Rimozione di materiali esogene dalla parte esterna della congelati core per Indagare sulla antica comunità biologiche ospitava Dentro
3 luglio 2016
La criosfera offre l'accesso a organismi conservati che persiste in condizioni ambientali del passato. Un protocollo è presentato per raccogliere e decontaminare nuclei permafrost di suoli e ghiaccio. L'assenza di colonie esogeni e del DNA suggeriscono che i microrganismi rilevate rappresentano il materiale, piuttosto che la contaminazione da perforazione o di trasformazione.
La criosfera offre accesso a organismi preservati che sono sopravvissuti in condizioni ambientali passate. L'obiettivo generale di questa procedura è svelare la diversità nascosta raccogliendo con successo e rimuovendo il materiale esogeno da campioni congelati. Questo metodo può contribuire a rispondere a importanti domande storiche riguardo specifici periodi temporali, identificando organismi recuperati dal ghiaccio glaciale e dal permafrost.
Il prelievo di un campione sterile in campo è difficoltoso a causa dell'elevata probabilità di introduzione di contaminanti. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica consiste nel fatto che la rimozione dei contaminanti avviene in un ambiente controllato di laboratorio. La dimostrazione visiva di questo protocollo è fondamentale, poiché le fasi di raschiatura e di decontaminazione possono risultare piuttosto difficili da apprendere.
Si tratta davvero di un'operazione che richiede due persone, quindi è necessaria molta pazienza e, soprattutto, spirito di collaborazione. A dimostrare questa procedura saranno due tecnici di supporto del mio laboratorio, Karen Foley e Robert Jones. Questo protocollo richiede una pulizia meticolosa.
Utilizzare un forno impostato a 450 gradi Celsius per cuocere quanto segue per quattro ore: supporti metallici sterili privi di acidi nucleici, vetreria, pinze metalliche e ovatta di vetro. Utilizzare un involucro di stagnola pesante per prevenire la re-contaminazione.
Successivamente, sterilizzare per filtrazione l'etanolo al 85% e l'acqua ultrapura utilizzando filtri da 0,22 micron. Questi liquidi devono rimanere a quattro gradi Celsius o al di sotto, altrimenti potrebbero causare la rottura del campione, rendendolo più soggetto a contaminazioni. Conservare l'etanolo a meno 20 gradi Celsius.
Conservare l'acqua a quattro gradi Celsius. Quindi, sterilizzare un righello di plastica con etanolo al 70%, seguito dalla soluzione di decontaminazione del DNA e dalla soluzione di decontaminazione delle RNasi. Rimuovere immediatamente ogni soluzione subito dopo l'applicazione.
Quindi conservare il righello in un sacchetto Whirl-Pak sterile e privo di acidi nucleici. Successivamente, preparare lo spazio della stanza fredda pulendo prima le pareti, i pavimenti e un banco da lavoro in metallo con una soluzione di candeggina al 1%. Impostare quindi la temperatura della stanza a circa meno 11 gradi Celsius.
Dopo la preparazione, indossare tute leggere, guanti in nitrile e maschere quando si entra nella stanza fredda per ridurre al minimo il rischio di contaminazione dell'ambiente o dei campioni. Questa procedura richiede che due persone lavorino in sinergia. Ciò può risultare impegnativo, considerando le numerose possibilità di recontaminazione.
Per garantire il successo, ci controlliamo a vicenda, comunichiamo e cambiamo spesso i guanti. Una volta preparato tutto, portare i materiali sterilizzati e i campioni nella stanza fredda e disporli sul tavolo pulito con candeggina. Ciò include colture preparate di S. marcescens.
Prima di tutto, il campione di permafrost viene posizionato su un foglio di alluminio preparato. Successivamente, l'esterno del campione viene leggermente inoculato con una coltura diluita di S. marcescens utilizzando un tampone sterile in schiuma. Quindi, si pone il campione su un supporto metallico sterile posizionato sopra un vassoio.
Ora, la lama in acciaio del microtomo viene sterilizzata con etanolo al 70%, soluzione di decontaminazione del DNA e soluzione di decontaminazione della RNasi. Successivamente, il ricercatore A pulisce i propri guanti in nitrile nello stesso modo. Poi A tiene il campione a un angolo di 45 gradi sopra il vassoio.
B raschia delicatamente circa cinque millimetri dalla superficie esterna dell'intero campione, inclusi i bordi, utilizzando la lama sterile, mentre A ruota il campione dopo ogni raschiatura. Se necessario, la lama deve essere nuovamente pulita con le tre soluzioni. Successivamente, B versa rapidamente e con attenzione l'etanolo al 95% filtrato e sterilizzato sopra il campione mentre A lo ruota.
Successivamente, il campione viene rapidamente risciacquato con acqua. Il supporto metallico sopra il vassoio viene ora sostituito, e il campione viene posizionato sul nuovo supporto. L'operatore A si pulisce i guanti in nitrile e quindi posiziona il campione su un supporto pulito sopra il vassoio.
Nel frattempo, B nebulizza l'intero campione con una soluzione di decontaminazione del DNA, seguita da un risciacquo con acqua filtrata e sterilizzata. Successivamente, B nebulizza l'intero campione con una soluzione di decontaminazione della RNasi, seguita da un ulteriore risciacquo con l'acqua. Infine, il campione viene inserito in un sacchetto Whirl-Pak sterile.
Iniziare posizionando un supporto metallico sopra una capsula di vetro in una cappa a flusso laminare. Successivamente, posizionare il campione sul supporto metallico. Lasciare scongelare da due a cinque millimetri della superficie esterna del campione per circa 10 minuti.
In questo periodo, ruotare il campione di 90 gradi ogni due minuti. Al termine della scongelazione, afferrare della lana di vetro con pinzette e tamponare l'intera superficie del campione per raccogliere i batteri. Successivamente, inoculare le due piastre utilizzando la lana di vetro.
Successivamente, misurare le dimensioni esterne del campione utilizzando il righello, senza toccare il campione. Inoltre, inoculare due piastre aggiuntive con la coltura originale precedentemente utilizzata per inoculare l'esterno del campione, al fine di verificare che l'inoculo fosse vitale. Quindi, trasferire il campione in un grande sacchetto sterile e conservarlo a meno 80 gradi Celsius.
Incubare le piastre inoculate a 23 gradi Celsius per una settimana, quindi esaminarle alla ricerca di colonie di S. marcescens che diventano rosse a questa temperatura. Sebbene questo protocollo preveda una serie di passaggi critici, uno dei più importanti consiste nel verificare la crescita di Serratia marcescens. Se non sono presenti colonie visibili di S. marcescens, procedere con la successiva fase di scongelamento.
SE sono presenti colonie di S.marcescens, raschiare altri cinque millimetri dal campione centrale e ripetere la procedura. Verificare se S.marcescens è cresciuta dalla coltura originale esposta alle basse temperature della stanza frigorifera. I campioni sono stati raccolti da ghiaccio e permafrost in un tunnel di 110 metri situato a Fox, in Alaska.
Il tunnel ha fornito accesso a silt e alluvione ricchi di ghiaccio. I campioni sono stati raccolti in triplice replicato. Presso strutture nel New Hampshire, sono stati eseguiti i protocolli descritti.
Il gene dell'RNA 16S è stato sequenziato da batteri coltivati dai campioni. Le specie di Pseudomonas erano predominanti, ma erano presenti anche membri appartenenti ai Planctomycetia. In particolare, è risultata interessante l'assenza di specie di Serratia, che dimostra come il protocollo di decontaminazione abbia efficacemente rimosso il DNA esogeno.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come disinfettare con successo i campioni di ghiaccio e permafrost. Una volta acquisite le competenze necessarie, le operazioni di lavorazione in ambiente refrigerato possono essere completate in 30-45 minuti, se eseguite correttamente. Quando si tenta questa procedura, è fondamentale prestare attenzione a tutto ciò che si tocca e a tutti i punti in cui si entra in contatto.
In caso di dubbio, è sufficiente cambiare i guanti e procedere nuovamente alla sterilizzazione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il sequenziamento di ampliconi e la metagenomica shotgun per rispondere a ulteriori domande, ad esempio quale fosse la composizione delle specie in quel periodo di tempo o quali attributi funzionali predominassero in quelle condizioni ambientali.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per raccogliere e decontaminare nuclei di permafrost al fine di individuare organismi preservati risalenti a condizioni ambientali passate. La tecnica mira a eliminare materiale esogeno mantenendo l'integrità dei campioni.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Microbiologia
- Scienze ambientali
- Criobiologia
Sfondo
- La criosfera contiene organismi preservati che forniscono informazioni sugli ecosistemi storici.
- Il prelievo di campioni da ambienti ghiacciati comporta rischi di contaminazione.
- Comprendere la diversità microbica passata può fornire indicazioni per gli attuali studi ecologici.
- Tecniche di laboratorio controllate sono essenziali per un'analisi accurata.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per il prelievo di carote di permafrost.
- Rimuovere efficacemente i contaminanti in un ambiente di laboratorio.
- Identificare e analizzare i microorganismi provenienti dal ghiaccio glaciale e dal permafrost.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni asettici da permafrost e ghiaccio glaciale.
- Procedure di decontaminazione eseguite in un ambiente controllato.
- Dimostrazioni visive per facilitare l'apprendimento delle tecniche di raschiamento e decontaminazione.
- Analisi del DNA microbico per confermare l'assenza di contaminazioni.
Risultati principali
- Prelievo riuscito di carote di permafrost senza introdurre colonie esogene.
- I microorganismi rilevati sono probabilmente indigeni ai campioni.
- Efficacia dimostrata del protocollo di decontaminazione.
- Forniti spunti sulla diversità microbica storica.
Conclusioni
- Il protocollo consente lo studio di organismi conservati in modo privo di contaminazioni.
- Migliora la comprensione delle condizioni ambientali passate.
- Le ricerche future possono basarsi su questi risultati per esplorare l'evoluzione microbica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La decontaminazione dei campioni congelati è fondamentale per un'analisi accurata delle comunità biologiche antiche, garantendo che i microrganismi rilevati riflettano popolazioni indigene piuttosto che contaminazioni esogene. Questo protocollo supporta la validazione degli obiettivi in microbiologia ambientale, consentendo l'estrazione affidabile di segnali endogeni da campioni criopreservati. Il metodo aumenta la sicurezza predittiva nelle applicazioni successive, come il sequenziamento di ampliconi e la metagenomica, stabilendo una base priva di contaminazioni per la riduzione del rischio nei processi meccanicistici di ricostruzione degli ecosistemi storici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando segnali microbici indigeni da permafrost e carote di ghiaccio antichi.
- Valore operativo: Riduce il rischio di falsi positivi nell'identificazione degli obiettivi mediante rigorosa rimozione di DNA esogeno e colonie microbiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per analisi successive confermando l'assenza di crescita di contaminanti mediante piastratura di Serratia marcescens.
- Valore operativo: Standardizza la preparazione del campione attraverso punti di controllo quantificabili per la decontaminazione, migliorando la riproducibilità tra diversi lotti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la modellizzazione di sistemi rilevanti per le malattie fornendo accesso a consorzi microbici antichi per l'analisi degli attributi funzionali.
- Valore operativo: Garantisce una continuità traslazionale dalla scoperta al lavoro preclinico mantenendo l'integrità del campione attraverso una decontaminazione controllata.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta consentendo test affidabili di ipotesi sulla diversità microbica antica, supportando direttamente l'identificazione dei ceppi mediante approcci di sequenziamento indipendenti dalla coltura.
- Biologia della scoperta: Facilita la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici confermando l'origine endogena dei microrganismi rilevati attraverso l'assenza di colonie di Serratia aggiunte artificialmente.
- Screening: Permette la prontezza del saggio mediante passaggi standardizzati di decontaminazione che producono campioni privi di contaminazioni, adatti all'estrazione del DNA.
- Analisi: Genera misurazioni quantitative di variabili dipendenti, come il conteggio delle unità formanti colonie e i risultati del sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S, per confrontare le condizioni tra diversi campioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica fornendo sistemi rilevanti per lo studio dell'adattamento microbico in condizioni ambientali storiche associate a malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per l'elaborazione dei campioni, applicabile a diversi progetti su permafrost e carote di ghiaccio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione dell'obiettivo grazie alla confermata assenza di materiale esogeno.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante punti di controllo definiti per la decontaminazione e protocolli per camera fredda.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di proseguimento o interruzione degli investimenti in sequenziamento successivo riducendo il rumore biologico.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione corretta per rischio dei progetti su campioni antichi in base all'efficacia convalidata della decontaminazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della tecnica asettica e della biologia molecolare per prevenire la re-contaminazione durante le manipolazioni.
- È dipendente da strumentazioni quali camere fredde mantenute a -11°C, attrezzature prive di acidi nucleici e cappe a flusso laminare.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i passaggi di decontaminazione, inclusi risciacqui con etanolo, trattamenti con DNAse/RNase e procedure di cambio dei guanti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi tipi di campioni (ghiaccio rispetto a permafrost), mantenendo costante la rimozione dello strato esterno.
- Limitazione pratica: l'efficacia dipende da un'esecuzione rigorosa dei passaggi di raschiamento e decontaminazione chimica, al fine di evitare segnali esogeni residui.
