Name: In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Scopri come rilevare l'attività caspasica non apoptotica in Drosophila melanogaster utilizzando il biosensore CaspaseTracker. Questo metodo consente di studiare le funzioni cellulari delle caspasi in organismi viventi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Polan Santos e Darren Obbard per le illustrazioni di Drosophila in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena per l&#39;uso del insectary JHMRI. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Fondazione Life Science Research (HLT), Comitato Università assegni di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Fondazione Life Sciences Research.

1. Preparazione di mosche CaspaseTracker <ol><li> Per preparare CaspaseTracker (DQVD) vola per esperimenti, eseguire questa croce: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS), trasferendo 7-10 femmina vergine (o maschio) mosche trasportano il substrato caspasi biosensore mCD8-DIAP1-GAL4 guidato dal promotore dell&#39;ubiquitina 35 insieme con lo stesso numero di maschio (o femmina) linea G-TRACE, che hanno la seconda bilanciatore cromosoma cyo per evitare letalità della combinazione omozigote di G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi&gt; Arresto&gt; GFP-NLS) 34. Inserire vola in un flaconcino alimento fresco con pasta di lievito fresco come fonte proteica. </li><li> Incubare i file a 18 ° C per 5 a 7 giorni (massimo 2 settimane) e quindi rimuovere il genitore aria dal flacone per evitare il sovraffollamento con la nuova progenie, e per impostare nuove fiale di allevamento. </li><li> Continuare incubazione a 18 ° C fino a quando progenie vola Eclose. Selezionare la non cyo [non-cURLy ala] progenie della corretta genotipo di CaspaseTracker, che sono transgenici per CaspaseTracker e G-35 oligoelementi. </li><li> Allo stesso tempo, generare controllo parentale mosche W118 non transgenici e caspasi-insensitive (DQVA) vola in parallelo per verificare specifiche RFP CaspaseTracker e GFP fluorescenza. </li><li> Eseguire la PCR genotipizzazione per confermare i file con CaspaseTracker utilizzando i primer: 5&#39;-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3&#39;-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producendo un prodotto di 3.897 bp. Per la genotipizzazione loci G-Trace, utilizzare i seguenti primer per GFP (474 ​​bp), 5&#39;-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3&#39;-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; per RFP (258 bp), 5&#39;-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3&#39;-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e per Flpase (655 bp), 5&#39;-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3&#39;-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TCT TTG CTG TCA C. Per la genotipizzazione GAL4 nel vettore pUWR (554 bp), 5&#39;-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3&#39;-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA. </li></ol> 2. Preparazione del tessuto, colorazione e montaggio <ol><li> Per dissezioni mosca, evitare tessuti dissezionati di attaccarsi alle punte di plastica per pipette e provette da centrifuga, consigli cappotto e tubi con albumina 1% di siero bovino (BSA) disciolti in acqua. </li><li> Dissect vola su un cuscinetto di silicone con pinze. <ol><li> Per evitare di danneggiare le punte delle pinze su una superficie dura quando si esegue la dissezione, eseguire la dissezione su una superficie di silicio. Per la realizzazione di lastre di dissezione silicone, sciogliere il silicio nel kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Materials List). Dopo la fusione il silicone, aggiungere 3 a 4 mL di un tessuto di diametro piatto di coltura 60mm. piatti di silicio possono essere riutilizzati. </li><li> Anestetizzare una mosca con CO 2, e trasferirlo ad una piastra in silicone con 1 ml di PBS freddo. Introdurre la CO 2 ad un flacone contenente il volo usando una cerbottana, e quindi trasferire al volo t anestetizzatoOA Pad che ha una fornitura di CO 2. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere la testa mosca, ed una seconda coppia di pinze per tirare torace nella direzione opposta per scollegare la testa mosca dal corpo di rivestimento senza danneggiare la connessione tra la testa e foregut. </li><li> Usare 2 paia di pinze per rimuovere le ali e le gambe dal torace. </li><li> Utilizzare un paio di pinze per tenere il torace, e un altro paio di pinze per tirare l&#39;addome per separarlo dal torace di nuovo senza danneggiare la connessione tra il foregut e midgut. </li><li> Sezionare organi interni compreso il cervello, intestino, tubuli malpighiani e le ovaie, come precedentemente dimostrato. 39-41 </li><li> Rimuovere tutti i pezzi della cuticola e gli organi di grasso con una pinza da questi tessuti producono forti autofluorescenza. La pazienza e la pratica sono tenuti a preparare un sistema di organi completo come mostrato. </li></ol></li><li> Trasferimento tessuti sezionati a 1,5 ml provette da centrifuga, e fissare i tessuti with 0,5 mL di 4% paraformaldeide in PBS (tampone fosfato salino) a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti con rotazione al buio per evitare sbiancamento RFP e GFP nei tessuti. Evitare la fissazione prolungata che può compromettere le successive risultati di colorazione. </li><li> Rimuovere la paraformaldeide delicatamente pipettando e lavare 3 volte con 0,5 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) a RT. </li><li> Permeabilize i tessuti con 0,5 ml PBST a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento. incubazione più brevi possono causare permeabilizzazione e il compromesso di colorazione risultati incompleti. <ol><li> Se è necessario ridurre la colorazione di fondo, non incubando tessuti in 0,5 mL PBST con 1% BSA, invece di PBS. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte con 0,5 mL PBST. </li><li> Per macchiare nuclei e filamentosa actina (F-actina), si applicano 0,5 ml PBST con 10 mg / mL di Hoechst 33342 blu colorante nucleare e 0,3 micron Alexa Fluor 633 falloidina F-actina macchia e incubare simultaneamente con i tessuti per 1 ora a RT with leggera rotazione nel buio. Evitare colorazione prolungata in quanto ciò aumenterà lo sfondo. <ol><li> Per immunocolorazione, incubare fisso e permeabilizzate tessuti con 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml di PBS notte a 4 ° C, macchia con diluizione 1: 100 di anticorpi anti-ELAV o con diluizione 1: 200 di anticorpi anti-caspasi-3 notte a 4 ° C (300 mL). Seguire dal corrispondente anticorpo secondario diluito 1: 100 e incubare per 1 a 3 ore a RT. Vedere Materiali Lista per specifiche informazioni di anticorpi. </li></ol></li><li> Lavare i tessuti 3 volte, ognuna per 5 min in 0,5 mL PBST con rotazione dolce. </li><li> Con una pipetta, rimuovere tutti PBST, e poi aggiungere 200 microlitri anti-candeggina agente di montaggio (vedi materiali) per coprire completamente i tessuti per 1-3 ore a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la notte. tessuti ottimali che hanno completamente assorbito l&#39;agente di montaggio si depositano sul fondo della provetta. </li><li> Pre-pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70% e trasferire i tessuti con l&#39;agente di montaggio per i glass slitta. </li><li> Posizionare con cura un vetrino di vetro sopra i tessuti. Applicare vaselina per il vetrino e la polizza di copertura per evitare di distruggere il tessuto da sovracompressione. Rimuovere l&#39;agente di fissaggio in più con la carta velina. </li><li> Sigillare la polizza di copertura mediante l&#39;applicazione di smalto lungo i bordi del vetrino per evitare la fuoriuscita di agenti di montaggio dai tessuti. </li></ol> 3. Microscopia confocale <ol><li> Utilizzare un confocale epi-microscopio a fluorescenza invertito. Tuttavia, microscopi up-destra possono anche essere utilizzati. Per i tessuti di immagine utilizzando piastrelle, mantenere la temperatura ambiente stabile per evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy a causa della dilatazione termica e la contrazione dei componenti. sistemi di controllo ambientale e sistemi di compensazione attenzione deriva aiutano ad evitare questo problema a causa di perdita di termo-equilibrio del sistema microscopio. </li><li> Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Prendete un paio di immagini di prova con bassa risoluzione (125 x 125 pixel) unad determinare il numero appropriato di piastrelle necessarie per coprire l&#39;intera regione di interesse (ROI). </li><li> Impostare il sistema di scansione microscopio per catturare immagini con risoluzione di scansione ad esempio 500 x 500 pixel. Selezionare l&#39;obiettivo come un 20X NA 0.8 o un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 per analizzare i tessuti attraverso vetrino, in modo che ciascuna delle immagini (piastrelle) sovrapposizioni del 20% su tutti i lati. </li><li> Impostare la sequenza di immagini da più lungo al più breve lunghezze d&#39;onda di eccitazione, come la luce di lunghezza d&#39;onda lunga provoca inferiore fotometabolismo. La sequenza dalla più lunga alla più corta lunghezza d&#39;onda di eccitazione è: (i) 633 nm per falloidina F-actina e per gli anticorpi caspasi attivate, (ii) 561 nm per RFP, (iii) 488 nm per GFP, e (iv) 405 nm per Hoechst macchia nucleare. </li><li> Durante l&#39;imaging, minimizzare l&#39;esposizione delle cellule alla eccitazione laser fluorescente durante il processo di imaging per evitare fotometabolismo riducendo l&#39;intensità del laser per ottenere immagini di alta qualità di tessuti. </li><li> Dopo iomaghi sono raccolti, l&#39;unione delle immagini utilizzando il software microscopio. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui illustriamo la costruzione e funzionamento interno di CaspaseTracker che facilitano il rilevamento di una diffusa attività di caspasi basale nei tessuti sani. I passaggi critici per rilevare l&#39;attività della caspasi non apoptotica in vivo sono: 1) la generazione di mosche con il transgene biosensore, 2) verificare la funzione giornalista specifiche caspasi con opportuni controlli, 3) praticando tecniche di dissezione di osservare tutti i sistemi di organi interni di adulti Drosophila, e 4) atti...

Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l&#39;adesione molte proteine ​​intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. 1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l&#39;apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemioterapia. 5 un diverso insieme di caspasi può causare la morte cellulare da processi non apoptotici distinte per stimolare l&#39;immunità innata. 6 Perciò, maggior parte della ricerca sulle caspasi è concentrata sulla loro funzioni pro-morte. È interessante notare che le prove nelle prime fasi del campo ha rivelato che gli stessi caspasi responsabili della promozione della morte cellulare hanno anche non-morte funzioni. Studi pionieristici hanno dimostrato che caspasi sono coinvolte in diverse funzioni cellulari in cellule sane, tra cui la regolazione della proliferazione cellulare e la migrazione durante l&#39;embriogenesi. 7-9 Caspases sono necessari per l&#39;individualizzazione spermatid in Drosophila 10,11, per bloccare un percorso di morte cellulare necroptotic alternativa nei topi 12,13, e per l&#39;elaborazione microRNA in C. elegans. 14,15 In forse la più lunga vissuto cellule, i neuroni, caspasi e altri macchinari apoptotica sono implicati nella regolazione dell&#39;attività neuronale da potatura terminazioni sinaptiche, un processo che si ritiene essere essenziale per rafforzare altri sinapsi per l&#39;apprendimento e la memoria 16. 18 E &#39;possibile che caspasi facilitare la potatura sinaptica da un tipo di mini-apoptosi di minuscole proiezioni neuronali senza morte cellulare intero. 19 Tuttavia, caspasi possono avere funzioni alternative non correlati ad eventi apoptosi-like. 20,21 duplice ruolos nella vita e la morte non sono riservate caspasi; BCL-2 proteine della famiglia e citocromo c hanno ruoli in energetica cellulari in cellule sane, ma sono anche parte del nucleo via apoptotica che viene attivato da molti tipi di stress cellulare. 22-25 Anche se non è provato, sembra logico che l&#39;evoluzione ha legato giorno : i processi di morte-posti di lavoro all&#39;interno delle stesse molecole per garantire la tempestiva eliminazione delle cellule inadatti o indesiderabili. Allo stato attuale, i meccanismi molecolari di attività caspasi non-apoptotica non sono comprese, e la misura dell&#39;attività di caspasi non apoptotica durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti non è noto. Una sfida importante è la difficoltà nel distinguere giornaliere di posti di lavoro da death-lavori di caspasi. In contrasto con l&#39;apoptosi e pyroptosis, quando l&#39;attività delle caspasi è amplificato da una cascata proteolitica, si prevede che i giorno-lavori di caspasi che si verifichi a livelli molto più bassi di attività enzimatica, probabilmente al di sotto di rilevamento da molti Techn disponibileologies. Prima del lavoro qui presentato, altri svilupparono una varietà di biosensori caspasi per scopi diversi. I biosensori SCAT (ad esempio, ECFP-DEVD-Venere) individuare rapidamente l&#39;attività della caspasi in tempo reale in cellule in coltura e tessuti animali utilizzando FRET. 26,27 Al caspasi scissione, la frazione GFP nucleare mirato di Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subisce rilocalizzazione subcellulare in pochi minuti quando la sua membrana plasmatica-tether viene scisso dalla caspasi. 28 allo stesso modo, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) rilocalizza dal citoplasma al nucleo su caspasi scissione. 29,30 Altro di recente, il cromoforo in iCasper è stato abilmente progettato per fluorescenza quando spaccati dalla caspasi, permettendo la rilevazione di attività biosensore in tempo reale nei neuroni di embrioni di Drosophila, ma soprattutto in associazione con la morte delle cellule di sviluppo. morte 31 caspasi-dipendente dei neuroni olfattivi durante l&#39;invecchiamento, è stato demonstvotata da immuno-rilevamento della forma caspasi-spaccati di biosensori CPV (ad esempio, mCD8-PARP-Venere). 32,33 È importante sottolineare che la forma attiva della caspasi-3 è stato rilevato in assenza di morte cellulare da immunostain sensibile a spine di neuroni in coltura, e nel soma utilizzando la fluorescenza caspasi-dipendente del colorante CellEvent giornalista nucleare, ma sono stati riscontrati a causa di foto-tossicità difficoltà, anche se la morte cellulare è stata ritardata fino a dopo l&#39;eliminazione della colonna vertebrale. 19 Pertanto, sono necessari nuovi biosensori caspasi per rilevare e tenere traccia delle cellule con l&#39;attività delle caspasi basale in vivo. Per superare queste difficoltà, abbiamo generato un romanzo a due biosensore colore caspasi, designato CaspaseTracker. Questa strategia combina una versione modificata del Drosophila caspasi-sensitive Apoliner biosensore 28 con la Drosophila G-TRACE sistema FRT ricombinasi 34 per etichettare definitivamente e monitorare le cellule in vivo. &lt;sup&gt; 35 Il sistema G-TRACE GAL4-attivato permette di livelli molto bassi di caspasi per attivare CaspaseTracker, con conseguente espressione RFP nel citoplasma e l&#39;espressione GFP nucleare mirata permanente in una cella che ha mai sperimentato l&#39;attività delle caspasi. 35 Questo sistema può etichettare cellule per tutta la vita in animali interi utilizzando Drosophila melanogaster, un sistema modello trattabili e ampiamente utilizzati per lo studio delle caspasi e morte cellulare. 36-38

<table><tbody><tr><td colspan="4">Consumabili e reagenti</td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>Mezzo di montaggio</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont pinzetta di grado biologico, acciaio inossidabile</td></tr><tr><td>Vetrini a goccia sospesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>Vetrini</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sonde</td> <td>molecolariH1399</td><td>Colorazione del DNA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 Sonde</td><td>molecolari</td> della falloidina <td>A22284</td><td>Colorazione dell'actina</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-elav di ratto-Elav-7E8A10</td><td>Studi sullo sviluppo Banca dell'ibridoma (DSHB)</td><td>ID del registro degli anticorpi:&nbsp; AB_528218&nbsp;</td><td>Colorazione per Drosophla ELAV pan-neuronale</td></tr><tr><td>Caspasi-3 (Asp175) anticorpo Cell</td><td>Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>Colorazione per frammento attivo di caspasi-3</td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza ProLong Gold</td><td>Life Technologies</td><td>P36934</td><td>per preservare i fluorofori&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36961</td><td>per preservare i fluorofori&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit elastomero siliconico SylGard 182</td><td>Dow Corning&nbsp;</td><td>Codice prodotto: 0001023934</td><td>per piastre</td></tr><tr> di dissezione<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LSM780 microscopio confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Carl Zeiss Stereomicroscopio Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>Drosophila Illuminatore</td></tr> per <tr><td>microscopio a doppio collo d'oca in fibra ottica, 150&nbsp; W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316</td><td>Sorgente luminosa</td></tr></tbody></table>

in vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in drosophila

In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila

Le caspasi sono i mediatori chiave della morte cellulare apoptotica attraverso la loro attività proteolitica. Quando le caspasi vengono attivate nelle cellule a livelli rilevabili dalle tecnologie disponibili, si presume generalmente che l'apoptosi si verifichi poco dopo. Le caspasi possono scindere molti componenti funzionali e strutturali per causare una rapida e completa distruzione cellulare in pochi minuti. Tuttavia, l'accumulo di prove indica che nelle cellule sane normali le stesse caspasi hanno altre funzioni, presumibilmente a livelli enzimatici più bassi. Gli studi sull'attività delle caspasi non apoptotiche sono stati ostacolati dalle difficoltà di rilevare bassi livelli di attività delle caspasi e di tracciare il destino cellulare finale in vivo. Qui, illustriamo l'uso di un reporter di caspasi ultrasensibile, CaspaseTracker, che etichetta in modo permanente le cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in animali interi. Questo biosensore CaspaseTracker in vivo a due colori per Drosophila melanogaster esprime transitoriamente la proteina fluorescente rossa (RFP) per indicare l'attività della caspasi recente o in corso ed esprime in modo permanente la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule che hanno sperimentato l'attività della caspasi in qualsiasi momento in passato ma che non sono morte. È importante sottolineare che questo biosensore in vivo caspasi-dipendente rivela prontamente la presenza di attività caspasica non apoptotica nei tessuti dei sistemi di organi in tutto il moscerino adulto. Ciò è dimostrato utilizzando dissezioni dell'intera montatura di singoli moscerini per rilevare l'attività del biosensore in cellule sane in tutto il cervello, l'intestino, i tubuli malpighiani, il cardias, i dotti ovarici e altri tessuti. CaspaseTracker rileva l'attività delle caspasi non apoptotiche nelle cellule longeve, poiché l'attività dei biosensori viene rilevata nei neuroni adulti e in altri tessuti almeno 10 giorni dopo l'attivazione della caspasi. Questo biosensore funge da strumento importante per scoprire i ruoli e i meccanismi molecolari dell'attività delle caspasi non apoptotiche negli animali vivi.

Ci sono due componenti fondamentali che permettono CaspaseTracker per rilevare l&#39;attività delle caspasi nelle cellule sane normali (Figura 1A). Il primo di questi è un 146 aminoacidi polipeptide caspasi-cleavable modello della caspasi biosensore Apoliner (Figura 1b). 28 Questo polipeptide è derivato da DIAP1 (Drosophila inibitore di apoptosi) contenente un singolo sito caspasi naturale che è scisso durante l&#39;apoptosi tipicamen...

Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Caspases are the key mediators of apoptotic cell death via their proteolytic activity. When caspases are activated in cells to levels detectable by ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è rilevare e monitorare l'attività delle caspasi non apoptotiche in animali vivi, utilizzando Drosophila melanogaster come modello. Le caspasi sono proteasi che scindono numerosi componenti cellulari inducendo la morte cellulare apoptotica. Pertanto, la presenza di caspasi attive all'interno delle cellule è spesso considerata indicativa di una morte cellulare imminente.Tuttavia, crescenti evidenze indicano che le stesse caspasi responsabili della morte cellulare svolgono anche ruoli normali nelle cellule sane. E questi ruoli quotidiani delle caspasi includono la regolazione dell'attività neuronale, delle funzioni mitocondriali e persino la soppressione di percorsi alternativi di morte cellulare. Esistono due principali difficoltà nello studio dei ruoli quotidiani delle caspasi.Prima di tutto, i livelli basali normali di attività delle caspasi sono generalmente al di sotto dei limiti di rilevamento delle tecnologie disponibili. In secondo luogo, anche quando l'attività basale delle caspasi è rilevabile, è difficile distinguerla dall'attività delle caspasi che porterà alla morte cellulare nel prossimo futuro. Per risolvere questo problema, a

in-vivo-biosensor-tracks-non-apoptotic-caspase-activity-in-drosophila

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Qui si descrive un metodo efficace per lo studio delle dinamiche di gioco cellulare per...

Vivere Imaging di apoptotica delle cellule libera nel corso<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogenesi

Alcune perturbazioni genetiche o l'esposizione a tossine possono interrompere i normali processi di sviluppo portando alla morte di specifici tipi di cellule. L'analisi della caspasi 3 attivata mediante immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di zebrafish rivela la localizzazione specifica dello stadio e del tessuto di cellule specificamente sottoposte ad apoptosi.

Analisi di apoptosi in embrioni di zebrafish da Whole-mount immunofluorescenza per rilevare caspasi 3 attivata

Il termine anastasi si riferisce al fenomeno in cui le cellule morenti invertono un processo di suicidio cellulare in una fase avanzata, si riparano e infine sopravvivono. Qui dimostriamo i protocolli per rilevare e tracciare le cellule sottoposte ad anastasi.

Strategie per l&#39;inseguimento Anastasis, una cellula di sopravvivenza fenomeno che Inverte Apoptosis

Anastasis è tecnicamente difficile da rilevare in vivo perché le cellule che hanno invertito il processo di morte cellulare possono essere morfologicamente indistinguibili dalle cellule sane normali. Qui descriviamo i protocolli per il rilevamento e il monitoraggio delle cellule che subiscono anastasis animali vivi utilizzando il nostro sistema di biosensore del CaspaseTracker recente sviluppato in vivo .

Rilevazione di Anastasis In Vivo di biosensore CaspaseTracker

Qui descriviamo un test di fagocitosi usando le cellule embrionali disperse di Drosophila . Ci permette di quantificare con facilità e precisione i livelli di fagocitosi in vivo e di identificare nuove molecole necessarie per la fagocitosi delle cellule apoptotiche.

Analisi della fagocitosi per le cellule apoptotiche in Drosophila Embrioni

Qui illustriamo come microscopia di localizzazione foto-attivata di singola molecola può essere effettuata sul terminale del nervo motore di un live Drosophila melanogaster terzo instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Questo protocollo descrive caspase bimolecolare fluorescenza complementazione (BiFC); un metodo basato su formazione immagine che può essere utilizzato per visualizzare indotta prossimità dei caspases iniziatore, che è il primo passo nella loro attivazione.

Illuminando le vie per l'attivazione di Caspase utilizzando complementazione bimolecolare fluorescenza

Qui presentiamo un protocollo per la riparazione della ferita di vivere-imaging e la risposta infiammatoria associata al alta risoluzione spazio-temporale in vivo. Questo metodo utilizza la fase pupal dello sviluppo della drosofila per consentire a lungo termine di imaging e di monitoraggio delle popolazioni di cellule specifiche nel tempo ed è compatibile con inattivazione del gene di RNAi-mediata efficiente.

Monitoraggio a lungo termine In Vivo della cellula infiammatoria dinamica all'interno della drosofila pupe

Qui presentiamo un protocollo per esprimere e purificare la Drosophila caspases ricombinante Dronc e Drice e il loro uso nei saggi di clivaggio in vitro .

In vitro Saggi di cleavage utilizzando Drosophila caspasi ricombinanti purificate per lo screening del substrato

Mesoscopici fluorescenza tomografia opera oltre i limiti di penetrazione del tessuto-sezionamento microscopia a fluorescenza. La tecnica è basata su multi-proiezione di illuminazione e una descrizione di trasporto fotone. Abbiamo dimostrato in vivo di tutto il corpo visualizzazione 3D della morfogenesi della GFP che esprimono ala dischi immaginale...

Mesoscopici fluorescenza per Tomografia In-vivo Imaging di sviluppo Drosophila</em

Scopri come rilevare l'attività caspasica non apoptotica in Drosophila melanogaster utilizzando il biosensore CaspaseTracker. Questo metodo consente di studiare le funzioni cellulari delle caspasi in organismi viventi.

In Vivo biosensore tracce non apoptotica caspasi attività in Drosophila

Esplora altri video