Name: Studiando lorganizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane allinterno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 52 s
Description: Scopri l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche nei tessuti fogliari mediante criomicroscopia elettronica a scansione congelata. Questa tecnica preserva lo stato nativo dei campioni per un'imaging ad alta risoluzione.

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Ringraziamo Andres Kaech (Università di Zurigo) per i suoi consigli utili sulla scansione di immagini al microscopio elettronico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo Stati Uniti-Israele binazionale di ricerca agricola e lo sviluppo (concessione n. US-4334-10, ZR), la Israel Science Foundation (Grant n. 1034/12, ZR), e la Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Gli studi di microscopia elettronica sono stati condotti presso l&#39;Irving e Cherna Moskowitz Center for Nano e Bio-Nano Imaging presso il Weizmann Institute of Science.

1. Cryo-fissaggio di Leaf tessuti per congelamento ad alta pressione Nota: Questa sezione descrive come effettuare ad alta pressione congelamento dei tessuti fogliari per un esperimento di congelamento-frattura. Per considerazioni relative ai campioni di piante vedere 29. Questo può essere adattato per altri tipi di tessuti o campioni con alcune modifiche. <ol><li> Utilizzando l&#39;angolo di una lama di rasoio, graffiare il fondo della cavità 0.1 mm di una piastrina di alluminio di 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparare almeno una dozzina di piastrine (6 campioni). Fare attenzione a non creare marchi coltello sulla circonferenza del disco. <ol><li> Dopo graffi, lavare i dischi in etanolo assoluto, lasciarli asciugare e conservare in un piatto pulito. </li></ol></li><li> Preparare la macchina di congelamento ad alta pressione secondo le istruzioni del produttore. Riempire camera di alcol della macchina di congelamento ad alta pressione con isopropanolo. </li><li> Preparare un vacuum-assisted infiltratio fatta in casan dispositivo per sostituire il gas che si trova nel tessuto fogliare di liquido. <ol><li> Strettamente collegare un puntale 200 microlitri al fine di una siringa da 10 ml. Tagliare ~ 1 cm dalla punta. Fare un foro nel tappo di una provetta da 1,5 ml a stretto misura la punta tagliata. Vuoto può essere creato all&#39;interno del tubo tirando lo stantuffo della siringa. </li></ol></li><li> Tagliare un piccolo pezzo di foglia dalla pianta utilizzando una lama di rasoio e con le pinzette posizionare la foglia all&#39;interno di una provetta riempito a metà con 1-esadecene. Infiltrati spazi intercellulari della foglia con il liquido tirando delicatamente lo stantuffo per creare il vuoto, tenere premuto per circa 30 secondi, quindi rilasciare lentamente lo stantuffo. </li><li> Rimuovere il pezzo foglia dal tubo con una pinzetta. Tagliare il foglio con una lama di rasoio in caso è più spesso di 0,2 mm e tagliare un piccolo pezzo che si inserisce in una delle piastrine. </li><li> Mettere una piastrina pulita con il lato graffiato fino nel supporto della macchina di congelamento e quindi inserire il pezzo tagliato di leaf in piastrine. Riempire lo spazio rimanente che circonda la foglia con 1-esadecene. Chiudere il sandwich utilizzando un altro piastrinica, con i graffi di fronte al foglio. </li><li> Chiudere e serrare il supporto e inserirlo nella camera della macchina. Quindi premere il pulsante &#39;Jet&#39; di congelare (~ 2.100 bar per 300-500 msec), e trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Rimuovere con attenzione il panino congelato dal supporto con una pinzetta pre-raffreddamento, facendo attenzione a non fratturare il panino. Nota: i panini surgelati chiuso può essere congelamento fratturato immediatamente o conservato in azoto liquido per un uso successivo. Usare indumenti protettivi e occhiali durante la manipolazione di azoto liquido. </li></ol> 2. Fermo-frattura e doppio strato di rivestimento 27,28 <ol><li> Preparare la macchina frattura congelamento per l&#39;uso, tra cui entrambe le pistole per evaporazione del platino / carbonio (Pt / C) e carbonio, secondo le istruzioni del produttore. Posizionare la pistola Pt / C a 45 gradi unnd la pistola di carbonio a 90 gradi. <ol><li> Pre-programma di un ciclo di uno strato di 2 nm di Pt / C (tasso di rivestimento 0.02 - 0.04 nm / sec) e uno strato 6 nm di carbonio (a ~ 0.1 nm / sec). <ol><li> Inserisci il setup sullo schermo della macchina freeze-frattura. Selezionare un numero utente in cui verrà salvato il sistema di rivestimento. </li><li> Scegli Pt / C per &#39;livello 1&#39;. Selezionare un intervallo di tempo, ad esempio., 5 min (per superare il tempo necessario necessario per completare il rivestimento). Utilizzare le frecce su-giù per definire uno spessore di 2 nm. </li><li> Premere il pulsante &#39;Layer&#39; per passare al livello 2. Ripetere il punto 2.1.1.2, tranne selezionare carbonio e definire uno spessore di 6 nm. </li></ol></li><li> Testare e regolare il funzionamento della pistola. <ol><li> Seleziona &#39;livello 1&#39;. Selezionare la pistola Pt / C premendo il pulsante &#39;GUN1&#39; e premere il pulsante &#39;ON&#39; sull&#39;unità di controllo di evaporazione della macchina freeze-frattura. Monitorare la velocità di evaporazione e regolare utilizzando le manopole di tensione e di emissioni until raggiungimento di un tasso di 0,02 - 0.04 nm / sec. Premere &#39;OFF&#39; per spegnere la pistola Pt / C. </li><li> Seleziona &#39;livello 2&#39;. Ripetere 2.1.2.1, tranne selezionare &#39;GUN2&#39; e regolare per un tasso di evaporazione del ~ 0.1 nm / sec. </li></ol></li></ol></li><li> Raffreddare la fase di sistema di fratture congelamento a -140 C o -160 C (per le foglie idratati o disidratati, rispettivamente). Fissare la navetta di trasferimento vacuum crio alla macchina e riempire la sua camera con azoto liquido. Pressione nella camera di congelamento-frattura raffreddato è generalmente fra 1 - 8 x 10 -7 mbar. </li><li> Inserire un supporto esemplare congelamento fratturazione (adatto per le piastrine 3 mm) nella stazione di carico. Inondare la camera di stazione di carico con azoto liquido. </li><li> Caricare due panini congelate destinate al titolare uno ad uno con alta precisione pinzette grade. Serrare il primo panino nel supporto e poi capovolgere il supporto a controllare che si adatta saldamente in posizione. Ripetere l&#39;operazione per il secondo panino. </li><li> Detach la navetta raffreddato dalla macchina frattura congelamento e collegarlo alla stazione di carico. Aprire la valvola shuttle, introdurre il braccio retrattile nel supporto e bloccarlo in posizione. Reintrodurre il braccio con il supporto nella navetta e chiudere la valvola a navetta con la manopola stazione di carico. Fissare la navetta per la macchina di congelamento-frattura e introdurre il supporto nella camera con il braccio retrattile. Staccare la navetta dalla macchina. </li><li> Allineare il coltello microtomo frattura congelamento ad un&#39;altezza tale che possa staccare le prime piastrine dei panini. </li><li> Con il coltello microtomo, rompere rapidamente i panini, e poi subito sollevarla per evitare la contaminazione dei campioni da detriti aggrappato al coltello, e ruotare l&#39;otturatore raffreddata sopra del piano appena esposto per proteggere i campioni da eventuali contaminazioni da molecole di acqua la Camera. </li><li> Cappotto i campioni con il platino e carbonio. <ol><li> Inserire &#39;livello 1&#39; sul scReen. Accendere la pistola Pt / C premendo il pulsante &#39;GUN1&#39; seguito dal tasto &#39;ON&#39;. Esaminate la velocità di evaporazione e, una volta raggiunta 0.02 - 0.04 nm / sec, esporre contemporaneamente i campioni e premere il tasto &#39;Measure&#39; per controllare lo spessore dello strato depositato. Nota: Gun si spegne automaticamente quando lo spessore raggiunge il valore pre-selezionato. </li><li> Coprire i campioni con l&#39;otturatore quando Pt / C evaporazione è completata. </li><li> Premere il pulsante &#39;Layer&#39; per passare a &#39;livello 2&#39;. Ripetere i punti 2.8.1 e 2.8.2, con l&#39;eccezione di selezionare &#39;GUN2&#39; (per il carbonio) e un tasso di evaporazione di ~ 0,1 nm / sec. </li></ol></li><li> Scaldare la fase di sistema di fratture congelamento a -120 ° C. </li></ol> 3. Cryo-microscopia elettronica a scansione <ol><li> Preparare il microscopio elettronico a scansione per il lavoro crio. <ol><li> Selezionare Fase / Fase di inizializzazione dal menu principale e confermare. </li><li> Selezionare Strumenti / Goto pannello, e aprire il pannello &#39;Airlock&#39; selezionandolo dalla lista. Fare clic sul pulsante &#39;Chiudi Colonna camera della valvola&#39;. Ventilare la camera microscopio facendo clic sul pulsante Vent nella scheda &#39;vuoto&#39;. </li><li> Selezionare Strumenti / Goto Panel, e aprire il pannello &#39;punti tappa List&#39;. Selezionare la posizione di crio-scambio per spostare il palco per le coordinate appropriate per l&#39;accettazione supporto del campione. Nota: La &#39;posizione di crio-scambio&#39; è preimpostata per essere in allineamento con la posizione dell&#39;unità di trasferimento a vuoto. </li><li> Aprire la camera campione con un pulito paio di guanti e inserire il crio-stage sul palco principale del microscopio. Chiudere la camera e fare clic sul pulsante della pompa sotto la &#39;scheda del vuoto&#39;. </li><li> Raffreddare il microscopio a -120 ° C. Riempire il microscopio Dewar con azoto liquido. Attivare la funzione di calore sull&#39;unità di controllo crio-transfer a -120 C una volta la temperatura della fase scende sotto -120 ° C. </li></ol></li><li> Attach la navetta crio-trasferimento al microscopio e trasferire il supporto del campione usando il braccio retrattile in fase di microscopio crio (come nel passaggio 2.5). Staccare la navetta dal microscopio. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Open Colonna camera della valvola&#39; nel Pannello Airlock. </li><li> muoversi con cautela il titolare del campione vicino alla lente dell&#39;obiettivo (distanza di lavoro 1 - 2 mm) utilizzando il joystick. Selezionare un&#39;apertura di 10 micron nella scheda &#39;aperture&#39;. Fare doppio clic sul campo EHT nella scheda &#39;Gun&#39;. Inserire 10 (kV) per il target EHT e fare clic su OK. Fare clic sulla scheda EHT basso e selezionare &#39;EHT On&#39;. </li><li> Seleziona &#39;InLens&#39; dall&#39;elenco a discesa rivelatori nella scheda &#39;rivelatori&#39;. Ottimizzare le condizioni di imaging (messa a fuoco, luminosità e contrasto, allineamento del fascio, astigmatismo) a seconda dei casi. </li><li> Fare clic sulla scheda &#39;Scansione&#39;. Scegliere una scansione veloce ( &#39;Scan Speed ​​= 1&#39;, corrispondente ad un tempo di permanenza di 100 nsec per pixel) per minimizzare i danni del fascio, euna &#39;risoluzione Store&#39; di 1.024 x 768 pixel. Seleziona &#39;Linea Avg&#39; nel menu a discesa la &#39;riduzione del rumore&#39;. Regolare il valore di N per 20 - 30 linee per la ricerca. Spostare il campione utilizzando la funzione &#39;Centre Point&#39; (premendo Ctrl-Tab sulla tastiera) per cercare per le regioni con le cellule fratturate e cloroplasti (figure 2a e 2b). </li><li> Acquisire le immagini di cloroplasti fratturati a basso ingrandimento (50 - 70 kX) (Figura 2C e 2D). Utilizzare la funzione di &#39;Centro Feature&#39; (premendo Control-Shift-Tab sulla tastiera) per ingrandire in interessanti volti della frattura cloroplasto e acquisire immagini ad alti ingrandimenti (100-200 kX, figure 3 e 4). Utilizzare gli stessi parametri come al punto 3.6 per l&#39;acquisizione delle immagini, ma cambiare la linea del valore medio per N&gt; 100 per la riduzione del rumore 30. <ol><li> Premere FREEZE sull&#39;unità di controllo del microscopio principale o nella scheda &#39;Scansione&#39; per fermare la scansione e salvarel&#39;immagine premendo il pulsante &#39;Salva TIFF&#39;. </li></ol></li></ol> Analisi 4. Immagine Nota: Questa sezione descrive una breve procedura per la segmentazione di particelle di membrana da immagini freeze-frattura SEM utilizzando il pacchetto open-source Fiji 31. Risultati simili possono essere ottenuti con altri software di analisi di immagine. <ol><li> Apri l&#39;immagine con le Figi trascinando file immagine nella finestra principale del programma. Convertire l&#39;immagine a 8 bit selezionando Immagine / Tipo / 8-bit. Seleziona Immagine / Regola / Luminosità / Contrasto e regolare come necessario (Figura 5A). </li><li> Utilizzando lo strumento linea retta, tracciare una linea delle dimensioni della barra di scala immagine incorporata. Selezionare Analizza / Set Scala. Immettere le informazioni di scala adeguata (distanza nota e l&#39;unità di lunghezza) e fare clic su OK. Salva questa immagine in scala regolata. </li><li> Selezionare Processo / filtri / sfocatura gaussiana (1,5 raggio nm) e fare clic su OK (Figura 5B). </li><li> Seleziona Immagine / Regola / AutO soglia locale (utilizzando il metodo Niblack) e fare clic su OK (Figura 5C). </li><li> Selezionare Modifica / invertito e poi di processo / Binario / Watershed (Figura 5D). </li><li> Disegna un bordo intorno alla regione di interesse (ROI) con lo strumento Selezione a mano libera. Aggiungere la selezione al gestore ROI selezionando Modifica / Selezione / Aggiungi al Manager o cliccando su &#39;T&#39;. </li><li> Selezionare Modifica / Liberata Esterno (Figura 5E). </li><li> Selezionare Analizza / Set Misure, scegliere i parametri appropriati (ad esempio, area, ellisse in forma). </li><li> Selezionare Analizza / Analyze particelle. Inserisci una gamma appropriata per la dimensione delle particelle e segnare &#39;Risultati&#39;, &#39;Aggiungi al Manager&#39; e, se necessario, il &#39;Escludi sui bordi&#39; opzione e fare clic su OK. Il risultato è mostrato in Figura 5F. </li><li> Aprire il file ripreso in scala salvato (passo 4.2). Seleziona &#39;Mostra tutto&#39; e deselezionare &#39;etichette&#39; nella ROI Manager. Rivedere il partic selezionatoles posato sul immagine originale e aggiungere o rimuovere le selezioni utilizzando il &#39;Aggiungi&#39; o &#39;Cancella&#39; pulsanti del ROI Manager manualmente. Correggere eventuali selezioni necessarie utilizzando lo strumento Selezione a mano libera e il pulsante &#39;Aggiorna&#39; del ROI Manager (figure 5G e 5H). </li><li> Analizzare i dati utilizzando le misure ottenute. Nella finestra Risultati, fare clic su Risultati / Riassumere per ottenere, ad esempio, l&#39;area media, e dire Maggiore e assi minori delle particelle elencati nel ROI Manager. Clicca Risultati / Distribuzione, selezionare un parametro (come Area) e fare clic su OK per visualizzare un istogramma per questo parametro. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La tecnica descritta in questo documento permette di indagine di membrane freeze-fratturato nel contesto dei tessuti vegetali congelati alta pressione ben conservate mediante microscopia elettronica crio-scansione. Il principale vantaggio di utilizzare queste procedure è che la preparazione del campione è puramente fisica; non sono necessarie operazioni che coinvolgono sostanze chimiche o disidratazione. Quindi, consente lo studio delle strutture biologiche in uno stato quasi native 26,32. Il vantaggio di uti...

la fotosintesi Oxygenic, originari di antica cianobatteri, fu ereditato da alghe e piante terrestri da eventi endosimbiontica che hanno portato allo sviluppo del organello cloroplasto. In tutti i fototrofi Oxygenic moderni, di trasporto degli elettroni fotosintetica e la generazione di forza proton-motrice e potere riducente sono svolte all&#39;interno di vescicole sac-come appiattite denominati membrane &#39;tilacoidali. Queste membrane ospitano complessi proteici che effettuano le reazioni luce-driven di fotosintesi e forniscono un mezzo per la trasduzione di energia. Le membrane tilacoidi di piante e di (alcuni) alghe si differenziano in due domini morfologiche distinte: le regioni di membrana strettamente appressed chiamati &#39;grana&#39; e membrane unstacked che interconnettono la grana, chiamati &#39;stroma lamelle&#39; 1. sono stati condotti diversi studi freeze-frattura degli impianti e delle membrane tilacoidi algali, a partire dai primi anni 1970. Quando freeze-fratturato, membraneraggruppati lungo il loro core idrofobico 2, generando una faccia exoplasmic (EF) e una faccia protoplasmatico (PF), a seconda del compartimento cellulare cui i confini semi-membrana, come originariamente coniato da Branton et al. . nel 1975 3 Impianti e tilacoidi alghe hanno quattro diverse facce della frattura: EF, EFU, FP e PFU, con &#39;s&#39; e che denotano e regioni &#39;u&#39; &#39;&#39; &#39;impilati unstacked&#39; membrana, rispettivamente. I complessi di proteine ​​di membrana, che non sono tagliati o rotti, hanno la tendenza a rimanere sia con la E o laterale P della membrana. Le osservazioni iniziali che le diverse facce della frattura dei tilacoidi contengono particelle di diverse dimensioni e densità 4, e le numerose indagini che seguirono, ha portato all&#39;identificazione e correlazione tra le particelle osservate ed i complessi proteici di membrana che svolgono le reazioni luce 5-13 (vedi anche 14,15). freesperimenti di Eze-frattura delle membrane tilacoidi sono in genere effettuate su preparazioni di cloroplasti o isolate membrane tilacoidi (ma si veda 16,17), con il rischio di ogni cambiamento di / organizzazione strutturale e supramolecolare o che possono verificarsi durante la procedura di isolamento. A seguito della frattura, repliche sono preparati mediante evaporazione del platino / carbonio (Pt / C), poi da uno spesso strato di carbonio (C), ed infine la digestione del materiale biologico 18. Repliche vengono visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). La tecnica di congelamento-frattura-replica tradizionale continua a servire come un importante strumento per lo studio della organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche e il loro adattamento al diverso, ad esempio., La luce, le condizioni di 19-23. Nel nostro recente studio della pianta risurrezione homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, abbiamo voluto indagare i cambiamenti nell&#39;organizzazione o supramolecolaremembrane tilacoidi f, nonché in grado di organizzazione cellulare, durante la disidratazione e reidratazione. L&#39;unicità di specie resurrezione homoiochlorophyllous è che sono in grado di sopravvivere in condizioni di disidratazione nelle loro tessuti vegetativi (foglie), pur mantenendo la loro fotosintetico. Una volta che l&#39;acqua è disponibile, queste piante recuperare e riprendere l&#39;attività fotosintetica in poche ore ad alcuni giorni 25. Per questo studio, crio-scanning EM (SEM) per immagini di campioni di foglie freeze-fratturato è stato combinato con alta pressione congelamento per il campione crio-immobilizzazione. Queste procedure forniscono un mezzo per visualizzare campioni biologici congelati idratati in uno stato vicino al loro stato nativo 26. Un vantaggio principale è che i campioni vengono esaminati direttamente dopo freeze-frattura e rivestimento senza passaggi successivi. Ciò è particolarmente rilevante per l&#39;indagine di piante a diversi contenuti di acqua relativi (RWC), come il loro stato di idratazione viene mantenuto durante la preparazione. Comemai, uno svantaggio fondamentale è che i campioni congelati-idratato possono soffrire di danni fascio durante l&#39;imaging, soprattutto quando scansione ad alti ingrandimenti, necessari per la misurazione accurata delle dimensioni di complessi fotosintetici. Per ovviare a questo, un metodo chiamato &#39;rivestimento a doppio strato&#39; (DLC) 27,28 combinata con state utilizzate condizioni specifiche di imaging crio-SEM. Questi hanno portato in campioni che sono significativamente meno-fascio sensibile e ha permesso per la delucidazione delle preziose informazioni sulla proteina fotosintetica organizzazione supramolecolare e di altri costituenti cellulari della pianta risurrezione C. pumilum ad alti ingrandimenti in situ.

<table><tbody><tr><td>Etanolo abs</td><td>Bio-Lab</td><td>052505</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Bio-Lab</td><td>162605</td><td></td></tr><tr><td>1-esadecene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7009</td><td></td></tr><tr><td>0,1/0,2 Piastrine</td><td>Ufficio di ingegneria M. Wohlwend GmbH, Svizzera</td><td>241</td><td>Le piastrine hanno un diametro di 3 mm e uno spessore di 0,5 mm (Tipo A) con cavità profonde 0,1/0,2 mm (di diametro 2 mm). Piastrine simili possono essere ottenute da Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Pinzette di alta precisione Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>72706-01</td><td>Dumont (Svizzera) Pinzette Durostar style #5; Può essere sostituito con altre pinzette ad alta precisione.</td></tr><tr><td>Macchina per surgelazione ad alta pressione</td><td>Bal-Tec</td><td>HPM 010</td><td>Alternative per il congelamento ad alta pressione: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.</td></tr><tr><td>Sistema di congelamento-frattura</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM BAF 060</td><td></td></tr><tr><td>Fase di carico della preparazione criogenica</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770228</td><td></td></tr><tr><td>Supporto per la fratturazione a freddo univerale</td>, <td>Leica Microsystems</td><td>16LZ04746VN</td><td>Supporto per morsetti per portacampioni di diametro 3 mm</td></tr><tr><td>Navetta per criotrasferimento sottovuoto</td><td>Leica Microsystems</td><td>EM VCT 100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 055</td><td></td></tr><tr><td>Cryo SEM stage</td><td>Leica Microsystems</td><td>16770299905</td><td></td></tr><tr><td>Software di acquisizione immagini</td><td>SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi</td><td>delle immagini Fiji/Image J, National Institute of Health</td><td>http://fiji.sc/Fiji</td><td></td></tr></tbody></table>

studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari gelo-fratturati da cryo-microscopia elettronica a scansione

Studying the Supramolecular Organization of Photosynthetic Membranes within Freeze-fractured Leaf Tissues by Cryo-scanning Electron Microscopy

microscopia elettronica Cryo-scansione (SEM) di campioni freeze-fratturato permette di indagine delle strutture biologiche in condizioni vicine native. Qui, descriviamo una tecnica per studiare l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane (tilacoidali) all&#39;interno di campioni di foglie. Ciò si ottiene alta pressione congelamento del tessuto fogliare, liofilizzazione fratturazione, rivestimento a doppio strato e infine l&#39;imaging crio-SEM. L&#39;utilizzo del metodo di rivestimento a doppio strato consente l&#39;acquisizione di alto ingrandimento (&gt; 100,000X) le immagini con danni raggio minimo per i campioni congelati idratata così come gli effetti di ricarica minimi. Usando le procedure descritte abbiamo studiato le alterazioni nella distribuzione del fotosistema supramolecolare e proteine ​​antenna luce raccolta complessi che si svolgono durante la disidratazione della pianta risurrezione Craterostigma pumilum, in situ.

La figura 1 mostra le immagini crio-SEM di piastrine contenenti alta pressione congelati, freeze-fratturati Craterostigma pezzi di foglia pumilum. In alcuni campioni, ampie regioni di cellule fratturati sono ottenuti (Figura 1A). In altri, il pezzo foglio rimane strettamente legata al disco superiore e viene buttato giù con esso (Figura 1B). Tuttavia, anche nel secondo caso, un po &#39;di tessuto fogliare può rimanere a...

Qui descriviamo una procedura per studiare i tessuti vegetali fratturati da congelamento. I campioni di foglie congelate ad alta pressione sono fratturati a freddo e rivestiti a doppio strato, producendo campioni congelati e idrati ben conservati che vengono riprodotti utilizzando il microscopio elettronico a crioscansione ad alti ingrandimenti con danni minimi al fascio.

Studiando l&#39;organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all&#39;interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

Cryo-scanning electron microscopy (SEM) of freeze-fractured samples allows investigation of biological structures at near native conditions. Here, we ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è studiare l'organizzazione supramolecolare delle membrane fotosintetiche mediante microscopia elettronica a scansione criogenica di campioni di tessuto fogliare congelati e fratturati. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in biologia cellulare, come la caratterizzazione morfologica di cellule e organelli, la distribuzione dei complessi proteici integrali alla membrana e la localizzazione dei biominerali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la fratturazione criogenica viene eseguita su tessuti fogliari, consentendo così di analizzare l'organizzazione supramolecolare della membrana tilacoide nel contesto nativo dell'organello e della cellula.Sebbene questo metodo sia qui dimostrato per un campione biologico, può essere applicato anche a gel, polimeri e sistemi di somministrazione dei farmaci. In generale, chi è alle prime armi con queste procedure deve sapere che non tutti i campioni si congeleranno bene o si frattureranno correttamente. Per eseguire la crio-fissazione di tessuti fogliari mediante congelamento ad alta pressione, iniziare utilizzando l'angolo di una lama di rasoio per graffiare il fondo della cavità da 0,1 millimetri di una tavoletta di alluminio da 0,1 a 0,2 millimetri.Preparare almeno una dozzina di piastrine per sei campioni. Quindi lavare le piastrine con etanolo assoluto e mantenerle in una capsula pulita. Dopo aver preparato la macchina per la congelazione ad alta pressione, riempire la scatola dei campioni con azoto liquido.Con una lametta, tagliare una piccola porzione di foglia dalla pianta e utilizzare pinzette per posizionare il tessuto all'interno di una provetta per microcentrifuga riempita a metà con un esadecano. Per infiltrare gli spazi intercellulari del tessuto fogliare, inserire la punta del dispositivo di infiltrazione, preparato come descritto nel protocollo testuale, nel foro presente sul coperchio della provetta per microcentrifuga e tirare lo stantuffo per creare un vuoto. Dopo circa 30 secondi, rilasciare lo stantuffo.Successivamente, utilizzando pinzette, rimuovere il pezzo di foglia dal tubo. Usare la lametta per tagliare un frammento di dimensioni sufficientemente ridotte da poter essere inserito in una piastrina. Se necessario, ridurre lo spessore della foglia a meno di 0,2 millimetri.Per evitare il collasso del tessuto, le foglie vengono infiltrate con un liquido prima della congelazione ad alta pressione. Lo spessore del campione viene mantenuto al di sotto di 200 micron per massimizzare la probabilità di ottenere un campione vetrificato. Posizionare una piastrina pulita con il lato graffiato rivolto verso l'alto nel supporto della macchina di congelamento.Quindi posizionare il pezzo di foglia tagliato nella piastrina. Utilizzare un po' di esacene per riempire lo spazio rimanente della piastrina prima di applicare un'altra piastrina con le incisioni rivolte verso la foglia per chiudere il sandwich. Chiudere e serrare il supporto.Congelare il campione premendo il pulsante del getto. Successivamente, trasferire rapidamente il supporto in azoto liquido. Utilizzare pinzette preraffreddate per rimuovere il sandwich dal supporto, avendo cura di non fratturarlo.Esistono due passaggi critici nella procedura: la rottura criogenica, che è un processo casuale e la cui riuscita può essere valutata solo mediante microscopia elettronica a scansione criogenica, e il rivestimento a doppio strato, necessario per ottenere immagini ad alto ingrandimento con danni minimi da fascio. Durante la preparazione e la programmazione della macchina per la rottura criogenica secondo le istruzioni del produttore, posizionare il cannone al platino-carbonio (Pt/C) a 45 gradi e il cannone al carbonio a 90 gradi. Raffreddare lo stadio del sistema di rottura criogenica a meno 140 o meno 160 gradi Celsius.Quindi collegare il trasferitore criogenico a vuoto alla macchina e utilizzare azoto liquido per riempire la camera del trasferitore. Inserire un portacampioni per frattura criogenica nella stazione di carico e allagare la camera della stazione di carico con azoto liquido. Successivamente, utilizzando pinzette di precisione, caricare un campione congelato a sandwich sul portacampioni e fissarlo saldamente in posizione.Quindi capovolgere il supporto per verificare che il preparato sia fissato correttamente e ripetere l'operazione per un secondo preparato. Staccare lo shuttle raffreddato dalla macchina di criofrattura e collegarlo alla stazione di carico. Aprire quindi la valvola dello shuttle, inserire il braccio di estrazione nel supporto, bloccarlo in posizione ed reinserire il braccio con il supporto all'interno dello shuttle.Dopo aver ricollegato lo shuttle alla macchina di frattura criogenica, inserire il portacampioni nella camera utilizzando il braccio di ritrazione. Regolare ora l'altezza del coltello del microtomo per la frattura criogenica in modo che rimuova i trombociti superiori dei sandwich. Con il coltello del microtomo, rompere rapidamente i sandwich.Quindi sollevare immediatamente il coltello per evitare la contaminazione dei campioni da parte di detriti che potrebbero aderire al coltello. Posizionare lo sportello raffreddato sopra il piano appena esposto per proteggere i campioni da possibili contaminazioni da molecole d'acqua nella camera. Successivamente, per ricoprire i campioni con platino, premere Setup per visualizzare il Livello 1 sullo schermo.Quindi accendere la pistola Pt/C premendo il pulsante GUN 1 seguito dal pulsante ON. Controllare la velocità di evaporazione e, una volta raggiunti 0,02-0,04 nanometri al secondo, premere il pulsante Measure per monitorare lo spessore dello strato depositato mentre si espongono contemporaneamente i campioni. Per ricoprire con carbonio, selezionare GUN 2 seguito dal pulsante ON.Una volta che la velocità di evaporazione è di circa 0,1 nanometri al secondo, premere il pulsante Misura e contemporaneamente spostare lo shuter per esporre i campioni. Quando il rivestimento è completato, riscaldare la piastra a meno 120 gradi Celsius. Per preparare il microscopio elettronico a scansione per lavorare in condizioni criogeniche, selezionare dal menu principale Piastra, Inizializza piastra e confermare.Nella scheda Vuoto, fare clic sul pulsante Vent per aerare la camera del microscopio. Quindi selezionare Strumenti, Pannello Vai e aprire il pannello Elenco Punti della Scena. Selezionare la posizione CRYO EXCHANGE per spostare la scena alle coordinate corrette per accogliere il portacampioni.Indossando un paio pulito di guanti, aprire la camera del campione e inserire la criofase sulla fase principale del microscopio. Chiudere la camera e, nella scheda Vuoto, fare clic sul pulsante Pompa. Successivamente, raffreddare il microscopio riempiendo il duor del microscopio con azoto liquido.Una volta che la temperatura della piastra scende al di sotto di meno 120 gradi Celsius, attivare la funzione di riscaldamento sull'unità di trasferimento criogenico per riscaldare la piastra a meno 120 gradi Celsius. A questo punto, collegare il trasferitore criogenico al microscopio e trasferire il portacampioni mediante il braccio retrattile all'interno della piastra criogenica del microscopio. Utilizzando il joystick, spostare con attenzione il portacampione in prossimità della lente obiettivo.Nella scheda Aperture, selezionare l'apertura da 10 micron. Successivamente, nella scheda Gun, fare doppio clic sul campo EHT Target, inserire 10 chilovolt come valore per l'EHT target e fare clic su OK. Quindi, per attivare la tensione di accelerazione, fare clic sulla scheda EHT inferiore e selezionare EHT On. Nella scheda Detectors, selezionare InLens dall'elenco a discesa. Successivamente, fare clic sulla scheda Scanning e scegliere una velocità di scansione pari a uno, che corrisponde a una scansione rapida per minimizzare i danni del fascio, e una risoluzione di memorizzazione di 1024 per 768 pixel.Nell'elenco a discesa Riduzione del rumore, selezionare Media della linea e regolare il valore di n a 20-30 linee per la ricerca. Successivamente, premendo i tasti Control e Tab sulla tastiera, utilizzare la funzione del punto centrale per spostare il campione verso aree di interesse, ingrandendo contemporaneamente per identificare le regioni con cellule fratturate. Dopo aver individuato le regioni con cellule fratturate, scansionare il campione ingrandendo per trovare un cloroplasto fratturato.Quindi modificare il valore medio della linea di n a un valore superiore a 100, per ridurre il rumore. Nella scheda Scansione, premere Arresta per interrompere la scansione. Premendo Controllo Maiusc Tab sulla tastiera, si utilizza la funzione di centratura per ingrandire le facce di frattura dei cloroplasti di interesse; vengono quindi acquisite immagini ad alto ingrandimento utilizzando gli stessi parametri di prima.Infine, premere il pulsante Salva TIFF per salvare l'immagine. Eseguire l'analisi dell'immagine seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra un'immagine di microscopia elettronica a scansione criogenica (cryo-SEM) di una piastrina contenente un frammento fogliare di Craterostigma pumilum sottoposto a congelamento ad alta pressione e fratturazione criogenica, con una vasta zona di cellule fratturate.In questo esempio, il frammento di foglia è mancante; tuttavia, alcuni tessuti fogliari sono rimasti attaccati alle scanalature del coltello presenti sulla piastrina. Dopo aver individuato una frattura di successo, vengono acquisite immagini a basso ingrandimento delle cellule per identificare regioni di interesse, come cloroplasti fratturati. Vengono acquisite immagini di singoli cloroplasti fratturati per identificare le superfici di frattura delle membrane tilacoidali.Nell'esempio mostrato è riportata un'immagine ad alta magnificazione delle membrane tilacoidali nelle foglie di C. pumilum. È possibile distinguere le quattro diverse facce di frattura. Le facce di frattura esoplasmica delle membrane impilate e non impilate, rispettivamente EFs ed EFu, e le facce di frattura protoplasmica delle membrane impilate e non impilate, rispettivamente PFs e PFu.Il fotosistema II, o PS2, è localizzato sia nelle regioni delle membrane impilate dei grana EFs sia nelle regioni delle membrane stromalamellari EFu. Quando idratato, la densità del PS2 è approssimativamente tre volte maggiore negli EFs rispetto agli EFu, il che differenzia le due facce. Durante la disidratazione di C. pumilum, la densità del PS2 negli EFs diminuisce gradualmente, raggiungendo circa la metà del suo valore in condizioni di idratazione.In particolare, dopo un'ulteriore disidratazione fino al 5-10% di contenuto relativo di acqua, i complessi PS2 si organizzano in file e reticoli. Lo sviluppo della tecnica di replica in frattura congelata ha aperto la strada allo studio delle dimensioni dei complessi proteici di membrana e del loro assetto all'interno delle membrane biologiche. La combinazione della frattura congelata con la congelazione ad alta pressione in SEM crio consente di analizzare diversi tipi di campioni su varie scale dimensionali, dai livelli tessutale e cellulare fino al livello macromolecolare in uno stato prossimo a quello nativo.Oltre alla tecnica qui mostrata, metodi come la spettroscopia a dispersione di energia a raggi X, EDS, possono essere applicati anche nel SEM criogenico; ad esempio, per alcalinizzare i biominerali.

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Studiando lorganizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane allinterno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione (Video) | JoVE Journal

Studiando l'organizzazione supramolecolare di fotosintetici membrane all'interno di tessuti fogliari Gelo-fratturati da Cryo-microscopia elettronica a scansione

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