Esteso Time-lapse Imaging intravitale del Real-time multicellulare Dynamics nel microambiente tumorale
12 giugno 2016
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multiphoton effettuare prolungato time-lapse imaging di interazioni multicellulari in tempo reale, in vivo a risoluzione singola cellula.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare gli eventi dinamici all'interno del microambiente tumorale tramite microspia multifotonica intravitale ad alta risoluzione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul microambiente tumorale, come ad esempio quali eventi dinamici sono coinvolti nella permeabilità vascolare e nelle interazioni multicellulari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la cinetica degli eventi nel microambiente tumorale può essere osservata e misurata.
Prima di iniziare la procedura, accendere tutti i componenti del microscopio e del laser, inclusi i due laser a fotoni e i rivelatori. E imposta la scatola di riscaldamento a 30 gradi Celsius per preriscaldare il palco. Pulire il tavolino del microscopio e l'inserto del tavolino con etanolo al 70%.
Quando il tavolino è asciutto, posizionare una grossa goccia d'acqua sull'obiettivo del microscopio 25 x 1,05 NA per mantenere il contatto ottico con il vetro di copertura e posizionare un vetro di copertura di spessore 1,5 sopra la porta di imaging dell'inserto. Quindi, taglia un pezzo di tubo di polietilene di 30 centimetri. Posizionare il cuscinetto in gomma sopra il vetro di copertura.
Usando una pinza, rompi un ago calibro 31 dal suo raccordo di plastica e inserisci l'estremità smussata del mozzo dell'ago nel tubo. Inserire e collegare un ago calibro 31 nell'altra estremità del tubo in PE. Quindi, riempire una siringa da un cc con PBS sterile e collegare la siringa all'ago calibro 31.
Utilizzare il PBS per eliminare tutta l'aria dal tubo e dall'ago. Quindi, una siringa cc con 200 microlitri dell'etichetta vascolare appropriata e un'altra con la proteina iniettabile appropriata. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, confermare l'anestesia corretta con una mancanza di risposta al pizzicamento delle dita dei piedi e applicare unguenti per gli occhi sul topo anestetizzato.
Successivamente, posiziona l'animale su una piattaforma chirurgica sotto una lampada termica per aumentare la circolazione della coda. Dopo due minuti, sterilizzare la coda con etanolo al 70% e inserire la punta del catetere calibro 31, da due a tre millimetri nella vena laterale della coda. Quindi, posizionare un centimetro di nastro adesivo da laboratorio sul catetere per tenere l'ago parallelo alla vena lungo la lunghezza della coda.
Quando il catetere è stato fissato, tamponare le superfici ventrali e tumorali con etanolo al 70%. Quindi, sollevare la pelle sopra l'addome e utilizzare le forbici sterili per praticare un'incisione sottocutanea di circa un centimetro lungo la linea mediana ventrale dell'addome, facendo attenzione a non perforare il peritoneo. Tagliare delicatamente il tessuto connettivo che collega la ghiandola mammaria e il tumore lontano dal peritoneo per esporre il tumore.
Quindi, usando le forbici e le pinze, rimuovere delicatamente la fascia e il grasso dalla superficie esposta del tumore. Quando il tumore è stato esposto, trasferire il mouse allo stadio di imaging preriscaldato. Utilizzare nastri da laboratorio per fissare il vetro di copertura, quindi posizionare il tumore nel foro di un cuscinetto di gomma che copre il vetrino coprioggetto sopra l'obiettivo del microscopio.
Quando l'animale è in posizione, riempire la camera del cuscinetto in gomma con PBS per mantenere il tessuto idratato e mantenere il contatto ottico con il vetrino coprioggetti. Posiziona un sensore del collare della sonda del pulsossimetro intorno al collo per monitorare i segni vitali dell'animale e posiziona la scatola di riscaldamento sopra l'animale. Quindi, utilizzare gli IP del microscopio per mettere a fuoco le cellule tumorali fluorescenti sulla superficie del tumore e l'area localizzata con vasi sanguigni che scorrono
.Una volta selezionata una regione di interesse, passare il microscopio alla modalità di imaging multifotone e utilizzare il regolatore di messa a fuoco per spostare l'obiettivo nella posizione di partenza desiderata. Quindi, fare clic sul pulsante in alto della posizione Z per impostare il limite superiore della serie z e visualizzare la rete di fibre di collagene sulla superficie del tumore nel canale di generazione della seconda armonica. Quindi spostare l'obiettivo alla profondità di imaging desiderata e fare clic sul pulsante in basso della posizione z per impostare il limite inferiore della serie z.
Successivamente, inserisci il valore desiderato nei campi della dimensione del passo. Quindi, passa al pannello Time Lapse e inserisci il tempo di intervallo appropriato. Una volta determinati i parametri di imaging, sostituire la siringa attaccata al catetere con una siringa di colorante per marcatura vascolare e somministrare lentamente un massimo di 200 microlitri della soluzione colorante, facendo attenzione che la soluzione entri in vena.
Dopo l'iniezione, rimettere la siringa PBS nel catetere e iniziare l'imaging time lapse del passo z. Quando tutte le immagini sono state ottenute, sostituire la siringa di PBS con la siringa contenente la proteina iniettabile, facendo attenzione a non introdurre bolle nella linea. Quindi iniettare lentamente la sospensione proteica nel topo e sostituire la siringa con una siringa contenente PBS.
I macrofagi possono essere tracciati con 70 kilodalton marcati in fluorescenza e destrano che si accumulano nei microfagi fagociti. La doppia marcatura delle cellule tumorali e dei microfagi consente di visualizzare in tempo reale l'interazione diretta con questi due tipi di cellule. Per visualizzare i cambiamenti nella permeabilità vascolare del tumore, i punti quantici possono essere utilizzati anche per etichettare lo spazio vascolare.
Poiché sono abbastanza grandi da non diffondersi facilmente attraverso gli spazi interarteriosi. L'imaging continuo ad alta risoluzione facilita l'acquisizione degli eventi di permeabilità vascolare e la quantificazione della cinetica dello stravaso e della clearance del destrano. In questo campo visivo di esempio, il picco del di-stravaso vacscolare si osserva tra i 29 e i 34 minuti, come evidenziato dal segnale TMR extra vascolare.
L'iniezione di ulteriori coloranti o proteine vascolari per indurre la permeabilità vascolare può fornire informazioni sugli eventi di segnalazione che regolano la permeabilità vascolare. Infatti, entro i primi secondi dall'iniezione, si possono osservare 10 kilodalton di destrano FITC che stravadono dal sistema vascolare, mentre i 155 kilodalton nel destrano TMR rimangono confinati nello spazio vascolare. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in un'ora se eseguita correttamente.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere delicatamente il tessuto connettivo senza danneggiare la superficie del tumore e di mantenere idratata la superficie del tumore. Seguendo questa procedura di dinamica cellulare, tale migrazione delle cellule tumorali può essere visualizzata per rispondere a ulteriori domande sulla direzionalità della migrazione e dell'intravaso delle cellule tumorali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare eventi cellulari dinamici in un microambiente tumorale mediante microscopia multifotone intervitale.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso della microscopia a fotoni multipli per visualizzare in tempo reale eventi dinamici all'interno del microambiente tumorale. La tecnica consente acquisizioni temporali prolungate con risoluzione a livello di singola cellula, fornendo informazioni sulla permeabilità vascolare e sulle interazioni multicellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Microscopia
Sfondo
- La microscopia a fotoni multipli consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione.
- È particolarmente utile per lo studio di tessuti vivi.
- L'ambiente microscopico tumorale è complesso e dinamico.
- Comprendere le interazioni cellulari è fondamentale per la ricerca sul cancro.
Scopo dello studio
- Per visualizzare eventi dinamici nel microambiente tumorale.
- Per misurare la cinetica della permeabilità vascolare.
- Per osservare interazioni multicellulari in vivo.
Metodi Utilizzati
- Microscopia intravitale a multiphoton.
- Acquisizione di immagini prolungata nel tempo.
- Tecniche con risoluzione a singola cellula.
- Preparazione del microscopio e del palchetto del campione.
Risultati principali
- Gli eventi dinamici nel microambiente tumorale sono stati visualizzati con successo.
- Le variazioni della permeabilità vascolare sono state osservate in tempo reale.
- Le interazioni multicellulari sono state documentate ad alta risoluzione.
- Il metodo ha dimostrato la capacità di misurare la cinetica degli eventi.
Conclusioni
- La microscopia a fotoni multipli è uno strumento potente per la ricerca sul cancro.
- L'imaging in tempo reale fornisce informazioni preziose sulla biologia tumorale.
- Questa tecnica può migliorare la nostra comprensione della dinamica del cancro.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione in tempo reale della dinamica multicellulare nell'ambiente tumorale permette l'osservazione diretta di eventi transitori come la permeabilità vascolare e la motilità delle cellule tumorali, elementi fondamentali per comprendere la metastasi e l'angiogenesi. Questo approccio fornisce dati cinetici che saggi endpoint non possono rilevare, sostenendo la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione di bersagli oncologici. Catturando la risoluzione temporale delle interazioni stroma-tumore, il metodo contribuisce a definire il livello predittivo dei modelli preclinici e supporta la selezione di candidati terapeutici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione in tempo reale delle interazioni stroma-tumore che guidano la progressione tumorale.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli attraverso l'osservazione diretta di eventi multicellulari in tessuto vivente.
- Valore predittivo: Misura la cinetica della permeabilità vascolare e della motilità cellulare per informare la riduzione del rischio dei percorsi molecolari e la selezione del portafoglio.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive, stabilendo le dinamiche di base nel microambiente tumorale.
- Valore operativo: Consente la standardizzazione dei saggi attraverso letture quantificabili dell'extravasazione e della rimozione della destrana nel tempo.
- Valore di scalabilità: Supporta il riutilizzo della piattaforma mediante una preparazione chirurgica e parametri di imaging standardizzati per studi longitudinali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore traslazionale: Mantiene la rilevanza per la malattia catturando interazioni multicellulari simili a quelle umane in modelli murini vivi.
- Continuità preclinica: Collega la fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo biomarcatori cinetici della permeabilità vascolare.
- Decisioni basate sul rischio: Permette di prendere decisioni di avanzamento o interruzione dello sviluppo basate su letture funzionali in tempo reale della modulazione del microambiente tumorale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione del bersaglio fino alla valutazione preclinica, consentendo l'analisi cinetica della permeabilità vascolare e della motilità cellulare come letture funzionali per studi sul meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi visualizzando in tempo reale la direzionalità della migrazione delle cellule tumorali e degli eventi di intravasazione.
- Screening: Fornisce output quantitativi e risolti nel tempo, come i picchi di extravasazione della destrina compresi tra 29 e 34 minuti, consentendo il confronto degli effetti dei composti.
- Analisi: Genera curve cinetiche della permeabilità vascolare e della clearance cellulare, facilitando l'analisi dose-risposta e del legame al bersaglio.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica attraverso modifiche misurabili della dinamica vascolare a seguito di modulazione farmacologica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging intravitale riutilizzabile, impiegabile ripetutamente in progetti di oncologia con protocolli standardizzati di etichettatura e chirurgici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi di segnalazione tra tumore e stroma.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso un'etichettatura vascolare standardizzata, una preparazione chirurgica uniforme e parametri standardizzati di acquisizione in time-lapse.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo la rilevazione precoce di modulatori inefficaci, riducendo il rischio di insuccesso nelle fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce un avanzamento adeguato al rischio quantificando l'interazione con il bersaglio mediante variazioni della permeabilità vascolare in tempo reale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a multiphoton, chirurgia intravitale e strategie di marcatura fluorescente.
- È vincolato alla disponibilità di microscopi abilitati alla multiphoton, laser accordabili e rivelatori sensibili per i canali di seconda armonica e di fluorescenza.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i protocolli di marcatura (ad esempio, punti quantici per la vascolarizzazione, destrano per i macrofagi) e per i parametri di acquisizione.
- Richiede adattamenti tra diversi modelli tumorali, con necessità di validare l’accesso chirurgico e l’idoneità della finestra ottica.
- È limitato dai rischi di fototossicità durante acquisizioni prolungate, richiedendo un’ottimizzazione della potenza luminosa e un monitoraggio costante dei parametri vitali dell’animale.
