Stencil micropatterning di cellule staminali umane pluripotenti per Probing spaziale Organizzazione di differenziazione Fates

L'obiettivo generale di questo metodo di micropatterning basato su stencil, per cellule staminali pluripotenti umane, è quello di fornire un mezzo semplice e robusto per generare gradienti ambientali spaziali che controllano i modelli di differenziazione delle cellule staminali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella modellazione dei tessuti utilizzando un modello di cellule staminali umane, ad esempio come i gradienti spaziali nelle forze di adesione cellula-cellula e matrice cellulare possono aiutare a organizzare i destini di differenziazione delle cellule staminali. Il vantaggio di questo metodo è che non richiede ulteriori modifiche della superficie per generare modelli ECM adesivi per le cellule a cui attaccarsi.

Ciò significa che il metodo è compatibile con varie configurazioni di ECM e substrato, specifiche per ogni linea cellulare. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché le fasi di micropatterning sono difficili da imparare. Perché richiede una manipolazione precisa e attenta dello stencil e delle celle.

Per questa procedura, gli stencil PTMS devono essere già stati progettati e fabbricati. Allo stesso modo, avere cellule EFC umane che crescono sulla matrice della membrana basale, in modo tale che le colonie siano pronte per la semina più avanti nella procedura. Per iniziare, caricare un piatto con 700 microlitri di etanolo di grado analitico al 70%, in acqua ultrapura.

Quindi, posizionare lo stencil PDMS sulla soluzione e posizionare il piatto in un armadio di biosicurezza per asciugarlo durante la notte. Il giorno successivo, controlla che non si siano formate bolle sotto lo stencil. Quindi, metti in campo il piatto fino a quando le cellule possono essere seminate sullo stencil.

Preparare un'aliquota di matrice di membrana basale umana di qualità ESC aggiungendo 16,7 millilitri di DMF12, per ottenere una soluzione 1,5x e mantenerla in ghiaccio. Trattare il substrato con 100 watt di plasma di ossigeno per 90 secondi. Non aprire il piatto finché non è all'interno della camera del plasma e coprirlo rapidamente dopo il trattamento.

Questo trattamento impedirà la formazione di bolle quando il substrato è immerso nella soluzione. Ora, copri lo stencil con 450 microlitri di soluzione preparata a matrice di membrana basale 1,5x. Quindi, sigillare il piatto con parafilm e incubarlo per cinque ore.

Prima di procedere, controllare le piastre a sei pozzetti delle colonie HESC preparate. Identificare e aspirare colonie di cellule differenziate che hanno perso la loro tipica morfologia HESC. Dovrebbero apparire tutti arrotondati, avere una morfologia epiteliale strettamente compatta e avere un alto rapporto nucleo/citoplasma con nucleoli prominenti.

Quindi, lavare ogni pozzetto di celle piastrate con due millilitri di DMF12 due volte. Dopo il secondo lavaggio, aggiungere un millilitro di enzimi digestivi a ciascun pozzetto, come l'accutasi, e incubare la piastra per otto minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, picchiettare delicatamente la piastra per staccare tutte le colonie dal substrato.

Quindi, sciacquare ogni pozzetto con almeno quattro millilitri di terreno per ogni millilitro di enzima digestivo applicato al pozzetto e raccogliere le sospensioni cellulari in un singolo tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 200 g per tre minuti a temperatura ambiente per formare un pellet di cellule. Quindi aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 400 microlitri di terreno di mantenimento HESC, integrati con 10 micromolari di inibitore della roccia.

Triturare delicatamente le cellule tre volte per rompere i grumi. Successivamente, correggere la densità delle sospensioni. Mescolare bene e fare una diluizione 1:20 da 200 microlitri in media.

Contare le cellule nella diluizione utilizzando un emocitometro. Quindi, diluire la sospensione principale secondo necessità, utilizzando un terreno con un inibitore di roccia. Per procedere, aggiungere il numero richiesto di celle su ogni stencil preparato.

Dovrebbe essere depositato solo un monostrato di cellule, quindi distribuiscile uniformemente. Lascia riposare lo stencil indisturbato per cinque minuti, in modo che le cellule possano stabilizzarsi. Quindi, trasferisci con cura gli stencil caricati in un'incubatrice, mantenendo le piastre in piano per tutta la durata del trasferimento.

Lascia che le cellule si attacchino agli stencil per un'ora di incubazione. Dopo che le cellule sono state lasciate attaccare, esaminatele al microscopio per assicurarvi che lo abbiano fatto correttamente. Trasferisci lo stencil sul cofano e aspira le celle non attaccate dallo stencil.

Quindi, aggiungere due millilitri di tensioattivo non ionico compatibile allo 0,5% in DMF12 all'area circostante lo stencil. Agitare la soluzione per coprire lo stencil. Quindi, usa un paio di pinze autoclavate per staccare delicatamente lo stencil dal piatto.

Dopo aver rimosso lo stencil, ispezionare le cellule del micropastro al microscopio. Il tensioattivo non ionico impedisce a queste cellule di seccarsi. Lasciare incubare le cellule micropatterride nella soluzione di terreno integrata con tensioattivo per 10 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo 10 minuti, aspirare la soluzione e lavare la piastra con due millilitri di normale terreno DMF12, tre volte. Dopo i lavaggi, aggiungere due millilitri di terreno di mantenimento HESC con inibitore di roccia. Ancora una volta, ispeziona le cellule per verificare che i micropattern si siano formati correttamente.

Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, aspirare il terreno, lavare le cellule una volta con DMF12 e quindi aggiungere due millilitri di terreno di differenziazione integrato, per indurre le cellule a subire la differenziazione del mesoendoderma. Successivamente, analizza i risultati.

La fabbricazione dello stencil della cella utilizzando una taglierina laser, ha fornito caratteristiche di 1000 micron. Lo stencil era composto da un sottile foglio di stencil con fori passanti micromodellati e da una guarnizione PDMS utilizzata per contenere le celle. Utilizzando questo strumento, gli HESC micropatterenati sono stati studiati durante la differenziazione del mesoendoderma.

Le periferie delle colonie di H9-HESC hanno aderenze integriniche più elevate rispetto alle cellule all'interno della colonia. Pertanto, le cellule si differenziano in cellule del mesoendoderma T-positivo del brachiale, quando indotte con activan, BMP4 e FGF2. Quando tali cellule sono state modellate in monostrati di diverse geometrie, angoli retti geometrici e isotropi e a curvature convesse, hanno portato a una concentrazione locale di forze di trazione mediate da integrine e hanno portato ad un aumento della differenziazione del mesoendoderma.

L'intensità dell'espressione di T in diverse località all'interno di una singola colonia ha mostrato che l'estensione dell'induzione del mesoendoderma era effettivamente più alta negli angoli acuti delle colonie quadrate e rettangolari e alle curvature convesse di un arco semicircolare. Ciò dimostra che le forze meccaniche mediate dall'adesione cellulare possono essere modulate utilizzando il metodo descritto. Prima di tentare la procedura, è importante ottimizzare il tempo di rivestimento della matrice, il tempo di digestione cellulare e il tempo di attaccamento, per la specifica linea di cellule staminali pluripotenti umane con cui si sta lavorando.