione delle caspasi, come evidenziato dall'immunomarcatura. Il marcatore delle caspasi appare probabilmente in una fase precoce e viene successivamente degradato durante la morte cellulare.Nel lobo ottico del cervello sano della mosca con tracciamento delle caspasi, l'attività del biosensore viene rilevata in cellule sane che, in base alla costaining con un marcatore pan-neuronale (anticorpo anti-ELAVI), sembrano essere neuroni. Questo suggerisce un ruolo dell'attività delle caspasi non apoptotica nei neuroni. Altre strategie possono essere utilizzate per dimostrare la sopravvivenza a lungo termine di cellule con attività delle caspasi, ad esempio spegnendo l'espressione del biosensore mediante strumenti genetici.Ad esempio, GalADTS inibisce Gal4. Il tracker delle caspasi riporta specificamente l'attività delle caspasi, mentre il biosensore di controllo non scindibile, DQVA, non viene attivato. L'unico segnale osservato nei controlli è dovuto all'autofluorescenza del cuticolo residuo sulle parti boccali e sull'ano, e del cibo ingerito, lievito, presente nel gozzo e nel cardias.Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il biosensore caspase tracker per seguire l'attività delle caspasi non apoptotiche nelle mosche della frutta. Durante il tentativo di questa procedura, è importante includere controlli negativi per distinguere i segnali del biosensore caspasi dalla autofluorescenza. Ad esempio, il cuticolo e i corpi adiposi producono una forte autofluorescenza nelle mosche, sia in presenza che in assenza del biosensore.La versione attuale del biosensore caspase tracker è progettata per rilevare la caspasi attiva DRICE. Altre applicazioni potrebbero includere biosensori specifici per diverse caspasi, sostituendo il sito di scissione riconosciuto da DRICE con il sito di scissione riconosciuto da altre caspasi.

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