Name: Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri un modello in vitro con cellule staminali neurali per studiare la transizione epitelio-mesenchimale nel cancro. Questo metodo consente di analizzare la migrazione cellulare e supporta la scoperta di nuovi farmaci.

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Lo studio è stato sostenuto dall&#39;Università di Basilea Science Foundation e la National Science Foundation svizzero da una sovvenzione di MHS e AG (SNF IZLIZ3_157230). Ringraziamo: Dr. Tania Rinaldi Burkat per fornire generosamente infrastrutture; tutti i membri del gruppo Bettler per discussioni e commenti. Ringraziamo Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Svizzera) per l&#39;installazione professionale e competente della telecamera video Full HD MC170 (Leica Microsystems, Svizzera).

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

In questo studio un sistema standardizzato per EMT analisi NSC che utilizzano è descritta (riassunti nella figura supplementare 3). La standardizzazione assicura riproducibilità (Tabella 1 e 2). I NSCs sono derivati ​​dalla corteccia di sviluppo, un tessuto che normalmente non subisce EMT. Questo è un vantaggio per l&#39;analisi dei primi passi in EMT. Primi passi in EMT non possono essere adeguatamente studiati nelle cellule tumorali che si sono accumulati i cambiamenti genetici e potr...

Durante diversi stadi di sviluppo embrionale, le cellule epiteliali perdono la loro forte aderenza tra loro (ad esempio, giunzioni strette) e acquisiscono un fenotipo migratorio in un processo chiamato la transizione epitelio mesenchimale (EMT) 1. EMT è necessaria per la formazione di tipi cellulari aggiuntivi, come le cellule della cresta neurale mesenchimali, una popolazione che segrega dal neuroepitelio 2. EMT non è essenziale solo durante le fasi embrionali, ma richiesto anche nelle fasi successive della vita adulta a mantenere processi fisiologici nell&#39;organismo adulto, come ad esempio la guarigione della ferita 3 e del sistema nervoso centrale di rigenerazione (SNC) in lesioni demielinizzanti 4. Tumori epiteliali sono noti per riattivare EMT come un passo di iniziazione per la migrazione, invasione e metastasi, in ultima analisi, che porta alla progressione del cancro 1,3. EMT è infatti legata in posizione centrale ad una forte migrazione 1,3. I passi cellulari di conditioning, avviando, in fase e il mantenimento di EMT non sono pienamente compresi e hanno bisogno di ulteriori indagini. Qui, viene presentato un standardizzato in vitro sistema modello EMT sulla base di NSC, con fattori di crescita definiti e media (senza siero e senza l&#39;utilizzo di enzimi). Questo sistema modello è rilevante per gli scienziati che lavorano su EMT. Le famiglie di proteine ​​Lumaca, Zeb e Twist hanno dimostrato di essere fondamentale per EMT, sia in fase di sviluppo e di malattia 1. La lumaca, Zeb e Twist famiglie sono anche coinvolti nel sistema presentato. Il sistema è basato su una specifica regione del proencefalo che normalmente non subisce EMT fornire un vantaggio particolare per lo studio di eventi iniziali durante EMT induzione. Il sistema modello potrebbe potenzialmente essere applicato a studiare EMT in epiteli all&#39;esterno del SNC, poiché induttori EMT chiave, come la chiocciola, Zeb e proteine ​​torsione, si riscontrano anche durante EMT in sistemi tessuto fuori del SNC. Questo modello sistema permette l&#39;isolamento standardizzato di NSC dalla corteccia in via di sviluppo per studiare le caratteristiche di cellule staminali in generale e, in particolare, EMT. Utilizzando questo sistema, abbiamo isolato le cellule staminali neurali, EMT indotta e studiato la successiva migrazione sotto l&#39;effetto di FGF2 e BMP4. Abbiamo osservato che interagisce FGF- e BMP di segnalazione con TGFβ di segnalazione per promuovere la migrazione delle cellule, convalidando così il modello di sistema.

<table><tbody><tr><td>Sistemi RnD BMP4, rhBMP4</td><td>&nbsp;</td><td>314-BP-01M</td><td></td></tr><tr><td>Insulina del pancreas bovino</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Camera di Boyden, saggio di invasione cellulare CytoSelect</td><td>Cell Biolabs</td><td>CBA-110</td><td>Sistema di piastre a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari con griglia</td><td>Piatto Ibidi da 500 mm, 35 mm</td><td>80156</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Life Technologies</td><td>C10045</td><td>Colorante a membrana plasmatica, da utilizzare a 1:1.000.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>LifeTechnologies</td><td>D1306</td><td>Stock a 5 mg/ml. Utilizzare a 1:10.000. Cancerogeno. È necessaria una protezione adeguata (guanti, cappotto, occhiali).</td></tr><tr><td>DMEM/F12 1:1 bottiglia media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>FGF2, rhFGF2</td><td>RnD Systems</td><td>233-FB-01M</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina,</td><td>bovino Sigma&nbsp;</td><td>F4759</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di glutamax&nbsp;</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Software grafico con funzione di misurazione dei pixel</td><td>Fiji</td><td>fiji.sc/Fiji</td><td>versione 2.0.0-rc-30/1.49s</td></tr><tr><td>HBSS media</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H9394</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina umana</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Possibile irritante polmonare. Evitare l'inalazione. Utilizzare una protezione adeguata.</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Nestin, anticorpo anti Nestin di topo</td><td>Genetex</td><td>GTX26142</td><td>Utilizzare a 1:100, fissazione PFA al 4%, Triton X100 allo 0,1%</td></tr> <tr><td>Olig2, anticorpo anti Olig2 di coniglio</td><td>Fornito da Hirohide Takebayash</td><td>Stock personale</td><td>Utilizzare a 1:2.000, fissazione PFA al 4%, Triton X100 allo 0,1%</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina/Fungizone</td><td>Gibco Invitrogen&nbsp;</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Podoplanina, anticorpo anti-podoplanina di topo</td><td>Acris</td><td>DM3614P</td><td>Utilizzare a 1:250, fissazione PFA al 4%, evitare Triton X100</td></tr><tr><td>Poly-L-ornithine</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Irritante per la pelle e gli occhi. È necessaria una protezione adeguata.</td></tr><tr><td>Selenito di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Sox10, anticorpo anti-Sox10 di coniglio</td><td>Millipore Chemicon</td><td>AB5774</td><td>Utilizzare a 1:200, fissazione PFA al 4%, Triton X100 allo 0,1%</td></tr> <tr><td>TGFb1, rhTGFb1</td><td>RnD Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri non rivestite</td><td>Falcon Corning</td><td>351029</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello enzima e neural stem cell culture siero-libero per emt investigation adatto per drug discovery

An Enzyme- and Serum-free Neural Stem Cell Culture Model for EMT Investigation Suited for Drug Discovery

Epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) descrive il processo dell&#39;epitelio transdifferentiating in mesenchima. EMT è un processo fondamentale durante lo sviluppo embrionale, che comunemente si verifica nel glioblastoma, la più frequente tumore maligno al cervello. EMT è stato osservato anche in più carcinomi di fuori del cervello, tra cui il cancro al seno, il cancro del polmone, cancro del colon, cancro gastrico. EMT è legata in posizione centrale per malignità, promuovendo la migrazione, l&#39;invasione e la formazione di metastasi. I meccanismi di EMT induzione non sono pienamente compresi. Qui si descrive un sistema in vitro per l&#39;isolamento standardizzato di cellule corticali neurali staminali (NSC) e la successiva EMT-induzione. Questo sistema fornisce la flessibilità necessaria per utilizzare sia singole cellule o espianto. In questo sistema, ratto o topo embrionali NSC proencefalo sono coltivate in un mezzo definito, privo di siero e enzimi. Le NSC espresso Olig2 e Sox10, due fattori di trascrizione osservata in oligodendroccellule precursori yte (OPC). Utilizzando questo sistema, le interazioni tra FGF-, BMP- e TGFβ di segnalazione che coinvolge Zeb1, Zeb2, e Twist2 sono stati osservati in cui TGFβ-attivazione significativamente migliorata la migrazione delle cellule, suggerendo un sinergico / TGFβ-interazione BMP-. I risultati indicano una rete di FGF-, BMP- e TGFβ-segnalazione di essere coinvolti in induzione e mantenimento EMT. Questo sistema modello è rilevante per indagare EMT in vitro. E &#39;conveniente e mostra elevata riproducibilità. Permette anche per il confronto delle mescole diverse rispetto alle loro risposte migrazione (misurazione quantitativa di distanza), e high-throughput screening di composti di inibire o migliorare EMT (misurazione qualitativa). Il modello è quindi adatto per testare le librerie di droga per le sostanze che interessano EMT.

Questo sistema modello EMT è basato sull&#39;isolamento standardizzata di NSC sia come singole cellule o espianti come da una regione specifica del tubo neurale sviluppo, la corteccia centrale (figure 1 e 2). Per la valutazione quantitativa, espianti sono stati seminati proprio al centro di 500 micron cultura griglia piatto (Figura 3). Espianti da corteccia centrale sono stati esposti a FGF2 per due giorni, seguiti da altri due giorni in...

La transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) consente ai tumori di diventare invasivi. Per studiare l'EMT, viene descritto un modello in vitro basato su cellule staminali neurali (NSC) privo di siero ed enzimi. Questo sistema standardizzato consente la valutazione quantitativa e qualitativa della migrazione cellulare, dell'espressione genica e proteica. Il modello è adatto per la scoperta di farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) describes the process of epithelium transdifferentiating into mesenchyme. EMT is a fundamental process during ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la migrazione in cellule tipicamente non migratorie, al fine di identificare composti specifici che attivano o bloccano la migrazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della migrazione e dell'invasione cellulare, ed è particolarmente interessante per gli scienziati che lavorano con cellule staminali neurali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che cellule non migratorie e non invasive possono essere analizzate durante il processo di acquisizione di caratteristiche migratorie e invasive.Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'identificazione di nuovi composti in grado di bloccare la transizione epiteliale-mesenchimale, o EMT, che si verifica nei gliomi umani di alto grado ritenuti derivare da cellule staminali neurali. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'EMT e sulle cellule staminali neurali, può anche essere utilizzato per studiare altri tumori epiteliali, come il cancro al seno, ai polmoni o al colon. Al giorno embrionale 14,5, verificare l'età corretta degli embrioni di ratto mediante la presenza della formazione iniziale delle dita in un arto anterio

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Biologia dello sviluppo

Questo video descrive il metodo utilizzato per l'isolamento di neuroprecursors dalla corteccia sviluppo embrionale dei topi. Il procedimento per eliminare gli embrioni dall'utero, sezionare il tessuto corticale, e digerire la corteccia cerebrale isolato viene mostrato.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Un metodo semplice e affidabile sulle isolamento e la coltura di cellule staminali neurali da scartati tessuto fetale umano corticale è descritto. Culture derivati ​​da noti disturbi neurologici umano può essere utilizzato per la caratterizzazione di processi patologici cellulari e molecolari, oltre a fornire una piattaforma per valutare l'efficacia farmacologica.

Generazione di cellule staminali neurali da scartate tessuto fetale umano corticale

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

I protocolli descrivono due sistemi di test in vitro di tossicità dello sviluppo (UKK e UKN1) a base di cellule staminali embrionali umane e studi trascrittoma. I sistemi di test prevedono pericolo tossicità per lo sviluppo umano, e possono contribuire a ridurre studi sugli animali, i costi e il tempo necessario per le prove della sicurezza chimica.

Umano cellule staminali pluripotenti Basato Tossicità per lo sviluppo saggi per Chemical Screening e Safety Systems Biology generazione dati

Viene descritto un protocollo personalizzato per differenziare le cellule ES di topo in popolazioni definite di neuroni altamente puri che esibiscono sinapsi funzionanti e un comportamento di rete emergente. L'analisi elettrofisiologica dimostra la perdita della trasmissione sinaptica in seguito all'esposizione ai sierotipi di neurotossina botulinica /A-/G e alla neurotossina tetanica.

Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Questo protocollo descrive in dettaglio il metodo per generare progenitori neurali da cellule staminali embrionali utilizzando un metodo monostrato privo di siero. Questi progenitori possono essere utilizzati per derivare tipi di cellule neurali mature o per studiare il processo di specificazione neurale e sono suscettibili di ridimensionamento in formato multipozzetto per lo screening dei composti.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

Qui viene riportato un protocollo per sviluppare un sistema tridimensionale (3-D) da cellule staminali pluripotenziali umane (hiPSCs) chiamate il corpo embrionale libero (SFEB) serico. Questo modello di 3-D può essere utilizzato come una cultura di fetta organotipica per modellare lo sviluppo corticale umano e per l'interrogatorio fisiologico dei circuiti neurali in via di sviluppo.

Sviluppare corpi embrioni liberi del siero derivato da HiPSC per l&#39;interrogazione di colture a cellule staminali a 3 dosi utilizzando saggi fisiologicamente rilevanti

Presentato qui è un protocollo per la generazione di una coltura unicellulare di cellule staminali embrionali umane e la loro successiva differenziazione in cellule progenitrici neurali. Il protocollo è semplice, robusto, scalabile e adatto per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

Qui, abbiamo stabilito un metodo a basso costo e facile da usare che indirizza una differenziazione rapida ed efficiente dalle cellule staminali embrionali ai neuroni. Questo metodo è adatto per la popolarità tra i laboratori e può essere uno strumento utile per la ricerca neurologica.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

Scopri un modello in vitro con cellule staminali neurali per studiare la transizione epitelio-mesenchimale nel cancro. Questo metodo consente di analizzare la migrazione cellulare e supporta la scoperta di nuovi farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

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