Name: Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Scopri la rilevazione di fluorescenza multicolore per microfluidica a gocce utilizzando fibre ottiche. Questo metodo compatto e modulare semplifica lo screening biologico ad alto rendimento e l'evoluzione diretta degli enzimi.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione DARPA numero 84389.01.44908, da un premio NSF CAREER (DBI-1253293), da una sovvenzione NIH per la ricerca esplorativa/di sviluppo (CA195709) e da NIH New Innovator Awards (HD080351, DP2-AR068129-01) e da una sovvenzione New Directions dal programma di allocazione delle risorse UCSF.

1. SU8 Maestro Fabrication <ol><li> Progettare le strutture microfluidica per la fabbricazione di tre strati che utilizzano software di progettazione e hanno i disegni stampati da un fornitore su pellicola circuito con risoluzione di 10 micron. I dettagli della progettazione dei dispositivi sono forniti in un riferimento collegato 6 e le geometrie dei canali nella figura 1. Gli strati dovrebbero includere segni di allineamento per aiutare colloca caratteristiche di ogni strato fabbricazione 8. </li><li> Posizionare un wafer di silicio del diametro di 3 pollici di pre-pulizia su un dispositivo a induzione giro e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30 sec a 1.750 rpm, fornendo uno spessore di 80 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 min. Lasciare il wafer raffreddare a RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Esporre il wafer rivestito alla st maschera 1 strato sotto un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posizionare il wafer su una piastra C 135 ° per 1 min, poi raffreddare a RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, quindi 30 secondi a 5000 rpm, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 40 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Allineare la maschera di livello 2 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 4 minuti e 30 secondi, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Posizionare la cialda sul dispositivo a induzione di spin e accendere il vuoto di apporre al mandrino. Applicare 1 ml di SU8-3050 al centro della fetta e centrifugare per 20 sec a 500 rpm, poi 30sec a 1.000 giri, risultando in un livello che fornisce uno spessore supplementare di 100 micron. </li><li> Rimuovere il wafer e cuocere su una piastra C 135 ° per 30 minuti, poi raffreddare per RT prima di passare alla fase successiva. </li><li> Allineare la maschera di livello 3 ° sulla geometria di fantasia in 1.3 ed esporre il wafer rivestito per un collimato 190 mW, 365 nm LED per 3 min. Dopo l&#39;esposizione, posto su una piastra C 135 ° per 9 minuti, poi raffreddare per RT prima di procedere alla fase successiva. </li><li> Sviluppare le maschere immergendo in un bagno agitata di propilenglicole monometiletere acetato per 30 min. Lavare il wafer in isopropanolo e cuocere su una piastra C 135 ° per 1 min. Posizionare il maestro sviluppato in una capsula di Petri 100 mm per polidimetilsilossano (PDMS) stampaggio. </li></ol> 2. PDMS fabbricazione di dispositivi <ol><li> Preparare 10: 1 PDMS combinando 50 g di base siliconica con 5 g di catalizzatore in una tazza di plastica. Mescolare il contenuto con un utensile rotante dotato di un bastoncino. degquando la miscela in un essiccatore per 30 minuti, o fino a quando tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse. </li><li> Versare il PDMS per dare uno spessore di 3 mm sopra il master e inserire di nuovo nel essiccatore per un ulteriore degasaggio. Una volta che tutte le bolle vengono rimossi, cuocere il dispositivo a 80 ° C per 80 min. </li><li> Tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi e posto su una superficie pulita con il lato modellato e pugni gli ingressi e le uscite fluidici con un pugno biopsia 0,75 millimetri. Il dispositivo deve essere tagliato in modo che i 120 micron e 220 micron geometrie alte sono accessibili dal lato del dispositivo. </li><li> Plasma trattare il dispositivo, con il lato caratteristica, insieme con un pre-puliti 2 pollici da 3 pollici vetrino a 1 mbar O 2 al plasma per 20 secondi in un pulitore di plasma di 300 W. Incollare il dispositivo PDMS ponendo il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato plasma trattata del vetrino. Posizionare il dispositivo in forno a 80 ° e cuocere il dispositivo montato per 40 min. </li><li> Render i canaliidrofobica utilizzando una siringa per sciacquare il dispositivo con un fluido di trattamento superficiale fluorurato. cuocere immediatamente il dispositivo a 80 ° C per 10 minuti per evaporare il solvente. </li></ol> 3. Preparazione di componenti ottici <ol><li> Preparare la fibra di eccitazione laser rimuovendo l&#39;isolamento dall&#39;ultima 5 mm a 105 micron nucleo, 125 rivestimento micron, NA = 0,22 fibra ottica. </li><li> Preparare il 2 ° laser a colori in fibra di eccitazione ripetendo 3.1 per un 2 ° fibra identici. </li><li> Preparare la fibra per raccogliere il segnale di fluorescenza ripetendo 3.1 di 200 micron nucleo, 225 rivestimento micron, NA = 0,39 fibra ottica. </li><li> Ispezionare le punte di tutte le fibre - se le punte non terminano in una superficie piana, ri-fendere le estremità con uno scriba fibra. </li><li> Attaccare un accoppiatore fibra laser a 50 mW, 405 nm laser e collegare uno dei 105 micron fibre nucleo al laser. Dirigere il fine spogliato verso il sensore della potenza del lasermetro, e usare le regolazioni fini del copulante laser per massimizzare la potenza del laser. </li><li> Ripetere 3.5 per un laser nm 50 mW, 473. </li><li> Montare un 446/510/581/703 nm filtri passa-banda quad sulla PMT utilizzando tubi di lenti per bloccare la luce del laser e trasmettere fluorescenza emessa. Fissare fibra accoppiatore in modo che la luce viaggia attraverso i filtri prima di colpire il PMT. </li><li> Fissare la fibra da 3,3 all&#39;unità assemblati in 3.7. </li></ol> 4. Offline misto Emulsione Generation <ol><li> Ottenere un dispositivo di microfluidica dropmaker fuoco flusso con un 60 micron x 60 micron orifizio. </li><li> Riempire una siringa da 1 ml con HFE 7500 oli con 2% fluoro ionico 9. </li><li> Riempire una serie di 1 ml siringhe con le seguenti combinazioni di fluoresceina (FITC) e destrano coniugato coloranti blu (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB, e 10 nM FITC / 100 nM CB. </li><li> Montare il dispositivo dropmaker sul palco di un micro invertitifar fronte e le siringhe acquosi e olio su pompe a siringa. Coppia le siringhe ai dispositivi che utilizzano PE-2 tubi. </li><li> Esecuzione pompe a siringa a 500 microlitri / hr per l&#39;olio e 250 microlitri / hr per le soluzioni acquose, crea una miscela di 80 micron goccioline contenenti le soluzioni da 4.3. Per ogni tipo di campione acquoso, utilizzare un dispositivo dropmaker fresca per evitare contaminazioni. Raccogliere ~ 200 ml di emulsione da ogni combinazione colorante in una siringa vuota. </li><li> Dopo 4 tipi goccioline sono stati raccolti in una singola siringa raccolta, mescolare l&#39;emulsione ripetutamente ruotando la siringa. </li><li> Ripetere i passaggi 4,2-4,6 con soluzioni acquose contenenti 0,1, 1, 10, e 100 nM FITC in PBS. </li></ol> 5. Fibra ottica Inserimento <ol><li> Posizionare il chip microfluidico fabbricato nella fase 2 sul palcoscenico di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di &lt;100 msec tempi di posa. </li><li> Lavorare con attenzione di lato, Insert la fibra accoppiata al laser 473 nm in 120 canale più lontano upstream micron, facendo attenzione a non forare attraverso il canale di flusso principale. </li><li> Inserire la fibra accoppiata al laser 405 nm nel 120 micron canale di alta lato più a valle, fornendo la spaziatura fibra di 300 micron. </li><li> Inserire la fibra PMT-accoppiato nel 220 micron di altezza canale normale per le due fibre di eccitazione laser. </li></ol> 6. Rilevazione fluorescenza di emulsioni misti <ol><li> Montare una siringa da 5 ml riempito con HFE 7500 con 2% fluoro ionico all&#39;ingresso dell&#39;olio distanziale del dispositivo di rilevazione con PE-2 tubi. </li><li> Montare la siringa contenente il misto FITC / CB emulsione su una pompa a siringa con orientamento verticale e di coppia di ingresso di gocce di reiniezione del dispositivo utilizzando PE-2 tubi. Collegare un tratto di tubo PE-2 dall&#39;uscita dispositivo ad un contenitore per rifiuti. </li><li> Prime dispositivo eseguendo ciascuna delle pompe a 1.000 ml / h fino a quando entrambipetrolio e goccioline sono visti da combinare regolarmente nel dispositivo e che scorre a valle. </li><li> Regolare le portate in modo tale che l&#39;olio distanziale corre a 6.000 ml / hr e le goccioline a 100 l / h, che fornisce notevole spaziatura tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento. </li><li> Accendere i laser, avviare il programma di acquisizione dei dati, e regolare il guadagno PMT per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base. Regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi doppietto sono chiaramente visibili una singola, timetrace linearmente scalato. </li><li> Acquisire 60 sec del timetrace tensione di PMT ad almeno 20 kHz. Importare i dati in programma di calcolo come Matlab e misurare le altezze dei picchi dei doppietti registrati utilizzando lo script del programma di calcolo personalizzato. NOTA: Questo è fornito come informazioni supplementari. </li><li> Ripetere i passaggi 6,2-6,7 con il FITC solo emulsione mista creata in 4.7, con il laser 405 nm spento. </li></ol>

<ol><li>Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li>
<li>Mazutis, L., Gilbert, J., Ung, W. L., Weitz, D. A., Griffiths, A. D., Heyman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+sorting+using+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics.</a> Nat Protocol. 8 (5), 870-891 (2013).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (2011).</li>
<li>Agresti, J. J., Antipov, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-throughput+screening+in+drop-based+microfluidics+for+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (14), 4004(2010).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picoinjection+Enables+Digital+Detection+of+RNA+with+Droplet+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Picoinjection Enables Digital Detection of RNA with Droplet RT-PCR.</a> PLOS ONE. 8 (4), (2013).</li>
<li>Cole, R. H., de Lange, N., Gartner, Z. J., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compact+and+modular+multicolour+fluorescence+detector+for+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Compact and modular multicolour fluorescence detector for droplet microfluidics.</a> Lab Chip. 15 (13), 2754-2758 (2015).</li>
<li>Guo, F., Lapsley, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+droplet-based%2C+optofluidic+device+for+high-throughput%2C+quantitative+bioanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">A droplet-based, optofluidic device for high-throughput, quantitative bioanalysis.</a> Anal Chem. 84, 10745-10749 (2012).</li>
<li>Lithography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html">https://www.memsnet.org/mems/processes/lithography.html</a> (2015).</li>
<li>DeJournette, C. J., Kim, J., Medlen, H., Li, X., Vincent, L. J., Easley, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+Biocompatible+Oil-Water+Interfaces+without+Synthesis%3A+Direct+Interactions+between+Primary+Amines+and+Carboxylated+Perfluorocarbon+Surfactants%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Creating Biocompatible Oil-Water Interfaces without Synthesis: Direct Interactions between Primary Amines and Carboxylated Perfluorocarbon Surfactants.</a> Anal Chem. 85 (21), (2013).</li>
<li>Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+completely+in+vitro+ultrahigh-throughput+droplet-based+microfluidic+screening+system+for+protein+engineering+and+directed+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution.</a> Lab Chip. 12, 882(2012).</li>
<li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh-Throughput+Mammalian+Single-Cell+Reverse-Transcriptase+Polymerase+Chain+Reaction+in+Microfluidic+Drops%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh-Throughput Mammalian Single-Cell Reverse-Transcriptase Polymerase Chain Reaction in Microfluidic Drops.</a> Anal Chem. 85 (16), 8016-8021 (2013).</li>
<li>Martini, J., Recht, M. I., Huck, M., Bern, M. W., Johnson, N. M., Kiesel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+encoded+multicolor+fluorescence+detection+in+a+microfluidic+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time encoded multicolor fluorescence detection in a microfluidic flow cytometer.</a> Lab Chip. 12 (23), 5057-5062 (2012).</li>
<li>Bliss, C. L., McMullin, J. N., Backhouse, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fabrication+of+a+microfluidic+device+with+integrated+optical+waveguides+for+DNA+fragment+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid fabrication of a microfluidic device with integrated optical waveguides for DNA fragment analysis.</a> Lab Chip. 7 (10), 1280-1287 (2007).</li>
<li>Martinez Vazquez, R., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sensing+in+microfluidic+lab-on-a-chip+by+femtosecond-laser-written+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optical sensing in microfluidic lab-on-a-chip by femtosecond-laser-written waveguides.</a> Anal Bioanal Chem. 393, 1209-1216 (2009).</li>
<li>Vishnubhatla, K. C., Bellini, N., Ramponi, R., Cerullo, G., Osellame, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape+control+of+microchannels+fabricated+in+fused+silica+by+femtosecond+laser+irradiation+and+chemical+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Shape control of microchannels fabricated in fused silica by femtosecond laser irradiation and chemical etching.</a> Opt Express. 17 (10), 8685-8695 (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

rilevamento a fibre ottiche richiede l&#39;allineamento delle fibre ottiche rispetto ai canali di fluido. Poiché il nostro dispositivo utilizza canali di guida fabbricati con fotolitografia multistrato, collocamento di maschere rispetto all&#39;altro è di grande importanza. Se i canali di guida fibra sono troppo vicino al canale del fluido, vi è un potenziale di fuoriuscita di fluido; se i canali di guida sono situate troppo lontano o disallineata, il segnale di fluorescenza raccolte dalla fibra rilevamento può essere s...

Microfluidica gocciolina forniscono una piattaforma per alta biologia throughput compartimenti esperimenti in un gran numero di goccioline acquose sospese in un olio vettore 1. Goccioline sono stati utilizzati per applicazioni vari come singola analisi cella 2, la reazione a catena della polimerasi digitale (PCR) 3, ed enzimi evoluzione 4. saggi fluorescenti sono la modalità standard di rilevamento per microfluidica di gocce, come i loro segnali luminosi e tempo di risposta veloce sono compatibili con la rilevazione dei volumi goccioline sub-nanolitri a tassi kilohertz. Molte applicazioni richiedono il rilevamento della fluorescenza per almeno due colori simultaneamente. Per esempio, il nostro laboratorio esegue comunemente PCR-attivata esperimenti gocciolina ordinamento che utilizzano un canale di rilevamento per il risultato di un test, e utilizza uno sfondo tintura secondaria per rendere gocciolina test negativo numerabile 5. stazioni di rilevamento tipiche per microfluidica droplet sono based su microscopi epifluorescenza, e richiedono complicati sistemi di manipolazioni di luce per introdurre luce di eccitazione da laser spazio libero nel microscopio ad essere focalizzata sul campione. Dopo fluorescenza viene emessa da una goccia, la luce emessa fluoresced è filtrato in modo che ciascun canale di rilevamento utilizza un tubo fotomoltiplicatore (PMT) centrata su una banda di lunghezze d&#39;onda. sistemi di rilevamento ottico epifluorescenza microscopio a base di fornire una barriera all&#39;ingresso a causa della loro spese, la complessità e la manutenzione necessari. Fibre ottiche forniscono i mezzi per costruire un sistema di rilevamento semplificata e robusta, in quanto le fibre possono essere inseriti manualmente in dispositivi microfluidici, eliminando la necessità di instradamento specchio luce-based, e consentendo percorsi di luce da interfacciare tramite connettori di fibre ottiche. In questo articolo, si descrive l&#39;assemblaggio e la validazione di un sistema di compatto e modulare per eseguire il rilevamento della fluorescenza multicolore utilizzando una vasta gamma di fibre ottiche unda singola cellula fotoelettrica 6. Le fibre ottiche sono accoppiati alle singole laser e sono inseriti normale ad un canale di flusso a forma di L in offset spaziali regolare. Una fibra raccolta fluorescenza è orientato parallelamente alle regioni di eccitazione ed è collegato ad un singolo PMT. Poiché una gocciolina passa attraverso i raggi laser in tempi diversi, i dati registrati dal PMT mostra un temporale di offset che consente all&#39;utente di distinguere tra la fluorescenza emessa dopo la gocciolina viene eccitato da ciascun fascio laser distinti. Questo spostamento temporale elimina la necessità di separare la luce emessa PMT separate mediante una serie di specchi dicroici e filtri passa-banda. Per convalidare l&#39;efficacia del rivelatore, abbiamo quantificare la fluorescenza nelle popolazioni gocciolina incapsulanti tinture di colore e concentrazione diversa. La sensibilità del sistema è studiato per il rilevamento singolo colore fluoresceina, e dimostra la capacità di rilevare goccioline con concentrazioni fino a 0,1 nM, una sensibilità impr 200xovement rispetto agli approcci a base di fibre recenti riportati in letteratura 7.

<table><tbody><tr><td>Fotomaschere</td><td>CadArt Servcies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3" wafer di silicone, tipo P, grado di prova vergine</td><td>Wafer universitari</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3035</td><td>Microchem</td><td>Y311074</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Microchem</td><td>Y111072</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit di elastomeri siliconici</td><td>Krayden</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>siringhe da 1 ml</td><td>BD</td><td></td><td></td>309628</tr><tr><td>siringhe da 10 ml</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>27 aghi gaugue</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>PE 2 tubo in polietilene</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>B31695-PE/2</td><td></td></tr><tr><td>Novec 7500</td><td>Fisher Scientific</td><td>98-0212-2928-5</td><td>Comunemente noto come HFE 7500 Istruzioni per la sintesi del</td></tr><tr><td>tensioattivo</td><td></td><td></td> ionico Krytox <td>in ref #10</td></tr><tr><td>Colorante blu a cascata coniugato a destrano</td><td>Life Technologies</td><td>D-1976</td><td></td></tr><tr><td>Sale sodico di fluoresceina</td><td>Sigma</td><td>28803</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>passa-banda quadruploSemrock</td><td>FF01-446/510/581/703-25</td><td></td></tr><tr><td>PMT</td><td>Thorlabs</td><td>PMM02</td><td></td></tr><tr><td>Porta in fibra</td><td>Thorlabs</td><td>PAFA-X-4-A</td><td></td></tr><tr><td>tubo dell'obiettivo</td><td>Thorlabs</td><td>SM1L05</td><td></td></tr><tr><td>Cavo patch con 200 &#956; m nucleo / 225 &#956; m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spelata e un connettore FC/PC</td> Cavo patch <td>personalizzato</td><td></td><td>Thorlabs</td></tr><tr><td>con 105 &#956; nucleo m / 125 &#956; m rivestimento in fibra ottica con un'estremità spellata e un connettore FC/PC</td><td>Thorlabs</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>125 &#956; m utensile spelafili</td><td>per fibre Thorlabs</td><td>T08S13</td><td></td></tr><tr><td>225 &#956; m strumento di spelatura della fibra</td><td>Thorlabs</td><td>T10S13</td><td></td></tr><tr><td>adattatore fibra laser</td><td>OptoEngine</td><td>FC / PC Adattatore</td><td></td></tr><tr><td>405 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MDL-III-405</td><td>Distributore per laser CNI</td></tr><tr><td>473 nm CW laser a 50&nbsp; mW</td><td>OptoEngine</td><td>MLL-FN-473-50</td><td></td></tr></tbody></table>

multicolore fluorescenza detection per droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

I saggi di fluorescenza sono le letture più comuni utilizzate nella microfluidica delle goccioline grazie ai loro segnali luminosi e alla rapida risposta temporale. Applicazioni come i saggi multiplex, l'evoluzione enzimatica e la selezione cellulare potenziata dalla biologia molecolare richiedono la rilevazione di due o più colori di fluorescenza. I sistemi di rilevamento multicolore standard che accoppiano i laser a spazio libero ai microscopi a epifluorescenza sono ingombranti, costosi e di difficile manutenzione. In questo articolo, descriviamo uno schema per eseguire il rilevamento multicolore eccitando regioni discrete di un canale microfluidico con laser accoppiati a fibre ottiche. La luce emessa viene raccolta da una fibra ottica accoppiata a un singolo fotorivelatore. Poiché l'eccitazione si verifica in diverse posizioni spaziali, l'identità della luce emessa può essere codificata come uno spostamento temporale, eliminando la necessità di schemi di filtraggio della luce più complicati. Il sistema è stato utilizzato per rilevare popolazioni di goccioline contenenti quattro combinazioni uniche di coloranti e per rilevare concentrazioni sub-nanomolari di fluoresceina.

Realizzazione di un dispositivo PDMS che permette l&#39;inserimento di fibre ottiche richiede una procedura di fotolitografia multistep per creare canali di diversa altezza (figura 1). Innanzitutto, un 80 micron alto strato di SU-8 è filata su un wafer di silicio e modellato usando una maschera per creare la geometria gestione dei fluidi. Quindi, un ulteriore strato di 40 micron di SU-8 è filata sul wafer, e modellato usando una seconda maschera per creare caratteristich...

Il rilevamento della fluorescenza multicolore nella microfluidica delle goccioline coinvolge tipicamente sistemi di rilevamento basati su microscopi a epifluorescenza ingombranti e complessi. Qui descriviamo uno schema di rilevamento multicolore compatto e modulare che utilizza una serie di fibre ottiche per codificare temporalmente i dati multicolore raccolti da un singolo fotorivelatore.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare un'applicazione semplice del rilevamento della fluorescenza in microfluidica a goccioline mediante l'uso di fibre ottiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nella selezione biologica ad alto rendimento, come l'identificazione di fenotipi rari e l'evoluzione diretta di enzimi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'applicazione semplice ed economica del rilevamento della fluorescenza in microfluidica a goccioline.Per iniziare, posizionare una piastrina di silicio con diametro di tre pollici, preventivamente pulita, sul mandrino a vuoto di un spin coater. Successivamente, applicare un millilitro di SU-8 3050 al centro della piastrina e far ruotare la piastrina per ottenere uno strato di photoresist spesso 80 micrometri. Rimuovere la piastrina rivestita dallo spin coater e posizionarla su una piastra riscaldata preriscaldata a 135 gradi Celsius.Dopo 30 minuti, rimuovere la piastrina e lasciarla raffreddare nuovamente a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare la piastrina su una superficie piana e allineare la maschera del primo strato sulla piastrina. Esporre la piastr

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In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Un senza lenti on-chip piattaforma microscopia a fluorescenza è dimostrato in grado di oggetti immagini fluorescenti su un ultra-ampio campo di vista di esempio,&gt; 0,6-8 cm2 con &lt;4 _m risoluzione utilizzando un campionamento di compressione basata algoritmo di decodifica. Tale compattezza e grande campo fluorescente on-chip modalità di imaging potrebbe essere prezioso per high-throughput citometria, rare cellule di ricerca e di analisi dei microarray.

Senza lenti microscopia a fluorescenza su un chip

Piattaforme microfluidica gocce a base sono candidati promettenti per la sperimentazione ad alto rendimento in quanto sono in grado di generare picolitri, auto-compartimenti imbarcazioni a buon mercato a prezzi kHz. Attraverso l'integrazione con veloce, sensibile e ad alta risoluzione metodi di spettroscopia di fluorescenza, la grande quantità di informazioni generate all'interno di questi sistemi possono essere estratte in modo efficiente, sfruttato ed utilizzato.

Metodi di rilevamento a fluorescenza per piattaforme goccia microfluidica

Questo video dimostra l'uso della spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per rilevare l'interazione tra le proteine della superficie cellulare ai contatti cellula-cellula. Esprimendo il recettore di adesione transmembrana di interesse marcato con una proteina fluorescente e mescolando due diverse popolazioni cellulari che ospitano due etichette fluorescenti spettralmente separate, la trans-interazione tra i recettori di due cellule vicine con fluorescenza di colore diverso viene...

Spettroscopia di fluttuazione della fluorescenza per studiare l'interazione delle proteine a contatto cellulare

Fluorescente-core sensori microcavità impiegano un alto indice di quantum dot-rivestimento nel canale di silice microcapillari. Variazioni dell'indice di rifrazione di fluidi pompati nel canale capillare causa sposta nello spettro di fluorescenza microcavità che può essere utilizzato per analizzare il mezzo canale.

Sintesi e funzionamento del fluorescente-core microcavità per il Rilevamento rifrattometrico

Dimostriamo l'uso della microscopia di localizzazione per fotoattivazione a fluorescenza (FPALM) per visualizzare simultaneamente più tipi di molecole marcate in fluorescenza all'interno delle cellule. Le tecniche descritte producono la localizzazione di migliaia o centinaia di migliaia di singole proteine marcate con fluorescenza, con una precisione di decine di nanometri all'interno di singole cellule.

Imaging multicolore simultaneo di strutture biologiche con microscopia di localizzazione con fotoattivazione a fluorescenza

Questo lavoro presenta un metodo semplice e visivo per rilevare polimorfismi multi-nucleotide su una piattaforma di manipolazione gocciolina pneumatica. Con il metodo proposto, l'intero esperimento, compresi manipolazione gocciolina e la rilevazione dei polimorfismi multi-nucleotidi, può essere eseguita vicino a 23 ° C senza l'ausilio di strumenti avanzati.

Il colorimetrico rilevamento visivo del Multi-nucleotide polimorfismi su una piattaforma di manipolazione pneumatica Droplet

Qui, presentiamo un protocollo per la localizzazione di multi-colore delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule vive. Per allegare fluorofori, proteine self-etichettatura sono usate. Proteine, trova in scomparti di diverse membrane dell'organello stesso, possono essere localizzati con una precisione di ~ 18 nm.

Microscopia di multi-colore localizzazione delle proteine di membrana singola in organelli delle cellule di mammiferi dal vivo

Qui vi presentiamo una guida pratica di costruzione di un sistema di microscopia integrato, che si fonde imaging epi-fluorescente convenzionale, singola molecola basata sul rilevamento di Super-risoluzione imaging e rilevamento di singola molecola multi-colore, tra cui trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza di singola molecola di imaging, in un set-up in modo efficiente.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

La biochimica visiva a singola molecola studiata attraverso camere microfluidiche è notevolmente facilitata utilizzando barili di vetro, siringhe a tenuta di gas, connessioni stabili di tubi alle celle di flusso ed eliminazione delle bolle posizionando valvole di commutazione tra le siringhe e i tubi. Il protocollo descrive due trappole ottiche che consentono la visualizzazione delle transazioni del DNA e delle interazioni intermolecolari.

Uso di pinzette ottiche doppie e microfluidica per studi a singola molecola

Il protocollo descrive una piattaforma microfluidica avanzata per misurare quantitativamente le dinamiche di secrezione di citochine di singole cellule mononucleate del sangue periferico umano. La piattaforma misura fino a tre citochine in parallelo (IL-6, TNFα e IL-1β) per ogni singola cellula stimolata con lipopolisaccaride come esempio.

Approccio microfluidico per risolvere la secrezione simultanea e sequenziale di citochine di singole cellule polifunzionali 

Scopri la rilevazione di fluorescenza multicolore per microfluidica a gocce utilizzando fibre ottiche. Questo metodo compatto e modulare semplifica lo screening biologico ad alto rendimento e l'evoluzione diretta degli enzimi.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

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