Name: Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Scopri la rilevazione di fluorescenza multicolore per microfluidica a gocce utilizzando fibre ottiche. Questo metodo compatto e modulare semplifica lo screening biologico ad alto rendimento e l'evoluzione diretta degli enzimi.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione DARPA numero 84389.01.44908, da un premio NSF CAREER (DBI-1253293), da una sovvenzione NIH per la ricerca esplorativa/di sviluppo (CA195709) e da NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01) e da una sovvenzione New Directions dal programma di allocazione delle risorse UCSF.

1. SU8 Maestro Fabrication <ol><li> Progettare le strutture microfluidica per la fabbricazione di tre strati che utilizzano software di progettazione e hanno i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli della progettazione dei dispositivi sono forniti in un riferimento collegato 6 e le geometrie dei canali nella figura 1. Gli strati dovrebbero includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche di ogni strato fabbricazione 8. </li><li> Posizionare un wafer di silicio del diametro di 3 pollici di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30 sec a 1.750 rpm, fornendo uno spessore di 80 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 min. Lasciare il wafer raffreddare a RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Esporre il wafer rivestito alla st maschera 1 strato sotto un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posizionare il wafer su una piastra C 135 ° per 1 min, poi raffreddare a RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 5000 rpm, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 40 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Allineare la maschera di livello 2 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 4 minuti e 30 secondi, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30sec a 1.000 giri, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 100 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Allineare la maschera di livello 3 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 9 minuti, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il wafer in isopropanolo e cuocere su una piastra C 135 ° per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio. </li></ol> 2. PDMS fabbricazione di dispositivi <ol><li> Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. degquando la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse. </li><li> Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il master e inserire di nuovo nel essiccatore per un ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 80 ° C per 80 min. </li><li> Tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato e pugni gli ingressi e le uscite fluidici con un pugno biopsia 0,75 millimetri. Il dispositivo deve essere tagliato in modo che i 120 micron e 220 micron geometrie alte sono accessibili dal lato del dispositivo. </li><li> Plasma trattare il dispositivo, con il lato caratteristica, insieme con un pre-puliti 2 pollici da 3 pollici vetrino a 1 mbar O 2 al plasma per 20 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Incollare il dispositivo PDMS ponendo il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato plasma trattata del vetrino. Posizionare il dispositivo in forno a 80 ° e cuocere il dispositivo montato per 40 min. </li><li> Render i canaliidrofobica utilizzando una siringa per sciacquare il dispositivo con un fluido di trattamento superficiale fluorurato. cuocere immediatamente il dispositivo a 80 ° C per 10 minuti per evaporare il solvente. </li></ol> 3. Preparazione di componenti ottici <ol><li> Preparare la fibra di eccitazione laser rimuovendo l&#39;isolamento dall&#39;ultima 5 mm a 105 micron nucleo, 125 rivestimento micron, NA = 0,22 fibra ottica. </li><li> Preparare il 2 ° laser a colori in fibra di eccitazione ripetendo 3.1 per un 2 ° fibra identici. </li><li> Preparare la fibra per raccogliere il segnale di fluorescenza ripetendo 3.1 di 200 micron nucleo, 225 rivestimento micron, NA = 0,39 fibra ottica. </li><li> Ispezionare le punte di tutte le fibre - se le punte non terminano in una superficie piana, ri-fendere le estremità con uno scriba fibra. </li><li> Attaccare un accoppiatore fibra laser a 50 mW, 405 nm laser e collegare uno dei 105 micron fibre nucleo al laser. Dirigere il fine spogliato verso il sensore della potenza del lasermetro, e usare le regolazioni fini del copulante laser per massimizzare la potenza del laser. </li><li> Ripetere 3.5 per un laser nm 50 mW, 473. </li><li> Montare un 446/510/581/703 nm filtri passa-banda quad sulla PMT utilizzando tubi di lenti per bloccare la luce del laser e trasmettere fluorescenza emessa. Fissare fibra accoppiatore in modo che la luce viaggia attraverso i filtri prima di colpire il PMT. </li><li> Fissare la fibra da 3,3 all&#39;unità assemblati in 3.7. </li></ol> 4. Offline misto Emulsione Generation <ol><li> Ottenere un dispositivo di microfluidica dropmaker fuoco flusso con un 60 micron x 60 micron orifizio. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con HFE 7500 oli con 2% fluoro ionico 9. </li><li> Riempire una serie di 1 ml siringhe con le seguenti combinazioni di fluoresceina (FITC) e destrano coniugato coloranti blu (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, e 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montare il dispositivo dropmaker sul palco di un micro invertitifar fronte e le siringhe acquosi e olio su pompe a siringa. Coppia le siringhe ai dispositivi che utilizzano PE-2 tubi. </li><li> Esecuzione pompe a siringa a 500 microlitri / hr per l&#39;olio e 250 microlitri / hr per le soluzioni acquose, crea una miscela di 80 micron goccioline contenenti le soluzioni da 4.3. Per ogni tipo di campione acquoso, utilizzare un dispositivo dropmaker fresca per evitare contaminazioni. Raccogliere ~ 200 ml di emulsione da ogni combinazione colorante in una siringa vuota. </li><li> Dopo 4 tipi goccioline sono stati raccolti in una singola siringa raccolta, mescolare l&#39;emulsione ripetutamente ruotando la siringa. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,6 con soluzioni acquose contenenti 0,1, 1, 10, e 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Fibra ottica Inserimento <ol><li> Posizionare il chip microfluidico fabbricato nella fase 2 sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di &lt;100 msec tempi di posa. </li><li> Lavorare con attenzione di lato, Insert la fibra accoppiata al laser 473 nm in 120 canale più lontano upstream micron, facendo attenzione a non forare attraverso il canale di flusso principale. </li><li> Inserire la fibra accoppiata al laser 405 nm nel 120 micron canale di alta lato più a valle, fornendo la spaziatura fibra di 300 micron. </li><li> Inserire la fibra PMT-accoppiato nel 220 micron di altezza canale normale per le due fibre di eccitazione laser. </li></ol> 6. Rilevazione fluorescenza di emulsioni misti <ol><li> Montare una siringa da 5 ml riempito con HFE 7500 con 2% fluoro ionico all&#39;ingresso dell&#39;olio distanziale del dispositivo di rilevazione con PE-2 tubi. </li><li> Montare la siringa contenente il misto FITC / CB emulsione su una pompa a siringa con orientamento verticale e di coppia di ingresso di gocce di reiniezione del dispositivo utilizzando PE-2 tubi. Collegare un tratto di tubo PE-2 dall&#39;uscita dispositivo ad un contenitore per rifiuti. </li><li> Prime dispositivo eseguendo ciascuna delle pompe a 1.000 ml / h fino a quando entrambipetrolio e goccioline sono visti da combinare regolarmente nel dispositivo e che scorre a valle. </li><li> Regolare le portate in modo tale che l&#39;olio distanziale corre a 6.000 ml / hr e le goccioline a 100 l / h, che fornisce notevole spaziatura tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento. </li><li> Accendere i laser, avviare il programma di acquisizione dei dati, e regolare il guadagno PMT per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base. Regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietto sono chiaramente visibili una singola, timetrace linearmente scalato. </li><li> Acquisire 60 sec del timetrace tensione di PMT ad almeno 20 kHz. Importare i dati in programma di calcolo come Matlab e misurare le altezze dei picchi dei doppietti registrati utilizzando lo script del programma di calcolo personalizzato. NOTA: Questo è fornito come informazioni supplementari. </li><li> Ripetere i passaggi 6,2-6,7 con il FITC solo emulsione mista creata in 4.7, con il laser 405 nm spento. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
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<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
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<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

rilevamento a fibre ottiche richiede l&#39;allineamento delle fibre ottiche rispetto ai canali di fluido. Poiché il nostro dispositivo utilizza canali di guida fabbricati con fotolitografia multistrato, collocamento di maschere rispetto all&#39;altro è di grande importanza. Se i canali di guida fibra sono troppo vicino al canale del fluido, vi è un potenziale di fuoriuscita di fluido; se i canali di guida sono situate troppo lontano o disallineata, il segnale di fluorescenza raccolte dalla fibra rilevamento può essere s...

Microfluidica gocciolina forniscono una piattaforma per alta biologia throughput compartimenti esperimenti in un gran numero di goccioline acquose sospese in un olio vettore 1. Goccioline sono stati utilizzati per applicazioni vari come singola analisi cella 2, la reazione a catena della polimerasi digitale (PCR) 3, ed enzimi evoluzione 4. saggi fluorescenti sono la modalità standard di rilevamento per microfluidica di gocce, come i loro segnali luminosi e tempo di risposta veloce sono compatibili con la rilevazione dei volumi goccioline sub-nanolitri a tassi kilohertz. Molte applicazioni richiedono il rilevamento della fluorescenza per almeno due colori simultaneamente. Per esempio, il nostro laboratorio esegue comunemente PCR-attivata esperimenti gocciolina ordinamento che utilizzano un canale di rilevamento per il risultato di un test, e utilizza uno sfondo tintura secondaria per rendere gocciolina test negativo numerabile 5. stazioni di rilevamento tipiche per microfluidica droplet sono based su microscopi epifluorescenza, e richiedono complicati sistemi di manipolazioni di luce per introdurre luce di eccitazione da laser spazio libero nel microscopio ad essere focalizzata sul campione. Dopo fluorescenza viene emessa da una goccia, la luce emessa fluoresced è filtrato in modo che ciascun canale di rilevamento utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) centrata su una banda di lunghezze d&#39;onda. sistemi di rilevamento ottico epifluorescenza microscopio a base di fornire una barriera all&#39;ingresso a causa della loro spese, la complessità e la manutenzione necessari. Fibre ottiche forniscono i mezzi per costruire un sistema di rilevamento semplificata e robusta, in quanto le fibre possono essere inseriti manualmente in dispositivi microfluidici, eliminando la necessità di instradamento specchio luce-based, e consentendo percorsi di luce da interfacciare tramite connettori di fibre ottiche. In questo articolo, si descrive l&#39;assemblaggio e la validazione di un sistema di compatto e modulare per eseguire il rilevamento della fluorescenza multicolore utilizzando una vasta gamma di fibre ottiche unda singola cellula fotoelettrica 6. Le fibre ottiche sono accoppiati alle singole laser e sono inseriti normale ad un canale di flusso a forma di L in offset spaziali regolare. Una fibra raccolta fluorescenza è orientato parallelamente alle regioni di eccitazione ed è collegato ad un singolo PMT. Poiché una gocciolina passa attraverso i raggi laser in tempi diversi, i dati registrati dal PMT mostra un temporale di offset che consente all&#39;utente di distinguere tra la fluorescenza emessa dopo la gocciolina viene eccitato da ciascun fascio laser distinti. Questo spostamento temporale elimina la necessità di separare la luce emessa PMT separate mediante una serie di specchi dicroici e filtri passa-banda. Per convalidare l&#39;efficacia del rivelatore, abbiamo quantificare la fluorescenza nelle popolazioni gocciolina incapsulanti tinture di colore e concentrazione diversa. La sensibilità del sistema è studiato per il rilevamento singolo colore fluoresceina, e dimostra la capacità di rilevare goccioline con concentrazioni fino a 0,1 nM, una sensibilità impr 200xovement rispetto agli approcci a base di fibre recenti riportati in letteratura 7.

<table><tbody><tr><td>Fotomaschere</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" wafer di silicone, tipo P, grado di prova vergine</td><td>Wafer universitari</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit di elastomeri siliconici</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>siringhe da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 aghi gaugue</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 tubo in polietilene</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Comunemente noto come HFE 7500 Istruzioni per la sintesi del</td></tr><tr><td>tensioattivo</td><td></td><td></td> ionico Krytox <td>in ref #10</td></tr><tr><td>Colorante blu a cascata coniugato a destrano</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>passa-banda quadruploSemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Porta in fibra</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>tubo dell'obiettivo</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Cavo patch con 200 &#956; m nucleo / 225 &#956; m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spelata e un connettore FC/PC</td> Cavo patch <td>personalizzato</td><td></td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td>con 105 &#956; nucleo m / 125 &#956; m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spellata e un connettore FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m utensile spelafili</td><td>per fibre Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m strumento di spelatura della fibra</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>adattatore fibra laser</td><td>OptoEngine</td><td>FC / PC Adattatore</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributore per laser CNI</td></tr><tr><td>473 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolore fluorescenza detection per droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

I saggi di fluorescenza sono le letture più comuni utilizzate nella microfluidica delle goccioline grazie ai loro segnali luminosi e alla rapida risposta temporale. Applicazioni come i saggi multiplex, l'evoluzione enzimatica e la selezione cellulare potenziata dalla biologia molecolare richiedono la rilevazione di due o più colori di fluorescenza. I sistemi di rilevamento multicolore standard che accoppiano i laser a spazio libero ai microscopi a epifluorescenza sono ingombranti, costosi e di difficile manutenzione. In questo articolo, descriviamo uno schema per eseguire il rilevamento multicolore eccitando regioni discrete di un canale microfluidico con laser accoppiati a fibre ottiche. La luce emessa viene raccolta da una fibra ottica accoppiata a un singolo fotorivelatore. Poiché l'eccitazione si verifica in diverse posizioni spaziali, l'identità della luce emessa può essere codificata come uno spostamento temporale, eliminando la necessità di schemi di filtraggio della luce più complicati. Il sistema è stato utilizzato per rilevare popolazioni di goccioline contenenti quattro combinazioni uniche di coloranti e per rilevare concentrazioni sub-nanomolari di fluoresceina.

Realizzazione di un dispositivo PDMS che permette l&#39;inserimento di fibre ottiche richiede una procedura di fotolitografia multistep per creare canali di diversa altezza (figura 1). Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è filata su un wafer di silicio e modellato usando una maschera per creare la geometria gestione dei fluidi. Quindi, un ulteriore strato di 40 micron di SU-8 è filata sul wafer, e modellato usando una seconda maschera per creare caratteristich...

Il rilevamento della fluorescenza multicolore nella microfluidica delle goccioline coinvolge tipicamente sistemi di rilevamento basati su microscopi a epifluorescenza ingombranti e complessi. Qui descriviamo uno schema di rilevamento multicolore compatto e modulare che utilizza una serie di fibre ottiche per codificare temporalmente i dati multicolore raccolti da un singolo fotorivelatore.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un'applicazione semplice del rilevamento della fluorescenza in microfluidica a goccioline mediante l'uso di fibre ottiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella selezione biologica ad alto rendimento, come l'identificazione di fenotipi rari e l'evoluzione diretta di enzimi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'applicazione semplice ed economica del rilevamento della fluorescenza in microfluidica a goccioline.Per iniziare, posizionare una piastrina di silicio con diametro di tre pollici, preventivamente pulita, sul mandrino a vuoto di un spin coater. Successivamente, applicare un millilitro di SU-8 3050 al centro della piastrina e far ruotare la piastrina per ottenere uno strato di photoresist spesso 80 micrometri. Rimuovere la piastrina rivestita dallo spin coater e posizionarla su una piastra riscaldata preriscaldata a 135 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, rimuovere la piastrina e lasciarla raffreddare nuovamente a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare la piastrina su una superficie piana e allineare la maschera del primo strato sulla piastrina. Esporre la piastrina a un LED collimato da 190 milliwatt e 365 nanometri per tre minuti.Dopo l'esposizione, posizionare la wafer su una piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per un minuto e quindi lasciarla raffreddare fino alla temperatura ambiente. Una volta raffreddata, riposizionare la wafer sullo spin coater e fissarla sul mandrino. Applicare un ulteriore millilitro di SU-8 3050 al centro della wafer e farla ruotare per 20 secondi a 500 giri al minuto.seguito da 30 secondi a 5.000 giri al minuto. Successivamente, cuocere la wafer su una piastra riscaldata. Lasciarla raffreddare fino alla temperatura ambiente e quindi riposizionarla sulla superficie di allineamento della maschera.Utilizzare il microscopio stereoscopico per allineare manualmente la maschera del secondo strato con i segni di allineamento precedentemente realizzati sul wafer. Una volta correttamente allineata, esporre il wafer rivestito per 4 minuti e 1/2 utilizzando le stesse condizioni di prima. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddare il wafer e riattaccarlo al rivestitore a centrifuga.Applicare un millilitro di SU-8 3050 sulla wafer per la terza volta e far ruotare per aggiungere ulteriori 100 micrometri di fotoresist. Rimuovere la wafer e cuocerla su una piastra a 135 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, raffreddarla a temperatura ambiente e posizionarla sulla superficie di allineamento.Allineare la maschera del terzo strato con la geometria precedente ed esporre la wafer rivestita utilizzando le stesse condizioni per nove minuti. Dopo l'esposizione, posizionare la wafer su una piastra riscaldata a 135 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddarla a temperatura ambiente. Una volta raffreddata, sviluppare le maschere immergendo la wafer in un bagno di sviluppatore sotto agitazione per 30 minuti.Infine, lavare la piastrina in isopropanolo e quindi riscaldarla un'ultima volta per un minuto su una piastra riscaldante a 135 gradi Celsius. Conservare il master sviluppato in una capsula di Petri da 100 millimetri fino alla stampatura. Preparare una miscela 10:1 di PDMS combinando 50 grammi di base siliconica con cinque grammi di agente indurente in un bicchiere di plastica.Mescolare il contenuto con uno strumento rotativo, quindi sottoporre la miscela a degasaggio all'interno di un essiccatore per 30 minuti, oppure fino alla completa rimozione delle bolle d'aria. Versare il PDMS degasato sul master preparato in modo da ottenere uno spessore di tre millimetri. Successivamente, riposizionare la piastra di Petri nell'essiccatore per un ulteriore degasaggio.Dopo aver rimosso tutte le bolle, cuocere il dispositivo a 80 gradi Celsius per 80 minuti. Una volta raffreddato, tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi in modo che entrambe le telegeometrie da 120 micrometri e 220 micrometri siano accessibili dal lato del dispositivo. Successivamente, praticare gli ingressi e le uscite fluidiche con un punzone per biopsie da 0,75 mm.Trattare al plasma il dispositivo con il lato delle caratteristiche rivolto verso l'alto insieme a una lamella di vetro pre-pulita e plasma di ossigeno a 1 millibar per 20 secondi in un pulitore al plasma da 300 watt. Assemblare il dispositivo appoggiando saldamente il lato stampato del dispositivo in PDMS sul lato trattato al plasma della lamella di vetro. Successivamente, posizionare il dispositivo in un forno a 80 gradi Celsius e cuocere il dispositivo assemblato per 40 minuti.Dopo la cottura, utilizzare una siringa per far passare nel dispositivo un liquido fluorurato per il trattamento superficiale, in modo da rendere i canali idrofobi. Successivamente, cuocere immediatamente il dispositivo a 80 gradi Celsius per 10 minuti per far evaporare il solvente. Preparare due fibre di eccitazione laser rimuovendo l'isolamento dagli ultimi cinque millimetri delle fibre ottiche.Inoltre, preparare la fibra per la raccolta del segnale fluorescente rimuovendo l'isolamento dagli ultimi cinque millimetri di una fibra ottica più grande. Ispezionare le estremità di tutte le fibre al microscopio. Se le estremità non terminano con una superficie piana, rifare la cesoiatura delle estremità con una sonda per fibre.Successivamente, collegare un accoppiatore per fibra laser a un laser da 50 milliwatt a 405 nanometri e fissare una delle fibre con anima da 105 micrometri al laser. Indirizzare l'estremità sguainata del sensore di un misuratore di potenza laser e utilizzare i regolatori fini dell'accoppiatore laser per massimizzare la potenza del laser. Eseguire lo stesso procedimento per tarare l'altra fibra utilizzando un laser da 50 milliwatt a 473 nanometri.Quindi, montare un filtro a quattro bande passanti sul tubo fotomoltiplicatore utilizzando tubi obiettivo per bloccare la luce laser e trasmettere la fluorescenza emessa. Collegare un accoppiatore a fibra in modo che la luce passi attraverso i filtri prima di raggiungere il tubo fotomoltiplicatore. Successivamente, collegare la fibra di raccolta all'accoppiatore a fibra.Posizionare il chip microfluidico realizzato sul piatto di un microscopio invertito abbinato a una fotocamera digitale in grado di raggiungere velocità dell'otturatore di almeno 100 microsecondi. Lavorando con attenzione dai lati, inserire la fibra ottica collegata al laser a 473 nanometri nel canale di 120 micrometri più a monte. Prestare attenzione a non perforare fino al canale di flusso principale.Quindi, inserire la fibra accoppiata al laser a 405 nanometri nel canale laterale più a valle alto 120 micrometri, garantendo una distanza tra le fibre di 300 micrometri. Infine, inserire la fibra più grande accoppiata al fotomoltiplicatore nel canale alto 220 micrometri, perpendicolare alle due fibre di eccitazione laser. Riempire una siringa da cinque millilitri con HFE 7500 contenente il 2% di fluorosurfattante ionico e montarla sull'ingresso dell'olio distanziatore del dispositivo di rilevamento utilizzando un tubo PE2.Successivamente, riempire una siringa con un'emulsione mista di FITC e colorante blu e montarla su una pompa per siringhe orientata verticalmente, collegata al dispositivo come ingresso per la reiniezione delle goccioline, utilizzando un tubo PE2. Collegare un tratto di tubo PE dall'uscita del dispositivo a un contenitore di rifiuti. Quindi, preparare il dispositivo facendo funzionare ciascuna delle pompe a 1.000 microlitri all'ora fino a quando si osserva che olio e goccioline si combinano regolarmente all'interno del dispositivo e scorrono a valle.Regolare le portate in modo che l'olio distanziatore fluisca a 6.000 microlitri all'ora e le goccioline a 100 microlitri all'ora, garantendo un'ampia separazione tra le goccioline in transito attraverso la regione di rilevamento. Successivamente, accendere i laser e avviare il programma di acquisizione dati. Poi, regolare il guadagno del tubo fotomoltiplicatore in modo da ottenere segnali superiori a 100 volte il rumore di fondo della linea di base.Infine, regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietti siano chiaramente visibili su un singolo tracciato temporale con scala lineare. Una goccia che scorre attraverso il canale di rilevamento incontra regioni discrete di eccitazione davanti a ciascuna delle fibre ottiche accoppiate al laser. La fibra di rilevamento registra la fluorescenza emessa con uno spostamento temporale, il cui picco di separazione è correlato al tempo necessario a una goccia per spostarsi da una regione di eccitazione alla successiva.Questo elimina la necessità di ulteriori filtri ottici e di tubi fotomoltiplicatori separati. L'efficacia del sistema di rilevamento è stata verificata rilevando un'emulsione mista di goccioline contenenti coloranti che eccitano a 405 nanometri e a 473 nanometri. Questo grafico mostra una chiara separazione tra i quattro tipi di goccioline reiniettate quando vengono fatte fluire a circa 50 hertz.La gamma dinamica e la sensibilità assoluta del rivelatore sono state analizzate misurando le goccioline contenenti solo fluoresceina. I dati mostrano la capacità del sistema di rilevare concentrazioni di colorante comprese tra 0,1 e 100 nanomolari. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come implementare un sistema di rilevamento della fluorescenza semplice e compatto, utilizzando un array di fibre ottiche inserite e un singolo fotodetettore.

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