Name: La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri come promuovere l'aggregazione tridimensionale di cellule epiteliali timiche purificate con FACS utilizzando l'idrogel autoassemblante EAK16-II/EAKIIH6. Questo metodo supporta la sopravvivenza cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato in parte dal National Institutes of Health concede R21 AI113000 (WSM) e R01 AI123392 (YF).

Tutti gli animali utilizzati negli esperimenti sono stati alloggiati nella struttura animali a Allegheny-Singer Research Institute nell&#39;ambito del protocollo esaminato e approvato dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali del / Allegheny Singer Research Institute Allegheny Health Network. 1. digerire il timo con collagenasi <ol><li> Harvest timo. <ol><li> Euthanize 3-5 settimane di età topi C57BL6 / J in anidride carbonica (CO 2) da camera per raccogliere timo. Nel dettaglio, mettere i topi nella camera sotto di CO 2 di induzione per 3-5 minuti e confermare la morte verificando arresto cardiaco o respiratorio. </li><li> Posare la carcassa sul dorso e bagnare il corpo con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione orizzontale con un forte, forbici dissezione dritto sul suo addome attraverso la pelle. Tirare la pelle su entrambe le estremità (testa e gambe) in modo che venga rovesciato. </li><li> Fare un taglio orizzontale con le forbici dissezione appena sottola costola più bassa e tagliare attraverso il diaframma lateralmente. Tenere il processo xifoideo con una pinza e tagliare la metà delle costole che procedono su entrambi i lati. Tirare il costole / sterno in modo che il timo è chiaramente visibile. Nota: Thymus si trova direttamente sopra il cuore, costituito da 2 lobi ed è di colore bianco traslucido. </li><li> Utilizzando una pinza curva, paletta delicatamente e tirare i lobi del timo fuori del tessuto connettivo e il trasferimento in soluzione di lavaggio (vedi elenco dei materiali). </li></ol></li><li> Preparare la soluzione di digestione miscelando 9 ml RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medio-1640), 0,025 mg / ml di collagenasi purificato, 10 mM HEPES [4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic], e 0,2 mg / ml DNase I in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare la soluzione di digestione nel 37 ° C bagnomaria fino al momento dell&#39;uso. Nota: La quantità della soluzione di digestione preparata è sufficiente per un massimo di cinque adulti thymi mouse, che può essere incubato in un unico 5 ml polistirene round-tubo inferiore. </li><li> Trasferire il timo ad un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri contenente 5-6 ml RPMI-1640. </li><li> Sezionare il timo con 28 g di insulina siringa in piccoli pezzi (circa 1 mm 3 quadrato) per lasciare che i linfociti defluire. </li><li> Sciacquare i pezzi del timo con RPMI-1640 che è nella capsula di Petri con vetro pipetta Pasteur. Inclinare il piatto e lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo. Lentamente aspirare e scartare il surnatante RPMI-1640 con una pipetta di vetro. Ripetere questo passaggio risciacquo con 5-6 ml di RPMI-1640 per 4-5 volte con pipetta di vetro fino a quando la soluzione è meno opaco. Nota: pipette di vetro sono raccomandati in questa fase, dal momento che i frammenti timici tendono ad attaccarsi alla plastica, con conseguente perdita eccessiva di tessuto del timo. Per il resto della procedura, utilizzare pipette di plastica. </li><li> Dopo il risciacquo finale, scartare il surnatante come descritto al punto 1.5. Aggiungere la soluzione di digestione 3 ml e trasferire i pezzi timo e la soluzione in un 5 ml a fondo rotondo ptubo olystyrene. </li><li> Posizionare il tubo su un rotatore tubo e incubare a 37 ° C per 6 minuti ad una velocità di rotazione di 12 rpm. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lasciare che i frammenti timici depositano sul fondo della provetta per gravità. Raccogliere il surnatante con la pipetta Pasteur e trasferire in una provetta da centrifuga da 50 ml con 10 ml di soluzione di lavaggio. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in soluzione di lavaggio 10 ml. Tenere in ghiaccio. </li><li> Ripetere i passaggi 1,6-1,8 per due volte sui frammenti timici in 5 ml di tubo in polistirene a fondo rotondo. In comune il surnatante nello stesso tubo da 50 ml. Nota: centrifugazione non è necessario che il secondo e il terzo lavaggio. </li><li> Dopo la digestione finale, pipettare su e giù con una pipetta sierologica 2 ml di plastica per abbattere eventuali frammenti residui nel tubo e trasferimento in provetta da centrifuga da 50 ml. </li><li> Centrifugare la provetta 50 ml a 300 xg per 5 min, aspirare il surnatante, risospendere in 10 ml di lavaggio buffeR e filtro attraverso 100 micron colino cella. Tenere in ghiaccio. </li></ol> 2. Arricchimento della TEC con discontinuo gradiente di densità <ol><li> Preparare 21% soluzione gradiente di densità miscelando 2,4 ml densità media pendenza (60% w / v di iodixanolo in acqua) e 9,6 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Centrifugare le cellule del timo dissociate in tubo da 50 ml di raccolta dal punto 1.11 a 300 xg per 5 minuti e risospendere in tampone di 2,5 ml di lavaggio. </li><li> Aggiungere mezzo 20 ml RPMI-1640 alla sospensione cellulare. </li><li> Riempire 12 ml di soluzione di gradiente di densità del 21% in un 10 ml pipetta sierologica con una pipetta elettronica. Posizionare la punta della pipetta sierologica al fondo dei 50 ml cellule provetta da centrifuga contenenti, e lasciare che la soluzione gradiente di densità per drenare il fondo della provetta per gravità. <ol><li> espellere delicatamente la soluzione gradiente di densità della pipetta per terminare generare i due strati di diversa densità. </li></ol></li><li> Centrifugare a 600 xg for 20 min a temperatura ambiente in un rotore oscillante secchio. Impostare la velocità di decelerazione al livello più lento. </li><li> Trasferire lo strato superiore e l&#39;interfaccia per un nuovo tubo 50 ml. Nota: La maggior parte dei TEC vengono mantenuti nell&#39;interfaccia. Linfociti precipitano al fondo della provetta dopo centrifugazione. Se queste cellule devono essere utilizzati per altri scopi, lavare il pellet con 20 ml di soluzione di lavaggio per tre volte. Risospendere le cellule in 10 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Aggiungere la soluzione di lavaggio fino a 40 ml al tubo nella fase 2.6 e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Per rimuovere il surnatante, aspirare con una pipetta. </li><li> Ripetere il lavaggio e l&#39;aspirazione altre 2 volte come descritto al punto 2.7. </li><li> Risospendere in 2 ml di soluzione di lavaggio e contare le cellule con un emocitometro. </li></ol> 3. TEC isolamento con FACS <ol><li> Regolare cellule dal punto 2.9 alla concentrazione di 1x10 6 cellule / 100 microlitri con soluzione di lavaggio e trasferimentole cellule in una provetta da 5 ml a fondo rotondo (polipropilene o polistirolo, come raccomandato dalle istruzioni del sorter flusso). </li><li> Aggiungere 2 microlitri anti-recettore Fc IgG a 1x10 6 cellule e incubare a 4 ° C per 10 min. </li><li> Aggiungere anti-CD45 (1: 150 diluizione, 10 microlitri per campione) e anti-EpCAM (diluizione 1: 100, 10 microlitri per campione) anticorpi e incubare a 4 ° C per più di 20 min. </li><li> Lavare le cellule con soluzione di lavaggio 2 ml e centrifugare a 400 xg per 6 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante con una pipetta. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml 1x tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Filtrare 100 micron colino. </li><li> Applicare le cellule allo strumento di smistamento. Selezionare il linfocita e la popolazione TEC escludendo le più piccole celle luce laterale-dispersa (SSC) / luce avanti dispersa (FSC) del pannello (cellule morte), poi cancello sulla popolazione selezionata per CD45- EpCAM + 13 per l&#39;ordinamento. </li></ol> 4. Generation di TEC / EAK Aggregati Nota: eseguire la preparazione e passaggi che coinvolgono cellule mescolare sotto il cofano laminare reagente. <ol><li> Preparare pA / G complessi adattatore mescolando 4 ml di anti-His-tag IgG, 8 ml di anti-IgG EpCAM e 2,6 ml di pA / G in una sterile 1,5 ml provetta, e incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Regolare le TEC ordinati dal punto 3.7 a 5x10 4 cellule / ml con soluzione di lavaggio, e pipetta 100 ml ad un pozzetto di una evaporazione basso, a 96 pozzetti a fondo tondo piastra di coltura tissutale. Aggiungere 14,6 microlitri complessi adattatore pA / G per le cellule. Porre la piastra su una piattaforma oscillante per 20 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare una volta con 200 ml soluzione di lavaggio. Centrifugare la piastra a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta. </li><li> Risciacquare una volta con soluzione di saccarosio 200 microlitri 10%. Centrifugare a 400 g per 6 min. Eliminare il surnatante con una micropipetta. </li><li> Risospendere le cellule in 30 ml 10% ssoluzione di saccarosio terile per pozzetto. </li><li> Aggiungere 10 ml di EAKIIH6 (7,5 mg / ml) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 20 ml di EAK16-II (10 mg / ml) alla miscela TEC. </li><li> Aggiungere 100 ml di terreno completo al sistema di avviare gelificazione. Posizionare la piastra su un agitatore piattaforma per 15-20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Porre la piastra in incubatore a 37 ° C e 5% CO 2. Dopo 2-4 ore, aggiungere altri 100 ml di terreno completo. </li><li> Cambiare medio a giorni alterni fino al momento dell&#39;uso. <ol><li> Aspirare 100 microlitri del mezzo dalla superficie senza disturbare il gel utilizzando una micropipetta e aggiungere delicatamente 100 pl di mezzo pre-riscaldato posizionando la punta della pipetta alla parete del pozzo. </li></ol></li></ol> 5. Caratterizzazione dei TEC / EAK Aggregati <ol><li> Per esaminare la funzione degli aggregati TEC / EAK in vivo, raccogliere la TEC / EAK idrogel dopo O / N e la cultura del trapianto sotto la capsula renale di un nudo atimicimouse, utilizzando in precedenza procedura descritta 11,14. </li><li> Monitorare lo sviluppo delle cellule T nella periferia raccogliendo campioni di sangue 50-100 microlitri nel tubo di raccolta del sangue EDTA contenenti da topi nudi 4-6 settimane dopo il trapianto e macchia con un cocktail di anti-CD4, -CD8, -CD45 e -CD3 anticorpi 12. </li><li> Analizzare le percentuali di linfociti T nei leucociti del sangue periferico con citometria di flusso (FCM), utilizzando un&#39;unica cella software di analisi 12. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Mentre TEC sono la popolazione predominante dello stroma del timo e svolgono ruoli essenziali per la struttura e la funzione del timo, essi rappresentano solo circa il 0,1-0,5% della cellularità timica totale. Sono anche cellule fragili come alte percentuali di morte cellulare sono occasionalmente osservati dopo digestione collagenasi, cioè, il trattamento dissociare TEC dalla matrice extracellulare (ECM). La loro rarità (~ 200.000 al timo del mouse) e la fragilità reso un compito impegnativo per isolare TEC. I...

Il timo è l&#39;organo linfoide primaria responsabile per la generazione di una popolazione eterogenea di cellule T auto-tolerant patogeno-reattivo che è essenziale per la funzione del sistema immunitario acquisito. Si tratta di un organo dinamico dove timociti di sviluppo, immigrarono dal midollo osseo come cellule linfociti progenitrici, migrano attraverso il tridimensionale (3-D) a matrice spugnosa dello stroma timico, sottoposti lineage-specifiche e differenziazione, e infine emigrare maturo T-cellule. Il successo di questo processo ben programmato dipende in gran parte sul cross-talk tra i timociti migrazione e le cellule epiteliali del timo residenziali (TEC), la popolazione predominante dello stroma timica che sono essenziali per stabilire e mantenere l&#39;integrità del microambiente del timo. Sulla base della loro posizione anatomica e funzione unica, TEC può essere suddiviso in due sottoinsiemi: TEC nella corteccia (CTEC) che sono responbile per la selezione di auto-MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) limitato cellule T (selezione positiva), e le TEC nella midollare (mTECs) che sono essenziali per eliminare le cellule T autoreattive (selezione negativa) 1,2. Molti fattori (ad esempio, l&#39;invecchiamento, infezioni, irradiazione, droga trattamenti) possono causare danni irreversibili per l&#39;epitelio timico, con conseguente compromissione immunità adattativa. Nonostante i numerosi tentativi, ripristinando la funzione timica è stata difficile a causa della difficoltà di riprodurre il microambiente timico. In particolare, timica tridimensionale (3-D) configurazione è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione del TEC, mentre TEC coltivate in un ambiente 2-D diminuire rapidamente l&#39;espressione di geni critici per timopoiesi 3,4. EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) e il suo C-terminale analogico histidinylated EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) sono a basso peso molecolare, oligopeptidi anfifilici che sono solubili in tardo deionizzatar, ma sottoposto gelificazione per formare beta fibrille quando esposto a forza ionica superiore a 20 mM NaCl (concentrazione salina normale in fluido corporeo umano è 154 mM). La struttura, situata reattivo ambientali li rende mattoni versatili per formare strutture in 3D. Il His-tag su EAKII-H6 fornisce un meccanismo di aggancio, con la quale gli anti-His IgG / Fc-legame proteina ricombinante A / G (αH6: pA / G) complessi possono servire come un adattatore per ancorare farmaci proteici e altre biomolecole ( ad esempio, anticorpi) sul idrogel composita 5-8. Abbiamo precedentemente dimostrato che le molecole fluorescenti marcato IgG ancorate sul idrogel possono essere conservati al sito di iniezione per un massimo di 13 giorni 9. Inoltre, quando i αH6: adattatori pA / G ancorate con l&#39;anti-CD4 IgG sono stati aggiunti al idrogel EAK16-II / EAKIIH6 (EAK), cellule T CD4 + sono stati specificamente catturati 10. Usando una tecnica simile, abbiamo recentemente dimostrato che il 3-D aggregazione di TEC could essere promosso in EAK idrogel con complessi di adattamento che trasportano gli anticorpi anti-EpCAM specifici-TEC (αH6: PA / G: αEpCAM). Quando trapiantato sotto le capsule reni di topi nudi, i grappoli TEC incorporato in EAK idrogel possono supportare efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo 11,12. Qui illustriamo il nostro metodo di rapido ed efficace purificare TEC con l&#39;ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) e generare aggregati TEC 3-D con il sistema EAK idrogel.

<table><tbody><tr><td>TEC Isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701 (1 gallone)</td><td>Ethanol 200 Proof, acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione, dritto</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Graefe, diritte</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11053-10</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Graefe, curva</td><td>Fine Science Tools, Inc.</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di lavaggio</td><td></td><td></td><td>1x PBS, 0,1% BSA, 2&nbsp; mM EDTA</td></tr><tr><td>1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albumina sierica bovina)</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (acido etilendiamminotetraacetico)</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione</td><td></td><td></td> digestiva <td>9 ml RPMI-1640, 0,025&nbsp; mg/ml Liberase TM Grado di ricerca, 10&nbsp; mM HEPES, 0,2&nbsp; mg/ml DNaseI</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Roche</td><td>05 401 127 001</td><td>indicato come "collagenasi purificata"</td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Provetta da centrifuga</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; piatto per coltura tissutale in mm</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>1/2&nbsp; cc U-100 Siringa da insulina 28&nbsp; 1/2&nbsp; G</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo in polistirene a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml pipetta in vetro</td><td>Fisher Healthcare</td><td>13-678-27E</td><td>Utilizzare per il risciacquo dei frammenti di timo. I frammenti di timo tendono ad attaccarsi al muro con pipette di plastica.</td></tr><tr><td>Rotatore per provette MACSmix</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>100&nbsp; &micro; m Filtro cellulare</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Gradiente di densità medio: OptiPrep</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sorting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5&nbsp; ml Tubo a fondo tondo</td><td>in polipropilene Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Utilizzare come non diluito, 2&nbsp; &micro; l per campione</td></tr><tr><td>Anti-topo CD45-PercpCy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-0451-80</td><td>Utilizzare a 1:150, 10&nbsp; &micro; l per campione</td></tr><tr><td>Anti-topo CD326 (EpCAM)-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5791-82</td><td>Utilizzare a 1:100, 10&nbsp; &micro; l per campione</td></tr><tr><td>BD Influx</td><td>BD Biosciences Software per</td> l'analisi di <td></td><td></td></tr><tr><td>singole cellule</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EAK Gel Assembly</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-His-Tag</td><td>AnaSpec</td><td>29673</td><td>"anti-His-Tag IgG"</td></tr><tr><td>Purificato anti-topo CD326 (EpCAM)</td><td>BioLegend</td><td>118202</td><td>"anti-EpCAM IgG"</td></tr><tr><td>Proteina ricombinante A/G</td><td>Pierce Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Provette Safe-Lock, Biopur, sterili</td><td>Fisher Healthcare</td><td>05-402-24B</td><td>indicato come "1.5&nbsp; provetta per microcentrifuga ml"</td></tr><tr><td>96-well, Piastra per coltura tissutale, Fondo rotondo con coperchio a bassa evaporazione</td><td>BD Falcon</td><td>353917</td><td></td></tr><tr><td>Piattaforma oscillante: Nutator Mixer no.1105</td><td>BD Clay Adams</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td>Preparare con acqua distillata sterile</td></tr><tr><td>EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)</td><td>American Peptide Company& nbsp;</td><td></td><td>sintetizzato su misura, 10&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHHH-CONH2)</td><td>American Peptide Company&nbsp;</td><td></td><td>sintetizzato su misura, 7,5&nbsp; mg/ml</td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> completo <td>RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Streptococco, 1% L-glutammina, 1% NEAA, 5&nbsp; mM HEPES, 50&nbsp; &micro; M 2-Mercaptoetanolo</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11879-020</td><td></td></tr><tr><td>FBS (Siero fetale bovino)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Calore inattivato prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 200&nbsp; mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>NEAA (aminoacido non essenziale) 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>1&nbsp; M HEPES</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (100x)</td><td>Millipore</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore a piattaforma: La danzatrice del ventre</td><td>Stovall Life Sciences Inc.</td><td>modello: USBDbo</td><td></td></tr></tbody></table>

la promozione 3-d di aggregazione delle cellule facs purificata timica epiteliali con eak 16-ii / eakiih6 autoassemblanti idrogel

Promoting 3-D Aggregation of FACS Purified Thymic Epithelial Cells with EAK 16-II/EAKIIH6 Self-assembling Hydrogel

L'involuzione del timo, associata all'invecchiamento o a insulti patologici, provoca una diminuzione della produzione di cellule T mature. Il ripristino della funzione di un timo difettoso è fondamentale per mantenere un'efficace risposta immunitaria acquisita mediata dalle cellule T contro i patogeni invasori. Tuttavia, la rigenerazione e la rivitalizzazione del timo si sono rivelate impegnative, in gran parte a causa delle difficoltà di riprodurre l'esclusivo microambiente 3D dello stroma timico che è fondamentale per la sopravvivenza e la funzione delle cellule epiteliali timiche (TEC). Abbiamo sviluppato un nuovo sistema di idrogel per promuovere la formazione di aggregati TEC, basato sulla proprietà autoassemblante degli oligopeptidi anfifilici EAK16-II e del suo analogo istidinilato EAKIIH6. Le TEC sono state arricchite da cellule timiche isolate con gradiente di densità, selezionate con smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e marcate con anticorpi anti-molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) che sono stati ancorati, insieme a IgG anti-Hi, sui complessi adattatori della proteina A/G. La formazione di aggregati cellulari è stata promossa incubando i TEC con oligopeptidi EAKIIH6 e EAK16-II, e quindi aumentando la concentrazione ionica del mezzo per avviare la gelificazione. Gli aggregati TEC incorporati nell'idrogel di EAK possono promuovere efficacemente lo sviluppo di cellule T funzionali in vivo quando trapiantati nei topi nudi atimici.

Per esaminare l'efficacia di utilizzare il protocollo di separazione gradiente di densità per arricchire le cellule stromali CD45-, cellule raccolte sia l'interfaccia e il pellet di linfociti precipitati sono state colorate con anti-CD45 e anti-EpCAM. Entrambi anti-Ulex Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) e anticorpi anti-MHC di classe II sono stati inclusi anche nel cocktail colorazione per identificare ulteriormente i sottoinsiemi CTEC e MTEC. Come mostrato in Figura 1, siam...

Questo video dimostra un protocollo per arricchire le cellule epiteliali timiche (TEC) con gradiente di densità per l'isolamento FACS. Mostra anche l'uso di peptidi EAK16-II/EAKIIH6 per promuovere la formazione di aggregati TEC. I microambienti dell'idrogel EAK16-II/EAKIIH6 forniscono la configurazione 3D necessaria per mantenere la sopravvivenza e la funzione dei TEC.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing ...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso del peptide EAK 16-II/EAKIIH6 nel promuovere l'aggregazione delle cellule epiteliali del timo in una struttura tridimensionale per supportare l'autosopravvivenza e la funzione dell'epitelio del timo. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della bioingegneria del timo. I principali vantaggi di questa tecnica sono che utilizza il peptide EAK-16-II/EAKIIH6, promuove l'aggregazione delle cellule epiteliali del timo, è biodegradabile e ha il potenziale per essere utilizzata per le iniezioni.Per raccogliere il timo, inizia mettendo un topo C57 nero 6J di tre o cinque settimane in posizione supina e bagna il pelo con etanolo al 70%. Usando le forbici da dissezione affilate e diritte, praticare una piccola incisione orizzontale attraverso la pelle addominale. Quindi tirare la pelle su entrambi i lati dell'incisione per esporre la cavità addominale.Quindi, eseguire un taglio orizzontale appena sotto la nervatura più bassa e tagliare lateralmente al diaframma. Usando una pinza, tira il processo xifoideo e taglia il centro delle costole lungo entrambi i lati del torace. Sollevare le costole e lo sterno in modo che il timo sia chiaramente visibile.Quindi, usando una pinza curva, raccogli delicatamente i lobi del timo dal tessuto connettivo e mettili nella soluzione di lavaggio. Dopo il risciacquo, trasferire il timo in una piastra di coltura tissutale da 16 millilitri contenente da cinque a sei millilitri di RPMI 1640 e utilizzare un ago da insulina calibro 28 per sezionare il tessuto in pezzi quadrati di circa un millimetro cubo. Quindi, usa una pipetta pasteur di vetro per sciacquare i frammenti di tessuto con il mezzo nel piatto.Quindi, inclinare il piatto, lasciando che i frammenti si depositino sul fondo. Rimuovere lentamente il surnatante medio mediante aspirazione. Quindi ripetere il lavaggio altre quattro o cinque volte con cinque o sei millilitri di terreno fresco ogni volta fino a quando la soluzione diventa meno opaca.Dopo il lavaggio finale, aggiungere tre millilitri di soluzione digestiva al piatto e trasferire i pezzi di timo e la soluzione in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri. Incubare i tessuti su un rotatore di provette a 37 gradi Celsius per sei minuti a 12 giri/min. Al termine della rotazione, lasciare che i frammenti si depositino sul fondo della provetta e utilizzare una pipetta pasteur per trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 millilitri contenente 10 millilitri di soluzione di lavaggio.Centrifugare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di soluzione di lavaggio fresca su ghiaccio. Quindi digerire i frammenti di timo altre due volte nel rotatore come appena dimostrato, tirando il surnatante nello stesso tubo da 50 millilitri. Dopo la digestione finale, utilizzare una pipetta sierologica di plastica da due millilitri per triturare eventuali frammenti rimanenti e trasferire il turbinio dei tessuti nella provetta da 50 millilitri.Centrifugare il tubo per raccogliere le celle e risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone di lavaggio. Quindi, filtrare le cellule attraverso un colino da 100 micron mentre la provetta viene posta sul ghiaccio. Per arricchire le cellule epiteliali del timo, centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet in 2,5 millilitri di tampone di lavaggio.Successivamente, aggiungere 20 millilitri di RPMI 1640 alle cellule e utilizzare una pipetta sierologica da 10 millilitri per sovrapporre accuratamente 12 millilitri di soluzione di gradiente di densità al 21% appena preparata sotto le cellule per gravità. A questo punto, è possibile separare le celle mediante centrifugazione in un rotore a secchiello oscillante alla velocità di decelerazione più lenta. Al termine della centrifugazione, trasferire lo strato superiore e l'interfaccia in una nuova provetta da 50 millilitri e aggiungere fino a 40 millilitri di soluzione di lavaggio alle cellule.Rimuovere il gradiente di densità mediante tre centrifugazioni consecutive utilizzando una pipetta per aspirare il surnatante dopo ogni lavaggio. Quindi risospendere il pellet finale in due millilitri di soluzione di lavaggio per il conteggio. Per generare gli aggregati EAK di cellule epiteliali del timo, regolare le cellule epiteliali del timo a una diluizione di cinque volte 10 per quattro cellule per millilitro nella soluzione di lavaggio e seminare 100 microlitri di cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a fondo tondo a 96 pozzetti a bassa evaporazione.Successivamente, aggiungere 14,6 microlitri di complessi adattatori di proteine AG appena preparati a ciascun pozzetto e posizionare la piastra su una piattaforma oscillante a quattro gradi Celsius. Dopo 20 minuti, lavare le cellule con 200 microlitri di soluzione di lavaggio per pozzetto, utilizzando una micropipetta per rimuovere il surnatante. Quindi, lavare nuovamente le cellule con 200 microlitri di soluzione di saccarosio al 10%.Risospendere i pellet in 30 microlitri di soluzione sterile di saccarosio al 10% per pozzetto. Quindi, incubare le cellule in 10 microlitri di EAKIIH6 per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, aggiungere 20 microlitri di EAK 16-II, seguiti da 100 microlitri di terreno completo e posizionare la piastra su una piattaforma a temperatura ambiente per avviare la gelificazione.Dopo 15-20 minuti, trasferire la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per due o quattro ore. Quindi aggiungere altri 100 microlitri di terreno completo e rimettere la piastra nell'incubatrice. Per cambiare il terreno, utilizzare una micropipetta per aspirare 100 microlitri di terreno dalla superficie delle colture senza disturbare il gel e posizionare la punta contro le pareti di ciascun pozzetto per seminare le colture con 100 microlitri di terreno preriscaldato.Utilizzando il protocollo di separazione a gradiente di densità, come appena dimostrato, le cellule stromali CD45 negative possono essere arricchite di routine da 15 a 20 volte, come illustrato in questi dot plot rappresentativi. Qui, aggregati di cellule epiteliali del timo, preparati da topi transgenici di quattro settimane che esprimono la fluorescenza rossa, sono stati coltivati per due giorni in vitro ed esaminati al microscopio confocale. Una volta padroneggiate, le cellule epiteliali del timo possono essere arricchite per lo smistamento a flusso in tre o quattro ore.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale del timo per sviluppare mini unità di timo iniettabili e funzionali per modulare il sistema immunitario adattativo.

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Immunologia e Infezioni

In questo video la preparazione di 2-dGuo trattati reaggregate culture timo è dimostrata.

Reaggregate Culture Thymus

Vi presentiamo i protocolli per le 3 dimensioni (3D) incapsulamento delle celle all'interno di idrogel sintetico. La procedura di incapsulamento viene delineato per due metodi comunemente usati di reticolazione (michael-tipo di addizione e di luce iniziata meccanismi di radicali liberi), come pure una serie di tecniche per la valutazione del comportamento delle cellule incapsulate.

Incapsulamento cellulare in idrogel 3D per l&#39;ingegneria tissutale

Qui si descrive l'uso di un auto-assemblaggio 3-dimensionale patibolo alla cultura cellule umane progenitrici neurali. Vi presentiamo un protocollo per liberare le cellule dai ponteggi da analizzare successivamente, ad esempio mediante citometria di flusso. Questo protocollo potrebbe essere adattato per altri tipi di cellule per effettuare studi dettagliati meccanicisticamente.

La coltivazione di cellule progenitrici neurali umane in un 3-dimensionale di auto-assemblaggio Peptide Hydrogel

Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Per la creazione di strutture altamente organizzate di tessuti complessi, è necessario assemblare più materiali e tipi di cellule in un composito integrato.  Questo design combinatorio incorpora fogli cellulari stratificati specifici per organo con due materiali distinti di derivazione biologica contenenti una forte base di matrice fibrosa e cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi.

Ingegneria dei tessuti: Costruzione di un multicellulare 3D Ponteggio per la consegna di Layered fogli Cellulari

Lo studio delle cellule epiteliali midollari del timo in vitro è stato in gran parte infruttuoso, poiché gli attuali sistemi di coltura 2D non imitano lo scenario in vivo. Il sistema di coltura 3D qui descritto - un modello di coltura organotipica della pelle modificata - si è dimostrato superiore nella ricapitolazione della proliferazione, della differenziazione e del mantenimento dell'espressione genica promiscua di mTEC.

3D organotipica Co-cultura Modello Sostenere midollare timica epiteliale proliferazione, differenziazione e promiscua genica

Idrogeli di ingegneria della proteina ricombinanti sono vantaggiosi per la coltura cellulare 3D poiché consentono completa accordabilità della catena polimerica e di conseguenza, il microambiente delle cellule. Qui, descriviamo il processo di purificazione della proteina ricombinante elastino-simili e la sua applicazione in incapsulamento cella 3D idrogel.

Produzione di elastina-come proteina idrogeli per incapsulamento e Immunostaining delle cellule in 3D

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Formazione di organoidi di timo umano in idrogel di fibrina tridimensionali

Scopri come promuovere l'aggregazione tridimensionale di cellule epiteliali timiche purificate con FACS utilizzando l'idrogel autoassemblante EAK16-II/EAKIIH6. Questo metodo supporta la sopravvivenza cellulare.

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel (Video) | JoVE Journal

La promozione 3-D di aggregazione delle cellule FACS purificata timica epiteliali con EAK 16-II / EAKIIH6 autoassemblanti idrogel

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