Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una semplice applicazione della rilevazione della fluorescenza microfluidica a goccioline utilizzando fibre ottiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nello screening biologico ad alto rendimento, come l'identificazione di fenotipi rari e l'evoluzione diretta degli enzimi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un'applicazione semplice ed economica della rivelazione della fluorescenza nella microfluidica delle goccioline.

Per iniziare, posiziona un wafer di silicio prepulito da tre pollici di diametro sul mandrino a vuoto di una centrifuga. Quindi, applicare un millilitro di SU-8 3050 al centro del wafer e ruotare il wafer per fornire uno strato di fotoresist di 80 micrometri di spessore. Rimuovere il wafer rivestito dalla centrifuga e posizionarlo su una piastra preriscaldata a 135 gradi Celsius.

Dopo 30 minuti togliete l'ostia e lasciatela raffreddare di nuovo a temperatura ambiente. Quindi, posiziona il wafer su una superficie piana e allinea la maschera del primo strato sul wafer. Esporre il wafer sotto un LED collimato da 190 milliwatt a 365 nanometri per tre minuti.

Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra riscaldante a 135 gradi Celsius per un minuto e poi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, riposizionare il wafer sulla centrifuga e fissarlo al mandrino. Applicare un ulteriore millilitro di SU-8 3050 al centro del wafer e centrifugare per 20 secondi a 500 giri/min.

seguito da 30 secondi a 5.000 giri/min Quindi, cuocere la cialda su una piastra. Lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente e poi riposizionarlo sulla superficie di allineamento della maschera.

Utilizzare l'oscilloscopio di dissezione per allineare manualmente la maschera del secondo strato con i segni di allineamento modellati sul wafer. Una volta allineato correttamente, esporre il wafer rivestito per 4-1/2 minuti utilizzando le stesse condizioni di prima. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra riscaldante a 135 gradi Celsius per un minuto, quindi raffreddare il wafer e riattaccarlo sulla centrifuga.

Applicare un millilitro di SU-8 3050 al wafer per la terza volta e centrifugare per aggiungere altri 100 micrometri di fotoresist. Togliete la cialda e cuocete su una piastra a 135 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, raffreddarlo a temperatura ambiente e posizionarlo sulla superficie di allineamento.

Allineare la maschera del terzo strato con la geometria precedente ed esporre il wafer rivestito utilizzando le condizioni precedenti per nove minuti. Dopo l'esposizione, posizionare il wafer su una piastra riscaldante a 135 gradi Celsius per un minuto e poi raffreddarlo a temperatura ambiente. Una volta raffreddate, sviluppare le maschere immergendo il wafer in un bagno mescolato di ossidante per 30 minuti.

Infine, lavate la cialda in isopropanolo e poi cuocetela un'ultima volta per un minuto su una piastra a 135 gradi. Conservare il master sviluppato in una piastra di Petri da 100 millimetri fino allo stampaggio. Preparare una miscela 10:1 di PDMS combinando 50 grammi di base siliconica con cinque grammi di agente indurente in un bicchiere di plastica.

Mescolare il contenuto con uno strumento rotante, quindi degassare la miscela all'interno dell'essiccatore per 30 minuti o fino a quando tutte le bolle d'aria non sono state rimosse. Versare il PDMS degasato sul master preparato per ottenere uno spessore di tre millimetri. Quindi, riposizionare la capsula di Petri nell'essiccatore per un ulteriore degasaggio.

Una volta rimosse tutte le bolle, cuocere il dispositivo a 80 gradi Celsius per 80 minuti. Una volta raffreddato, tagliare il dispositivo dallo stampo utilizzando un bisturi in modo che entrambe le telegeometrie da 120 micrometri e 220 micrometri siano accessibili dal lato del dispositivo. Quindi perforare gli ingressi e le uscite fluidiche con un punzone per biopsia da 0,75 mm.

Il plasma tratta il dispositivo con le caratteristiche rivolte verso l'alto insieme a un vetrino in vetro prepulito e 1 millibar di ossigeno al plasma per 20 secondi in un pulitore al plasma da 300 watt. Incollare il dispositivo posizionando saldamente il lato modellato del dispositivo PDMS sul lato trattato al plasma del vetrino. Quindi, posizionare il dispositivo in un forno a 80 gradi Celsius e sostenere il dispositivo assemblato per 40 minuti.

Una volta cotto, utilizzare una siringa per lavare il dispositivo con un fluido per il trattamento superficiale fluorurato per rendere i canali idrofobici. Quindi, cuocere immediatamente il dispositivo a 80 gradi Celsius per 10 minuti per far evaporare il solvente. Preparare due fibre di eccitazione laser rimuovendo l'isolamento dagli ultimi cinque millimetri delle fibre ottiche.

Inoltre, preparare la fibra per la raccolta del segnale fluorescente rimuovendo l'isolamento dagli ultimi cinque millimetri di una fibra ottica più grande. Ispezionare le punte di tutte le fibre al microscopio. Se le punte non terminano su una superficie piana, richiudi le estremità con un graffietto in fibra.

Quindi, collegare un accoppiatore in fibra laser a un laser da 50 milliwatt e 405 nanometri e collegare una delle fibre con nucleo da 105 micrometri al laser. Dirigere l'estremità spelata del sensore di un misuratore di potenza laser e utilizzare le regolazioni di precisione dell'accoppiatore laser per massimizzare la potenza del laser. Esegui lo stesso processo per sintonizzare l'altra fibra utilizzando un laser da 50 milliwatt e 473 nanometri.

Quindi, montare un filtro passa-banda quadruplo sul tubo moltiplicatore di foto utilizzando i tubi dell'obiettivo per bloccare la luce laser e trasmettere la fluorescenza emessa. Collegare un accoppiatore in fibra in modo che la luce viaggi attraverso i filtri prima di colpire il tubo moltiplicatore di foto. Quindi, collegare la fibra di raccolta all'accoppiatore in fibra.

Posiziona il chip microfluidico fabbricato sul tavolino di un microscopio invertito accoppiato con una fotocamera digitale in grado di raggiungere velocità dell'otturatore di almeno 100 microsecondi. Lavorando con attenzione dai lati, inserire la fibra accoppiata al laser a 473 nanometri nel canale più a monte di 120 micrometri. Fare attenzione a non forare il canale di flusso principale.

Quindi, inserire la fibra accoppiata al laser a 405 nanometri nel canale laterale più a valle alto 120 micrometri, fornendo una spaziatura delle fibre di 300 micrometri. Infine, inserire la fibra accoppiata al tubo fotomoltiplicatore più grande nel canale alto 220 micrometri normale alle due fibre di eccitazione laser. Riempire una siringa da cinque millilitri riempita con HFE 7500 contenente fluorotensioattivo ionico al 2% e montarla sull'ingresso dell'olio distanziatore del dispositivo di rilevamento utilizzando un tubo PE2.

Successivamente, riempire una siringa con un'emulsione mista di FITC e colorante blu e montarla su una pompa a siringa orientata verticalmente accoppiata al dispositivo come ingresso di reiniezione delle gocce utilizzando un tubo PE2. Collegare un pezzo di tubo in PE dall'uscita del dispositivo a un contenitore dei rifiuti. Quindi, adescare il dispositivo facendo funzionare ciascuna delle pompe a 1.000 microlitri all'ora fino a quando non si vede che sia l'olio che le goccioline si combinano regolarmente nel dispositivo e fluiscono a valle.

Regolare le portate in modo che l'olio distanziatore funzioni a 6.000 microlitri all'ora e le goccioline a 100 microlitri all'ora, fornendo una spaziatura significativa tra le goccioline che viaggiano attraverso la regione di rilevamento. Quindi, accendi i laser e avvia il programma di acquisizione dati. Quindi, regola il guadagno del tubo moltiplicatore fotografico per fornire segnali che sono più di 100 volte il rumore di fondo della linea di base.

Infine, regolare la potenza del laser in modo che tutti i picchi del doppietto siano chiaramente visibili su un'unica traccia temporale in scala lineare. Una gocciolina che scorre attraverso il canale di rilevamento incontra regioni di eccitazione discrete davanti a ciascuna delle fibre ottiche accoppiate al laser. La fibra di rilevamento registra la fluorescenza emessa con uno spostamento temporale con una separazione di picco che è correlata al tempo impiegato da una gocciolina per spostarsi da una regione di eccitazione all'altra.

In questo modo si elimina la necessità di un ulteriore filtraggio della luce e di separare i tubi fotomoltiplicatori. L'efficacia dello schema di rilevamento è stata testata rilevando un'emulsione mista di goccioline contenenti coloranti che eccitano a 405 nanometri e a 473 nanometri. Questo grafico mostra una chiara separazione tra i quattro tipi di goccioline reiniettate quando vengono fatte scorrere a circa 50 hertz.

La gamma dinamica e la sensibilità assoluta del rivelatore sono state studiate misurando le goccioline di sola fluoresceina. I dati mostrano la capacità del sistema di rilevare concentrazioni di colorante che vanno da 0,1 a 100 nanomolari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come implementare un sistema di rilevamento della fluorescenza semplice e compatto utilizzando una serie di fibre ottiche inserite e un singolo fotorivelatore.