Name: Studiando lorganizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane allinterno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Scopri l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche nei tessuti fogliari mediante criomicroscopia elettronica a scansione congelata. Questa tecnica preserva lo stato nativo dei campioni per un'imaging ad alta risoluzione.

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Ringraziamo Andres Kaech (Università di Zurigo) per i suoi consigli utili sulla scansione di immagini al microscopio elettronico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Stati Uniti-Israele binazionale di ricerca agricola e lo sviluppo (concessione n. US-4334-10, ZR), la Israel Science Foundation (Grant n. 1034/12, ZR), e la Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Gli studi di microscopia elettronica sono stati condotti presso l&#39;Irving e Cherna Moskowitz Center for Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science.

1. Cryo-fissaggio di Leaf tessuti per congelamento ad alta pressione Nota: Questa sezione descrive come effettuare ad alta pressione congelamento dei tessuti fogliari per un esperimento di congelamento-frattura. Per considerazioni relative ai campioni di piante vedere 29. Questo può essere adattato per altri tipi di tessuti o campioni con alcune modifiche. <ol><li> Utilizzando l&#39;angolo di una lama di rasoio, graffiare il fondo della cavità 0.1 mm di una piastrina di alluminio di 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparare almeno una dozzina di piastrine (6 campioni). Fare attenzione a non creare marchi coltello sulla circonferenza del disco. <ol><li> Dopo graffi, lavare i dischi in etanolo assoluto, lasciarli asciugare e conservare in un piatto pulito. </li></ol></li><li> Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione secondo le istruzioni del produttore. Riempire camera di alcol della macchina di congelamento ad alta pressione con isopropanolo. </li><li> Preparare un vacuum-assisted infiltratio fatta in casan dispositivo per sostituire il gas che si trova nel tessuto fogliare di liquido. <ol><li> Strettamente collegare un puntale 200 microlitri al fine di una siringa da 10 ml. Tagliare ~ 1 cm dalla punta. Fare un foro nel tappo di una provetta da 1,5 ml a stretto misura la punta tagliata. Vuoto può essere creato all&#39;interno del tubo tirando lo stantuffo della siringa. </li></ol></li><li> Tagliare un piccolo pezzo di foglia dalla pianta utilizzando una lama di rasoio e con le pinzette posizionare la foglia all&#39;interno di una provetta riempito a metà con 1-esadecene. Infiltrati spazi intercellulari della foglia con il liquido tirando delicatamente lo stantuffo per creare il vuoto, tenere premuto per circa 30 secondi, quindi rilasciare lentamente lo stantuffo. </li><li> Rimuovere il pezzo foglia dal tubo con una pinzetta. Tagliare il foglio con una lama di rasoio in caso è più spesso di 0,2 mm e tagliare un piccolo pezzo che si inserisce in una delle piastrine. </li><li> Mettere una piastrina pulita con il lato graffiato fino nel supporto della macchina di congelamento e quindi inserire il pezzo tagliato di leaf in piastrine. Riempire lo spazio rimanente che circonda la foglia con 1-esadecene. Chiudere il sandwich utilizzando un altro piastrinica, con i graffi di fronte al foglio. </li><li> Chiudere e serrare il supporto e inserirlo nella camera della macchina. Quindi premere il pulsante &#39;Jet&#39; di congelare (~ 2.100 bar per 300-500 msec), e trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Rimuovere con attenzione il panino congelato dal supporto con una pinzetta pre-raffreddamento, facendo attenzione a non fratturare il panino. Nota: i panini surgelati chiuso può essere congelamento fratturato immediatamente o conservato in azoto liquido per un uso successivo. Usare indumenti protettivi e occhiali durante la manipolazione di azoto liquido. </li></ol> 2. Fermo-frattura e doppio strato di rivestimento 27,28 <ol><li> Preparare la macchina frattura congelamento per l&#39;uso, tra cui entrambe le pistole per evaporazione del platino / carbonio (Pt / C) e carbonio, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare la pistola Pt / C a 45 gradi unnd la pistola di carbonio a 90 gradi. <ol><li> Pre-programma di un ciclo di uno strato di 2 nm di Pt / C (tasso di rivestimento 0.02 - 0.04 nm / sec) e uno strato 6 nm di carbonio (a ~ 0.1 nm / sec). <ol><li> Inserisci il setup sullo schermo della macchina freeze-frattura. Selezionare un numero utente in cui verrà salvato il sistema di rivestimento. </li><li> Scegli Pt / C per &#39;livello 1&#39;. Selezionare un intervallo di tempo, ad esempio., 5 min (per superare il tempo necessario necessario per completare il rivestimento). Utilizzare le frecce su-giù per definire uno spessore di 2 nm. </li><li> Premere il pulsante &#39;Layer&#39; per passare al livello 2. Ripetere il punto 2.1.1.2, tranne selezionare carbonio e definire uno spessore di 6 nm. </li></ol></li><li> Testare e regolare il funzionamento della pistola. <ol><li> Seleziona &#39;livello 1&#39;. Selezionare la pistola Pt / C premendo il pulsante &#39;GUN1&#39; e premere il pulsante &#39;ON&#39; sull&#39;unità di controllo di evaporazione della macchina freeze-frattura. Monitorare la velocità di evaporazione e regolare utilizzando le manopole di tensione e di emissioni until raggiungimento di un tasso di 0,02 - 0.04 nm / sec. Premere &#39;OFF&#39; per spegnere la pistola Pt / C. </li><li> Seleziona &#39;livello 2&#39;. Ripetere 2.1.2.1, tranne selezionare &#39;GUN2&#39; e regolare per un tasso di evaporazione del ~ 0.1 nm / sec. </li></ol></li></ol></li><li> Raffreddare la fase di sistema di fratture congelamento a -140 C o -160 C (per le foglie idratati o disidratati, rispettivamente). Fissare la navetta di trasferimento vacuum crio alla macchina e riempire la sua camera con azoto liquido. Pressione nella camera di congelamento-frattura raffreddato è generalmente fra 1 - 8 x 10 -7 mbar. </li><li> Inserire un supporto esemplare congelamento fratturazione (adatto per le piastrine 3 mm) nella stazione di carico. Inondare la camera di stazione di carico con azoto liquido. </li><li> Caricare due panini congelate destinate al titolare uno ad uno con alta precisione pinzette grade. Serrare il primo panino nel supporto e poi capovolgere il supporto a controllare che si adatta saldamente in posizione. Ripetere l&#39;operazione per il secondo panino. </li><li> Detach la navetta raffreddato dalla macchina frattura congelamento e collegarlo alla stazione di carico. Aprire la valvola shuttle, introdurre il braccio retrattile nel supporto e bloccarlo in posizione. Reintrodurre il braccio con il supporto nella navetta e chiudere la valvola a navetta con la manopola stazione di carico. Fissare la navetta per la macchina di congelamento-frattura e introdurre il supporto nella camera con il braccio retrattile. Staccare la navetta dalla macchina. </li><li> Allineare il coltello microtomo frattura congelamento ad un&#39;altezza tale che possa staccare le prime piastrine dei panini. </li><li> Con il coltello microtomo, rompere rapidamente i panini, e poi subito sollevarla per evitare la contaminazione dei campioni da detriti aggrappato al coltello, e ruotare l&#39;otturatore raffreddata sopra del piano appena esposto per proteggere i campioni da eventuali contaminazioni da molecole di acqua la Camera. </li><li> Cappotto i campioni con il platino e carbonio. <ol><li> Inserire &#39;livello 1&#39; sul scReen. Accendere la pistola Pt / C premendo il pulsante &#39;GUN1&#39; seguito dal tasto &#39;ON&#39;. Esaminate la velocità di evaporazione e, una volta raggiunta 0.02 - 0.04 nm / sec, esporre contemporaneamente i campioni e premere il tasto &#39;Measure&#39; per controllare lo spessore dello strato depositato. Nota: Gun si spegne automaticamente quando lo spessore raggiunge il valore pre-selezionato. </li><li> Coprire i campioni con l&#39;otturatore quando Pt / C evaporazione è completata. </li><li> Premere il pulsante &#39;Layer&#39; per passare a &#39;livello 2&#39;. Ripetere i punti 2.8.1 e 2.8.2, con l&#39;eccezione di selezionare &#39;GUN2&#39; (per il carbonio) e un tasso di evaporazione di ~ 0,1 nm / sec. </li></ol></li><li> Scaldare la fase di sistema di fratture congelamento a -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-microscopia elettronica a scansione <ol><li> Preparare il microscopio elettronico a scansione per il lavoro crio. <ol><li> Selezionare Fase / Fase di inizializzazione dal menu principale e confermare. </li><li> Selezionare Strumenti / Goto pannello, e aprire il pannello &#39;Airlock&#39; selezionandolo dalla lista. Fare clic sul pulsante &#39;Chiudi Colonna camera della valvola&#39;. Ventilare la camera microscopio facendo clic sul pulsante Vent nella scheda &#39;vuoto&#39;. </li><li> Selezionare Strumenti / Goto Panel, e aprire il pannello &#39;punti tappa List&#39;. Selezionare la posizione di crio-scambio per spostare il palco per le coordinate appropriate per l&#39;accettazione supporto del campione. Nota: La &#39;posizione di crio-scambio&#39; è preimpostata per essere in allineamento con la posizione dell&#39;unità di trasferimento a vuoto. </li><li> Aprire la camera campione con un pulito paio di guanti e inserire il crio-stage sul palco principale del microscopio. Chiudere la camera e fare clic sul pulsante della pompa sotto la &#39;scheda del vuoto&#39;. </li><li> Raffreddare il microscopio a -120 ° C. Riempire il microscopio Dewar con azoto liquido. Attivare la funzione di calore sull&#39;unità di controllo crio-transfer a -120 C una volta la temperatura della fase scende sotto -120 ° C. </li></ol></li><li> Attach la navetta crio-trasferimento al microscopio e trasferire il supporto del campione usando il braccio retrattile in fase di microscopio crio (come nel passaggio 2.5). Staccare la navetta dal microscopio. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Open Colonna camera della valvola&#39; nel Pannello Airlock. </li><li> muoversi con cautela il titolare del campione vicino alla lente dell&#39;obiettivo (distanza di lavoro 1 - 2 mm) utilizzando il joystick. Selezionare un&#39;apertura di 10 micron nella scheda &#39;aperture&#39;. Fare doppio clic sul campo EHT nella scheda &#39;Gun&#39;. Inserire 10 (kV) per il target EHT e fare clic su OK. Fare clic sulla scheda EHT basso e selezionare &#39;EHT On&#39;. </li><li> Seleziona &#39;InLens&#39; dall&#39;elenco a discesa rivelatori nella scheda &#39;rivelatori&#39;. Ottimizzare le condizioni di imaging (messa a fuoco, luminosità e contrasto, allineamento del fascio, astigmatismo) a seconda dei casi. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;Scansione&#39;. Scegliere una scansione veloce ( &#39;Scan Speed ​​= 1&#39;, corrispondente ad un tempo di permanenza di 100 nsec per pixel) per minimizzare i danni del fascio, euna &#39;risoluzione Store&#39; di 1.024 x 768 pixel. Seleziona &#39;Linea Avg&#39; nel menu a discesa la &#39;riduzione del rumore&#39;. Regolare il valore di N per 20 - 30 linee per la ricerca. Spostare il campione utilizzando la funzione &#39;Centre Point&#39; (premendo Ctrl-Tab sulla tastiera) per cercare per le regioni con le cellule fratturate e cloroplasti (figure 2a e 2b). </li><li> Acquisire le immagini di cloroplasti fratturati a basso ingrandimento (50 - 70 kX) (Figura 2C e 2D). Utilizzare la funzione di &#39;Centro Feature&#39; (premendo Control-Shift-Tab sulla tastiera) per ingrandire in interessanti volti della frattura cloroplasto e acquisire immagini ad alti ingrandimenti (100-200 kX, figure 3 e 4). Utilizzare gli stessi parametri come al punto 3.6 per l&#39;acquisizione delle immagini, ma cambiare la linea del valore medio per N&gt; 100 per la riduzione del rumore 30. <ol><li> Premere FREEZE sull&#39;unità di controllo del microscopio principale o nella scheda &#39;Scansione&#39; per fermare la scansione e salvarel&#39;immagine premendo il pulsante &#39;Salva TIFF&#39;. </li></ol></li></ol> Analisi 4. Immagine Nota: Questa sezione descrive una breve procedura per la segmentazione di particelle di membrana da immagini freeze-frattura SEM utilizzando il pacchetto open-source Fiji 31. Risultati simili possono essere ottenuti con altri software di analisi di immagine. <ol><li> Apri l&#39;immagine con le Figi trascinando file immagine nella finestra principale del programma. Convertire l&#39;immagine a 8 bit selezionando Immagine / Tipo / 8-bit. Seleziona Immagine / Regola / Luminosità / Contrasto e regolare come necessario (Figura 5A). </li><li> Utilizzando lo strumento linea retta, tracciare una linea delle dimensioni della barra di scala immagine incorporata. Selezionare Analizza / Set Scala. Immettere le informazioni di scala adeguata (distanza nota e l&#39;unità di lunghezza) e fare clic su OK. Salva questa immagine in scala regolata. </li><li> Selezionare Processo / filtri / sfocatura gaussiana (1,5 raggio nm) e fare clic su OK (Figura 5B). </li><li> Seleziona Immagine / Regola / AutO soglia locale (utilizzando il metodo Niblack) e fare clic su OK (Figura 5C). </li><li> Selezionare Modifica / invertito e poi di processo / Binario / Watershed (Figura 5D). </li><li> Disegna un bordo intorno alla regione di interesse (ROI) con lo strumento Selezione a mano libera. Aggiungere la selezione al gestore ROI selezionando Modifica / Selezione / Aggiungi al Manager o cliccando su &#39;T&#39;. </li><li> Selezionare Modifica / Liberata Esterno (Figura 5E). </li><li> Selezionare Analizza / Set Misure, scegliere i parametri appropriati (ad esempio, area, ellisse in forma). </li><li> Selezionare Analizza / Analyze particelle. Inserisci una gamma appropriata per la dimensione delle particelle e segnare &#39;Risultati&#39;, &#39;Aggiungi al Manager&#39; e, se necessario, il &#39;Escludi sui bordi&#39; opzione e fare clic su OK. Il risultato è mostrato in Figura 5F. </li><li> Aprire il file ripreso in scala salvato (passo 4.2). Seleziona &#39;Mostra tutto&#39; e deselezionare &#39;etichette&#39; nella ROI Manager. Rivedere il partic selezionatoles posato sul immagine originale e aggiungere o rimuovere le selezioni utilizzando il &#39;Aggiungi&#39; o &#39;Cancella&#39; pulsanti del ROI Manager manualmente. Correggere eventuali selezioni necessarie utilizzando lo strumento Selezione a mano libera e il pulsante &#39;Aggiorna&#39; del ROI Manager (figure 5G e 5H). </li><li> Analizzare i dati utilizzando le misure ottenute. Nella finestra Risultati, fare clic su Risultati / Riassumere per ottenere, ad esempio, l&#39;area media, e dire Maggiore e assi minori delle particelle elencati nel ROI Manager. Clicca Risultati / Distribuzione, selezionare un parametro (come Area) e fare clic su OK per visualizzare un istogramma per questo parametro. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La tecnica descritta in questo documento permette di indagine di membrane freeze-fratturato nel contesto dei tessuti vegetali congelati alta pressione ben conservate mediante microscopia elettronica crio-scansione. Il principale vantaggio di utilizzare queste procedure è che la preparazione del campione è puramente fisica; non sono necessarie operazioni che coinvolgono sostanze chimiche o disidratazione. Quindi, consente lo studio delle strutture biologiche in uno stato quasi native 26,32. Il vantaggio di uti...

la fotosintesi Oxygenic, originari di antica cianobatteri, fu ereditato da alghe e piante terrestri da eventi endosimbiontica che hanno portato allo sviluppo del organello cloroplasto. In tutti i fototrofi Oxygenic moderni, di trasporto degli elettroni fotosintetica e la generazione di forza proton-motrice e potere riducente sono svolte all&#39;interno di vescicole sac-come appiattite denominati membrane &#39;tilacoidali. Queste membrane ospitano complessi proteici che effettuano le reazioni luce-driven di fotosintesi e forniscono un mezzo per la trasduzione di energia. Le membrane tilacoidi di piante e di (alcuni) alghe si differenziano in due domini morfologiche distinte: le regioni di membrana strettamente appressed chiamati &#39;grana&#39; e membrane unstacked che interconnettono la grana, chiamati &#39;stroma lamelle&#39; 1. sono stati condotti diversi studi freeze-frattura degli impianti e delle membrane tilacoidi algali, a partire dai primi anni 1970. Quando freeze-fratturato, membraneraggruppati lungo il loro core idrofobico 2, generando una faccia exoplasmic (EF) e una faccia protoplasmatico (PF), a seconda del compartimento cellulare cui i confini semi-membrana, come originariamente coniato da Branton et al. . nel 1975 3 Impianti e tilacoidi alghe hanno quattro diverse facce della frattura: EF, EFU, FP e PFU, con &#39;s&#39; e che denotano e regioni &#39;u&#39; &#39;&#39; &#39;impilati unstacked&#39; membrana, rispettivamente. I complessi di proteine ​​di membrana, che non sono tagliati o rotti, hanno la tendenza a rimanere sia con la E o laterale P della membrana. Le osservazioni iniziali che le diverse facce della frattura dei tilacoidi contengono particelle di diverse dimensioni e densità 4, e le numerose indagini che seguirono, ha portato all&#39;identificazione e correlazione tra le particelle osservate ed i complessi proteici di membrana che svolgono le reazioni luce 5-13 (vedi anche 14,15). freesperimenti di Eze-frattura delle membrane tilacoidi sono in genere effettuate su preparazioni di cloroplasti o isolate membrane tilacoidi (ma si veda 16,17), con il rischio di ogni cambiamento di / organizzazione strutturale e supramolecolare o che possono verificarsi durante la procedura di isolamento. A seguito della frattura, repliche sono preparati mediante evaporazione del platino / carbonio (Pt / C), poi da uno spesso strato di carbonio (C), ed infine la digestione del materiale biologico 18. Repliche vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La tecnica di congelamento-frattura-replica tradizionale continua a servire come un importante strumento per lo studio della organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche e il loro adattamento al diverso, ad esempio., La luce, le condizioni di 19-23. Nel nostro recente studio della pianta risurrezione homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, abbiamo voluto indagare i cambiamenti nell&#39;organizzazione o supramolecolaremembrane tilacoidi f, nonché in grado di organizzazione cellulare, durante la disidratazione e reidratazione. L&#39;unicità di specie resurrezione homoiochlorophyllous è che sono in grado di sopravvivere in condizioni di disidratazione nelle loro tessuti vegetativi (foglie), pur mantenendo la loro fotosintetico. Una volta che l&#39;acqua è disponibile, queste piante recuperare e riprendere l&#39;attività fotosintetica in poche ore ad alcuni giorni 25. Per questo studio, crio-scanning EM (SEM) per immagini di campioni di foglie freeze-fratturato è stato combinato con alta pressione congelamento per il campione crio-immobilizzazione. Queste procedure forniscono un mezzo per visualizzare campioni biologici congelati idratati in uno stato vicino al loro stato nativo 26. Un vantaggio principale è che i campioni vengono esaminati direttamente dopo freeze-frattura e rivestimento senza passaggi successivi. Ciò è particolarmente rilevante per l&#39;indagine di piante a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), come il loro stato di idratazione viene mantenuto durante la preparazione. Comemai, uno svantaggio fondamentale è che i campioni congelati-idratato possono soffrire di danni fascio durante l&#39;imaging, soprattutto quando scansione ad alti ingrandimenti, necessari per la misurazione accurata delle dimensioni di complessi fotosintetici. Per ovviare a questo, un metodo chiamato &#39;rivestimento a doppio strato&#39; (DLC) 27,28 combinata con state utilizzate condizioni specifiche di imaging crio-SEM. Questi hanno portato in campioni che sono significativamente meno-fascio sensibile e ha permesso per la delucidazione delle preziose informazioni sulla proteina fotosintetica organizzazione supramolecolare e di altri costituenti cellulari della pianta risurrezione C. pumilum ad alti ingrandimenti in situ.

<table><tbody><tr><td>Etanolo abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-esadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0,1/0,2 Piastrine</td><td>Ufficio di ingegneria M. Wohlwend GmbH, Svizzera</td><td>241</td><td>Le piastrine hanno un diametro di 3 mm e uno spessore di 0,5 mm (Tipo A) con cavità profonde 0,1/0,2 mm (di diametro 2 mm). Piastrine simili possono essere ottenute da Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Pinzette di alta precisione Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Svizzera) Pinzette Durostar style #5; Può essere sostituito con altre pinzette ad alta precisione.</td></tr><tr><td>Macchina per surgelazione ad alta pressione</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternative per il congelamento ad alta pressione: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Sistema di congelamento-frattura</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Fase di carico della preparazione criogenica</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per la fratturazione a freddo univerale</td>, <td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Supporto per morsetti per portacampioni di diametro 3 mm</td></tr><tr><td>Navetta per criotrasferimento sottovuoto</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM stage</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>delle immagini Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari gelo-fratturati da cryo-microscopia elettronica a scansione

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

microscopia elettronica Cryo-scansione (SEM) di campioni freeze-fratturato permette di indagine delle strutture biologiche in condizioni vicine native. Qui, descriviamo una tecnica per studiare l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane (tilacoidali) all&#39;interno di campioni di foglie. Ciò si ottiene alta pressione congelamento del tessuto fogliare, liofilizzazione fratturazione, rivestimento a doppio strato e infine l&#39;imaging crio-SEM. L&#39;utilizzo del metodo di rivestimento a doppio strato consente l&#39;acquisizione di alto ingrandimento (&gt; 100,000X) le immagini con danni raggio minimo per i campioni congelati idratata così come gli effetti di ricarica minimi. Usando le procedure descritte abbiamo studiato le alterazioni nella distribuzione del fotosistema supramolecolare e proteine ​​antenna luce raccolta complessi che si svolgono durante la disidratazione della pianta risurrezione Craterostigma pumilum, in situ.

La figura 1 mostra le immagini crio-SEM di piastrine contenenti alta pressione congelati, freeze-fratturati Craterostigma pezzi di foglia pumilum. In alcuni campioni, ampie regioni di cellule fratturati sono ottenuti (Figura 1A). In altri, il pezzo foglio rimane strettamente legata al disco superiore e viene buttato giù con esso (Figura 1B). Tuttavia, anche nel secondo caso, un po &#39;di tessuto fogliare può rimanere a...

Qui descriviamo una procedura per studiare i tessuti vegetali fratturati da congelamento. I campioni di foglie congelate ad alta pressione sono fratturati a freddo e rivestiti a doppio strato, producendo campioni congelati e idrati ben conservati che vengono riprodotti utilizzando il microscopio elettronico a crioscansione ad alti ingrandimenti con danni minimi al fascio.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è studiare l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche mediante microscopia elettronica a scansione criogenica di campioni di tessuto fogliare congelati e fratturati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare, come la caratterizzazione morfologica di cellule e organelli, la distribuzione dei complessi proteici integrali alla membrana e la localizzazione dei biominerali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la fratturazione criogenica viene eseguita su tessuti fogliari, consentendo così di analizzare l'organizzazione supramolecolare della membrana tilacoide nel contesto nativo dell'organello e della cellula.Sebbene questo metodo sia qui dimostrato per un campione biologico, può essere applicato anche a gel, polimeri e sistemi di somministrazione dei farmaci. In generale, chi è alle prime armi con queste procedure deve sapere che non tutti i campioni si congeleranno bene o si frattureranno correttamente. Per eseguire la crio-fissazione di tessuti fogliari mediante congelamento ad alta pressione, iniziare utilizzando l'angolo di una lama di rasoio per graffiare il fondo d

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Vi presentiamo un protocollo di come raccogliere e elettrone processo di crio-tomografie di tutta mitocondri. La tecnica fornisce approfondimenti dettagliati sulla struttura, funzione, e l'organizzazione di grandi complessi proteici di membrana nelle membrane biologiche autoctone.

Visualizzazione di ATP sintetasi Dimeri nei mitocondri da Electron Cryo-tomografia

Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l'esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l'ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici.

Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Ottenere immagini di microscopia elettronica a trasmissione di alta qualità è impegnativo, soprattutto nel caso delle cellule vegetali, che hanno abbondanti vacuoli pieni d'acqua e spazi aerati. Il congelamento ad alta pressione in tandem e la sostituzione rapida del congelamento riducono notevolmente i tempi di preparazione dei campioni di piante per la TEM, producendo al contempo campioni con un'eccellente conservazione ultrastrutturale.

Tandem congelamento ad alta pressione e congelamento rapido Sostituzione di tessuti vegetali per la microscopia elettronica a trasmissione

Questo articolo descrive la metodologia di microscopia crioelettronica, che viene utilizzata per ottenere immagini microscopiche di alta qualità di macromolecole nel loro stato quasi nativo. Il metodo produce immagini adatte per un'ulteriore elaborazione computerizzata utilizzando l'approccio della singola particella, ideato per generare la ricostruzione 3D di una macromolecola.

Cosa fare e cosa non fare di Cryo-microscopia elettronica: A Primer su preparazione del campione e raccolta dati di alta qualità per la ricostruzione macromolecolare 3D

Questo protocollo viene descritto come visualizzare la compattazione DNA transitoria nei cianobatteri. Coltivazione sincrono, monitoraggio di microscopia di fluorescenza, congelamento rapido e alta tomografia di cryo-elettrone di tensione sono usati. Un protocollo per queste metodologie è presentato, e sono discussi gli sviluppi e le applicazioni future.

Visualizzazione di compattazione del DNA nei cianobatteri tramite tomografia ad alta tensione Cryo-elettrone

Osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xilema fornisce informazioni significative per quanto riguarda la dinamica del flusso d'acqua nelle piante legnose. In questo studio, dimostriamo l'approccio pratico per osservare la distribuzione dell'acqua xylem in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM, che elimina i cambiamenti artifactuali nello stato dell'acqua durante la preparazione del campione.

Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Utilizzo della fresatura a fascio ionico focalizzato per produrre lamelle vetrose su griglia da campioni biologici congelati a immersione per la tomografia crioelettronica.

Preparazione di lamelle da campioni biologici vitreali utilizzando un microscopio elettronico a scansione a doppio raggio per la tomografia crioelettronica

Presentiamo un protocollo per la preparazione lamellare di campioni biologici surgelati a tuffo mediante microlavorazione a fascio ionico crio-focalizzato per studi strutturali ad alta risoluzione di macromolecole in situ con tomografia crioeletnico. Il protocollo presentato fornisce linee guida per la preparazione di lamelle di alta qualità ad alta riproducibilità per la caratterizzazione strutturale di macromolecole all'interno del Saccharomyces cerevisiae.

Preparazione e microlavorazione Cryo-FIB di Saccharomyces cerevisiae per Tomografia Crioeletnico

Il presente protocollo descrive l'acquisizione remota dei dati della tomografia crioelettronica ad alta risoluzione utilizzando Tomo5 e la successiva elaborazione dei dati e la media dei sottotomogrammi utilizzando emClarity. L'apoferritina è usata come esempio per illustrare dettagliati processi passo-passo per ottenere una struttura crio-ET con una risoluzione di 2,86 Å.

Tomografia crioelettronica Raccolta dati remota e media dei sottotomogrammi

La tomografia crio-STEM fornisce un mezzo per visualizzare organelli di cellule intatte senza incorporamento, sezionamento o altre preparazioni invasive. La risoluzione 3D ottenuta è attualmente nell'intervallo di pochi nanometri, con un campo visivo di diversi micrometri e uno spessore accessibile nell'ordine di 1 μm.

Visualizzazione di organelli in situ mediante tomografia crio-STEM

Scopri l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche nei tessuti fogliari mediante criomicroscopia elettronica a scansione congelata. Questa tecnica preserva lo stato nativo dei campioni per un'imaging ad alta risoluzione.

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