Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro
3 luglio 2016
La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Un protocollo è presentato per raccogliere e decontaminare nuclei permafrost di suoli e ghiaccio. L'assenza di colonie esogeni e del DNA suggeriscono che i microrganismi rilevate rappresentano il materiale, piuttosto che la contaminazione da perforazione o di trasformazione.
La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che hanno persistito in condizioni ambientali passate. L'obiettivo generale di questa procedura è quello di scoprire la diversità nascosta raccogliendo e rimuovendo con successo il materiale esogeno dai nuclei congelati. Questo metodo può aiutare a rispondere a preziose domande storiche su periodi di tempo selezionati, identificando gli organismi recuperati dal ghiaccio glaciale e dal permafrost.
La raccolta di un nucleo aspetico sul campo è impegnativa data l'alta probabilità di introduzione di contaminanti. Pertanto, il vantaggio principale di questa tecnica è che la rimozione dei contaminanti avviene in un ambiente di laboratorio controllato. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale in quanto le fasi di raschiatura e decontaminazione possono essere difficili da imparare.
È davvero un lavoro di due persone, quindi richiede molta pazienza e soprattutto lavoro di squadra. A dimostrare questa procedura saranno due scienziati di supporto del mio laboratorio, Karen Foley e Robert Jones. Questo protocollo richiede una pulizia meticolosa.
Usa un forno impostato a 450 gradi Celsius per cuocere quanto segue per quattro ore. Rack metallici sterili privi di acidi nucleici, vetreria, pinze metalliche e lana di vetro. Utilizzare un involucro di carta stagnola pesante per evitare la ricontaminazione.
Successivamente, sterilizzare con il filtro l'etanolo all'85% e l'acqua ultrapura utilizzando filtri da 0,22 micron. Questi liquidi devono rimanere a una temperatura pari o inferiore a quattro gradi Celsius o romperanno il campione, facilitandone la contaminazione. Conservare l'etanolo a meno 20 gradi Celsius.
E conserva l'acqua a quattro gradi Celsius. Quindi, sterilizzare un righello di plastica con etanolo al 70%, seguito da una soluzione di decontaminazione del DNA e da una soluzione di decontaminazione con RNasi. Pulire ogni soluzione immediatamente dopo l'applicazione.
Quindi conservare il righello in una busta Whirl-Pak sterile e priva di acidi nucleici. Successivamente, prepara lo spazio della cella frigorifera strofinando prima le pareti, i pavimenti e un banco da lavoro in metallo con l'1% di candeggina. Quindi impostare la temperatura ambiente a circa meno 11 gradi Celsius.
Una volta preparati, indossare tute leggere, guanti in nitrile e maschere quando si trovano nella cella frigorifera per ridurre ogni possibilità di contaminazione della stanza o dei campioni. Questa procedura richiede che due persone lavorino in tandem. Questo può essere difficile considerando le numerose opportunità di ricontaminazione.
Per garantire il successo, ci monitoriamo a vicenda, comunichiamo e cambiamo frequentemente i guanti. Con tutto pronto, portare i materiali sterilizzati e i campioni nella cella frigorifera e posizionarli sul tavolo strofinato con candeggina. Ciò include le colture preparate di S. marcescens.
Per prima cosa il nucleo del permafrost viene posto su un foglio di carta stagnola preparato. Successivamente, l'esterno del nucleo viene leggermente inoculato con una coltura diluita di S. marcescens utilizzando un tappo di schiuma sterile. Quindi, posizionare il torsolo su una griglia metallica sterile sopra un vassoio.
Ora, la lama del microtomo in acciaio viene pulita in modo sterile con etanolo al 70%, soluzione di decontaminazione del DNA e soluzione di decontaminazione con RNasi. Successivamente, il ricercatore A pulisce i guanti in nitrile allo stesso modo. Quindi A tiene il nucleo a un angolo di 45 gradi sopra il vassoio.
B raschia delicatamente circa cinque millimetri dall'esterno dell'intero nucleo, comprese le estremità, utilizzando la lama sterile, mentre A gira il nucleo dopo ogni raschiamento. Se necessario, la lama deve essere ripulita con le tre soluzioni. Successivamente, B versa rapidamente e con attenzione etanolo al 95% sterilizzato con filtro sul nocciolo, mentre A gira il nocciolo.
Quindi, il torsolo viene rapidamente risciacquato con acqua. La griglia metallica sopra il vassoio è stata sostituita e il nucleo è posizionato sulla nuova griglia. A ora pulisce i guanti in nitrile e poi posiziona il torsolo su una griglia pulita sopra il vassoio.
Nel frattempo, B spruzza l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione del DNA, seguito da un risciacquo con acqua sterilizzata con filtro. Successivamente, B spruzza l'intero nucleo con una soluzione di decontaminazione a base di RNasi seguita da un altro risciacquo con acqua. Infine, il nucleo viene inserito in una sacca Whirl-Pak sterile.
Iniziare posizionando una griglia metallica su un piatto di vetro in una cappa biologica a flusso laminare. Quindi posizionare il torsolo sulla rastrelliera di metallo. Lasciare scongelare da due a cinque millimetri della superficie esterna del nucleo per circa 10 minuti.
Durante questo periodo, ruotare il torsolo di 90 gradi ogni due minuti. Dopo lo scongelamento, afferrare un po' di lana di vetro con una pinza e tamponare l'intera superficie del nucleo per raccogliere i batteri. Quindi, inoculare le due piastre utilizzando la lana di vetro.
Quindi, misura le dimensioni esterne del nucleo usando il righello ma non toccare il nucleo. Inoculare anche due piastre aggiuntive con la coltura originale precedentemente utilizzata per drogare l'esterno del nucleo per verificare che le inocule fossero vitali. Quindi, trasferisci il torsolo in un grande sacchetto sterile e conservalo a meno 80 gradi Celsius.
Incubare le piastre inoculate a 23 gradi Celsius per una settimana, quindi esaminarle alla ricerca di colonie di S. marcescens che diventano rosse a questa temperatura. Sebbene questo protocollo preveda una serie di passaggi critici, uno dei più importanti è quello di verificare la crescita di Serratia Marcescens. Se non ci sono colonie di S. marcescens visibili, procedere con la fase successiva di scongelamento.
SE ci sono colonie di S. marcescens, raschiare altri cinque millimetri dal nucleo e ripetere la procedura. Controlla se S.marcescens è cresciuto dalla coltura originale esposta alle basse temperature della cella frigorifera. I campioni sono stati raccolti dal ghiaccio e dal permafrost da un tunnel di 110 metri situato a Fox, in Alaska.
Il tunnel forniva l'accesso al limo ricco di ghiaccio e all'alluvione. I campioni sono stati raccolti in triplice copia. Nelle strutture del New Hampshire sono stati eseguiti i protocolli descritti.
Il gene 16S rRNA è stato sequenziato da batteri cresciuti dai nuclei. Le specie di Pseudomonas dominavano, ma erano presenti anche membri imparentati con Planctomicetia. E, di particolare interesse è stata l'assenza di specie Serratia, che dimostra che il protocollo di decontaminazione ha rimosso sufficientemente il DNA esogeno.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come decontaminare con successo le carote di ghiaccio e permafrost. Una volta padroneggiate, le fasi di lavorazione in cella frigorifera possono essere eseguite in 30-45 minuti se eseguite correttamente. Quando si prova questa procedura, è fondamentale prestare attenzione a tutto e ovunque si tocchi.
In caso di dubbio, basta cambiare i guanti e risterilizzare. Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento degli ampliconi e la metagenomica shotgun possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come quale fosse la composizione delle specie per quel periodo di tempo, o quali attributi funzionali dominassero in quelle condizioni ambientali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere e decontaminare nuclei di permafrost al fine di individuare organismi preservati risalenti a condizioni ambientali passate. La tecnica mira a eliminare materiale esogeno mantenendo l'integrità dei campioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Scienze ambientali
- Criobiologia
Sfondo
- La criosfera contiene organismi preservati che forniscono informazioni sugli ecosistemi storici.
- Il prelievo di campioni da ambienti ghiacciati comporta rischi di contaminazione.
- Comprendere la diversità microbica passata può fornire indicazioni per gli attuali studi ecologici.
- Tecniche di laboratorio controllate sono essenziali per un'analisi accurata.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per il prelievo di carote di permafrost.
- Rimuovere efficacemente i contaminanti in un ambiente di laboratorio.
- Identificare e analizzare i microorganismi provenienti dal ghiaccio glaciale e dal permafrost.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni asettici da permafrost e ghiaccio glaciale.
- Procedure di decontaminazione eseguite in un ambiente controllato.
- Dimostrazioni visive per facilitare l'apprendimento delle tecniche di raschiamento e decontaminazione.
- Analisi del DNA microbico per confermare l'assenza di contaminazioni.
Risultati principali
- Prelievo riuscito di carote di permafrost senza introdurre colonie esogene.
- I microorganismi rilevati sono probabilmente indigeni ai campioni.
- Efficacia dimostrata del protocollo di decontaminazione.
- Forniti spunti sulla diversità microbica storica.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio di organismi conservati in modo privo di contaminazioni.
- Migliora la comprensione delle condizioni ambientali passate.
- Le ricerche future possono basarsi su questi risultati per esplorare l'evoluzione microbica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La decontaminazione dei campioni congelati è fondamentale per un'analisi accurata delle comunità biologiche antiche, garantendo che i microrganismi rilevati riflettano popolazioni indigene piuttosto che contaminazioni esogene. Questo protocollo supporta la validazione degli obiettivi in microbiologia ambientale, consentendo l'estrazione affidabile di segnali endogeni da campioni criopreservati. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nelle applicazioni successive, come il sequenziamento di ampliconi e la metagenomica, stabilendo una base priva di contaminazioni per la riduzione del rischio nei processi meccanicistici di ricostruzione degli ecosistemi storici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando segnali microbici indigeni da permafrost e carote di ghiaccio antichi.
- Valore operativo: Riduce il rischio di falsi positivi nell'identificazione degli obiettivi mediante rigorosa rimozione di DNA esogeno e colonie microbiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive confermando l'assenza di crescita di contaminanti mediante piastratura di Serratia marcescens.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione attraverso punti di controllo quantificabili per la decontaminazione, migliorando la riproducibilità tra diversi lotti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie fornendo accesso a consorzi microbici antichi per l'analisi degli attributi funzionali.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla scoperta al lavoro preclinico mantenendo l'integrità del campione attraverso una decontaminazione controllata.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo test affidabili di ipotesi sulla diversità microbica antica, supportando direttamente l'identificazione dei ceppi mediante approcci di sequenziamento indipendenti dalla coltura.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici confermando l'origine endogena dei microrganismi rilevati attraverso l'assenza di colonie di Serratia aggiunte artificialmente.
- Screening: Permette la prontezza del saggio mediante passaggi standardizzati di decontaminazione che producono campioni privi di contaminazioni, adatti all'estrazione del DNA.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come il conteggio delle unità formanti colonie e i risultati del sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S, per confrontare le condizioni tra diversi campioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo sistemi rilevanti per lo studio dell'adattamento microbico in condizioni ambientali storiche associate a malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'elaborazione dei campioni, applicabile a diversi progetti su permafrost e carote di ghiaccio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione dell'obiettivo grazie alla confermata assenza di materiale esogeno.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante punti di controllo definiti per la decontaminazione e protocolli per camera fredda.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento o interruzione degli investimenti in sequenziamento successivo riducendo il rumore biologico.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei progetti su campioni antichi in base all'efficacia convalidata della decontaminazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della tecnica asettica e della biologia molecolare per prevenire la re-contaminazione durante le manipolazioni.
- È dipendente da strumentazioni quali camere fredde mantenute a -11°C, attrezzature prive di acidi nucleici e cappe a flusso laminare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i passaggi di decontaminazione, inclusi risciacqui con etanolo, trattamenti con DNAse/RNase e procedure di cambio dei guanti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di campioni (ghiaccio rispetto a permafrost), mantenendo costante la rimozione dello strato esterno.
- Limitazione pratica: l'efficacia dipende da un'esecuzione rigorosa dei passaggi di raschiamento e decontaminazione chimica, al fine di evitare segnali esogeni residui.
