Name: Genome Editing in Mexicanus Astianatte Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Scopri la mutagenesi genica mirata in Astyanax mexicanus usando i TALEN. Questo metodo consente di studiare la base genetica dei tratti cavernicoli e testare la funzione genica in vivo.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Dipartimento di Genetica, Sviluppo e Biologia Cellulare e Iowa State University e dal NIH concedere EY024941 (WJ) .dr. Jeffrey Essner fornito commenti sul manoscritto.

Tutte le procedure di animali erano in conformità con le linee guida del National Institutes of Health e sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali alla Iowa State University e l&#39;Università del Maryland. 1. TALEN design <ol><li> Ingresso desiderato sequenza bersaglio di un sito web di progettazione TALEN. (Per esempio: <a href="https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen">https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen</a> ). Ingresso scelto lunghezze degli array distanziale / ripetizione. <ol><li> Copiare la sequenza genomica nella casella &quot;Sequenza&quot;. </li><li> All&#39;interno della scheda &quot;Fornire personalizzato Spacer / RVD Lunghezze&quot; selezionare la lunghezza dello spaziatore e la lunghezza dell&#39;array. Nota: lunghezze Spacer di 15 paia di basi e ripetere le lunghezze degli array di 15-17 lavoro bene e fare il montaggio meno complessa. </li></ol></li><li> Selezionare una coppia TALEN. coppie Talen progettati intorno a un sito di enzima di restrizione unico permettono di genotipizzazione da enzima di restrizione digerireun prodotto di PCR. </li><li> Primer design per amplificare la regione genomica che circonda il sito di destinazione TALEN utilizzando un sito come Primer3 30-32. Quando la genotipizzazione con un enzima di restrizione, primer design per amplificare una regione che contiene il sito enzima di restrizione sola volta. Si raccomanda che questa regione è amplificato e sequenziato prima TALEN costruzione per identificare eventuali polimorfismi presenti in A. mexicanus popolazione laboratorio da utilizzare per microiniezione. </li></ol> 2. Montaggio TALEN (Modificata dal protocollo TALEN Kit) 33,34 Per ulteriori dettagli e la risoluzione dei problemi, consultare il protocollo 34. <ol><li> Preparare e la sequenza plasmidi necessari dal kit TALEN secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Impostare il # 1 Reazioni per reazioni A e B. Includere ripetere variabile diresidues (RVDS) 1-10 e la destinazione di pFUS_A vettore in reazione A. Includere RVDS 11- (N-1) e THe destinazione vettoriale pFUS_B (N-1) Reaction B dove N è il numero totale di RVDS in TALEN. <ol><li> Aggiungere a ciascuna reazione: 1 pl di ciascun plasmide contenente ciascuna RVD (100 ng / ml), il vettore di destinazione (100 ng / ml), 1 ml Bsa I restriction enzyme, 1 ml Bovine Serum Albumin (BSA) (2 mg / ml ), 1 ml ligasi, 2 microlitri di tampone 10x ligasi e x microlitri di acqua, per un volume totale di 20 microlitri. Ad esempio, vedi Tabella 1. Nota: reazioni metà può anche essere usato. </li><li> Posizionare reazioni in un termociclatore ed eseguire il ciclo: 10x (37 ° C / 5 min + 16 ° C / 10 min) + 50 ° C / 5 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Incubare le reazioni con nucleasi. Per ogni reazione aggiungere 1 ml di 25 mM ATP e 1 ml nucleasi. Incubare le reazioni a 37 ° C per 1 ora. </li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. Nota: Homemade c competenteells possono essere utilizzati. Tuttavia, le cellule con bassa competenza può risultare in mancanza di colonie. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per cinque minuti. Incubare le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Posizionare i tubi in ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 125 ml di brodo di Super ottimale con la repressione Cataboliti (SOC). Agitare le provette a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con spectinomicina (50 ug / ml), X-gal e isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 2-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer pCR8_F1 e pCR8_R1 (Tabella 2). <ol><li> Fare un master mix dei reagenti. Ad esempio, vedere la tabella 3. </li><li> Scegli una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con spectinomicina(50 mg / ml). Posizionare 15 microlitri della master mix nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il seguente programma PCR (Tabella 4) </li><li> Controllare la PCR (eseguire l&#39;intero volume) su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una banda alla dimensione prevista, nonché uno striscio e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con pCR8_F1 e pCR8_R1. Seguire i metodi descritti in precedenza 35. </li><li> Usando i cloni giusti verificati mediante sequenziamento, impostare la reazione # 2 (kit TALEN), che porrà le RVDS dei vettori A e B e la RVD finale nel vettore di destinazione. <ol><li> Preparare miscela per la reazione 2 (Tabella 5). Nota: Hareazioni lf possono essere utilizzati. </li><li> Mettere le reazioni in un termociclatore ed eseguire il seguente programma: 37 ° C / 10 min + 16 ° C / 15 min + 37 ° C / 15 min + 80 ° C / 5 min. </li></ol></li><li> Trasforma reazioni. <ol><li> Trasforma 2,5 ml di ogni reazione in 25 microlitri chimicamente cellule competenti. <ol><li> Mescolare 2,5 ml di reazione con 25 ml di cellule chimicamente competenti. Incubare in ghiaccio per 5 min. Heat Shock le cellule per 30 secondi a 42 ° C. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio. Aggiungere 125 ml di SOC. Porre i tubi in un incubatore agitazione a 37 ° C per 1 ora. </li></ol></li><li> Piatto 100 microlitri di cellule trasformate su piastre LB con ampicillina (100 ug / ml), X-gal e IPTG. Grow O / N a 37 ° C. </li></ol></li><li> Scegliere 1-3 colonie bianche per ogni reazione e verificare da colonia PCR usando primer TAL_F1 e TAL_R2 (Tabella 2). <ol><li> Fare una soluzione della polimerasi Mastermix, acqua e primer comedescritti nella Tabella 3. Scegliere una colonia e spalmare sul fondo di un tubo di PCR, e poi mettere i resti della colonia in 2 ml LB con ampicillina (100 ug / ml). Posizionare 15 microlitri della soluzione nella provetta con la colonia. </li><li> Eseguire il programma di PCR (Tabella 6). </li><li> Controllare la PCR su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I cloni giusti avranno una sbavature e una scala di bande. Per un esempio di striscio appropriato, vedere 34,33. </li><li> Grow 2 ml culture dei cloni corrette in LB supporto O / N a 37 ° C in un incubatore agitazione. </li></ol></li><li> Miniprep i plasmidi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Sequenza per verificare la sequenza TALEN con TAL_F1 e TAL_R2 seguendo i metodi descritti in precedenza 35. </li></ol> 3. mRNA Trascrizione di Talens <ol><li> Digest 4 mg di modello di sequenza-verificata con 2 ml Sac I per 2 ore a 37 ° C. </li&gt; <li> Eseguire 2 microlitri del plasmide Sac I digerito su un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. I plasmidi che sono correttamente digeriti mostreranno una singola banda. </li><li> Purificare il residuo plasmide Sac I digeriti seguendo il protocollo del kit di purificazione PCR. Lavare due volte con la soluzione di lavaggio prima di eluizione. Eluire in 30 ml di acqua priva di nucleasi. </li><li> Seguire il protocollo standard per la produzione di T3 mRNA. <ol><li> Impostare reazioni metà con 0,5 mg di modello linearizzato (preparato in precedenza). Incubare a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di DNasi (incluso nel kit) e incubare a 37 ° C per 15 min. </li></ol></li><li> Purificare l&#39;mRNA, seguendo le istruzioni del produttore. Eluire in 30 acqua priva di nucleasi microlitri. </li><li> Eseguire un gel 1,5% mediante elettroforesi per controllare l&#39;mRNA. <ol><li> Pulire l&#39;apparato gel con un prodotto per eliminare la contaminazione RNasi e preparare un gel 1,2%. </li><li> Mix 1 ml di mRNA + 4 &amp;# 181; l priva di nucleasi acqua + 5 ml colorante glyoxyl carico. Incubare i campioni a 50 ° C per 30 min. Centrifugare le provette brevemente e posto sul ghiaccio prima di eseguire il gel. </li></ol></li><li> Controllare la concentrazione utilizzando un metodo di quantificazione concentrazioni di acidi nucleici e conservare l&#39;RNA in aliquote a -80 ° C. Scegli una dimensione un&#39;aliquota tale che l&#39;RNA non sia congelato / scongelato più di una volta. Nota: Le concentrazioni di 500-1000 ng / nl sono in genere ottenuti. RNA con una concentrazione inferiore può essere utilizzato fintanto che l&#39;integrità dell&#39;RNA è mantenuto (come valutato da una banda piuttosto che una macchia sul gel). </li></ol> 4. Iniettare Astianatte mexicanus embrioni con TALEN mRNA <ol><li> Preparare strumenti per l&#39;iniezione. <ol><li> Versare in piastre di iniezione versando 1,2% agarosio in acqua i pesci (acqua condizionata con bicarbonato di sodio e sale marino a pH 7,4 e conducibilità 700 mS) in una capsula di Petri. Mettere uno stampo (pezzo di plastica con le proiezioni per fare pozzi per i pesciuova) all&#39;interno del piatto. Rimuovere lo stampo quando l&#39;agarosio si è indurito e conservare a 4 ° C. Per ulteriori informazioni sullo stampo vedere 36. </li><li> Tirare aghi per l&#39;iniezione con un estrattore ago secondo le istruzioni del produttore. Nota: adeguata lunghezza dell&#39;ago è importante per preparazioni iniettabili. Aghi che sono troppo lunghi saranno troppo flessibile per iniezioni. Il protocollo per gli aghi che tirano varierà con le attrezzature utilizzate per tirare gli aghi. Un esempio di un ago appropriato è mostrato in Figura 1. Per la nostra attrezzatura, abbiamo tirare aghi che sono 5-6 cm di lunghezza, ed hanno un diametro esterno sulla punta di circa 0,011 millimetri quando rotto. Tuttavia, gli aghi devono essere calibrati (fase 4.3.4) per determinare la larghezza di apertura. Un esempio di programma per tirare gli aghi possono essere trovate nella Tabella 7. </li><li> Preparare pipette di vetro per il trasferimento di embrioni rompendo la pipetta in modo che l&#39;apertura è grande abbastanza per un uovo di passare attraverso. Fiamma fine rotto finonon è più tagliente. Nota: E &#39;importante utilizzare pipette di vetro e ciotole di vetro quando si lavora con A. uova mexicanus ed embrioni in quanto sono appiccicosi e aderirà alla plastica. </li></ol></li><li> Raccogliere 1-cell fase Uova. <ol><li> Razza A. mexicanus seguendo protocolli standard 37. Nota: Per esempio, se i pesci sono mantenuti su un 14 luce: buio ciclo 10 ed usando tempo Zeitgerber (ZT) con ZT0 come luci accese e ZT14 come luci spente, il nostro uova di pesce di superficie tra ZT15 e ZT19. momento della riproduzione esatta deve essere determinata per ogni singolo laboratorio. </li><li> Indurre la deposizione delle uova da sovralimentazione pesce per 3-4 giorni prima dell&#39;accoppiamento e l&#39;immissione di pesci in acqua dolce. Sollevare il ° C di temperatura 2. Nota: La nostra temperatura dell&#39;acqua iniziale è di circa 74 ° C. </li><li> Raccogliere uova di pesce di superficie al buio, controllando ogni 15 minuti per ottenere le uova nella fase 1 delle cellule. Centinaia di uova possono essere ottenuti da una singola coppia di pesci di superficie. </li><li> Collezionareuova in ciotole di vetro per evitare che si attacchi alle superfici di plastica e sorta per isolare gli embrioni allo stadio di 1 cella di prima dell&#39;iniezione osservando le uova sotto il microscopio e raccogliere le uova che sono una singola cella. Conservare le uova in acqua dolce sistema (serbatoio di acqua in cui sono alloggiati i pesci adulti, che è stato trattato per pH e conducibilità). </li></ol></li><li> Iniettare TALEN mRNA. <ol><li> Iniettare diverse quantità di mRNA totale (quantità uguali di ciascun TALEN in coppia) per determinare la concentrazione ottimale per l&#39;iniezione la tossicità e l&#39;efficacia variano dagli accoppiamenti TALEN. Inizia iniettando concentrazioni di mRNA totale che sono 400-800 pg. Diluire e combinare mRNA a concentrazioni desiderate per l&#39;iniezione di 1,5 nl. </li><li> Carico diluito mRNA nella parte posteriore dell&#39;ago e collegare l&#39;ago a un micro-iniettore. </li><li> Rompere l&#39;ago con pinze. </li><li> Calibrare l&#39;ago. Ad esempio, espellere 10 volte e raccogliere il calo conseguente micro capillare. Per 10 x 100 usa e getta 1.081; l, 32 millimetri micro capillare, il calo dovrebbe riempire il micro capillare a 0,5 mm per 1,5 NL / 1 iniezione. Regolare il tempo di iniezione e la pressione necessaria. </li><li> Inserire l&#39;ago nella singola cella e iniettare l&#39;mRNA. Iniettare il mRNA direttamente nella cella, non nel tuorlo. </li><li> Raccogliere embrioni iniettati in ciotole di vetro. Mantenere gli embrioni a 23-25 ​​° C. Rimuovere gli embrioni morti (gli embrioni che diventano nuvoloso e di forma irregolare) regolarmente per i primi giorni dopo l&#39;iniezione. Un numero record di embrioni morti e deformi da controllo (uninjected) e le piastre iniettato. Nota: La maggiore concentrazione di mRNA può portare ad un aumento della tossicità e la deformità / la morte degli embrioni. Così, tossicità rispetto efficienza deve essere bilanciato per determinare la migliore concentrazione di mRNA per iniettare. </li></ol></li></ol> 5. fenotipo Fondatore Pesce e valutare l&#39;efficienza TALEN <ol><li> Sacrificare embrioni in base al protocollo animali istituzionale. Nota: eutanasiaembrioni rapidamente raffreddato su ghiaccio. </li><li> Raccogliere gli embrioni in 0,8 microlitri tubi striscia PCR utilizzando una pipetta di trasferimento. Nota: La genotipizzazione può essere eseguita su singoli embrioni o gli aggregati di embrioni. </li><li> Estrarre il DNA. <ol><li> Inserire embrioni in 100 ml di idrossido di 50 mM di sodio (NaOH) e incubare a 95 ° C per 30 minuti, poi raffreddare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 1/10 del volume (10 ml) di 1 M Tris-HCl pH 8. </li></ol></li><li> Eseguire una PCR sulla regione utilizzando i primer disegnati in fase 1.3 (vedi tabelle 8 e 9 per i protocolli di esempio). Per i singoli embrioni 1 ml di DNA è sufficiente per la reazione PCR. </li><li> Digerire il prodotto di PCR risultante con l&#39;enzima di restrizione appropriato ed eseguire un gel di agarosio 1,5% per elettroforesi. <ol><li> Ad esempio, per la genotipizzazione del locus oculocutaneous albinism 2 (OCA2) in embrioni iniettati digerire il prodotto di PCR utilizzando l&#39;enzima di restrizione Bsr I aggiungendo 0.5 Ml di Bsr io direttamente a 12,5 ml di reazione PCR completato, incubazione a 65 ° C per 2 ore. Eseguire il digerito e il prodotto digerito su un gel. Bande resistenti enzima di restrizione (cioè, gruppi che non digeriscono) indicano che le mutazioni TALEN-indotte sono presenti (Figura 2). </li></ol></li><li> (Opzionale) Calcolare tasso di mutazione percentuale determinando la percentuale del prodotto non tagliato analizzando le immagini di gel in Fiji 38 utilizzando lo strumento di analisi di gel per calcolare il valore di intensità di ogni banda come descritto in precedenza 29. </li><li> Determinare la sequenza di alleli mutanti da TA clonazione della banda mutante resistente gel purificato l&#39;enzima di restrizione e sequenziamento cloni. <ol><li> Gel purificare l&#39;enzima di restrizione banda mutante resistente seguendo le istruzioni del produttore. TA clonare la band seguendo le istruzioni del produttore. Scegli colonie e crescere in 1,5 ml LB O / N a 37 ° C in agitazioneincubatrice. </li><li> culture Miniprep seguito le istruzioni del produttore. Invia il DNA per il sequenziamento. </li><li> Utilizzando un programma come scimmia, allineare le sequenze mutanti alla sequenza di tipo selvatico. <ol><li> Copia e incolla entrambe le sequenze in file APE. Scegliere lo strumento &quot;allineare due sequenze&quot; dal menu &quot;Strumenti&quot;. </li><li> Specificare le due sequenze di DNA utilizzando i menu a discesa. Nota: Il complemento inverso della sequenza clonata può essere necessario utilizzare a seconda della direzione della PCR è andato nel vettore di clonazione. Se le sequenze non si allineano, ripetere i passaggi selezionando la casella &quot;Rev-Com&quot; nella casella &quot;Allinea DNA&quot;. </li></ol></li></ol></li><li> Valutare pesce fondatore di fenotipi in fase appropriata e con metodi adeguati per il fenotipo atteso 29 (Ad esempio, la Figura 3). Metodi di fenotipizzazione saranno basate sul fenotipo atteso per il gene bersaglio dal ricercatore utilizzando il ProtoColo. </li></ol> 6. schermo per la trasmissione germinale Nota: A. mexicanus raggiungere la maturità sessuale a 4-8 mesi. <ol><li> Attraversate pesce fondatore sessualmente maturi per i pesci wild type. </li><li> Embrioni schermo o pesci adulti con metodi a passi 5.1-5.7 (figura 4). Per i pesci adulti, un pezzo della coda può essere agganciato dopo anestesia. <ol><li> Anestetizzare pesce sommergendo pesci in una soluzione di tricaine (acido 3-aminobenzoico etil estere) per ridurre lo stress durante amputazione delle pinne. In seguito fin ritaglio, permettono di recuperare il pesce in acqua dolce. Pesce recuperare rapidamente; osservare fino a che non hanno recuperato (sono il nuoto normalmente). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Grandi passi avanti sono stati compiuti negli ultimi anni verso la comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione dei tratti. Mentre sono stati identificati geni candidati sottostanti l&#39;evoluzione di un certo numero di tratti, è rimasta impegnativo per testare questi geni in vivo a causa della mancanza di trattabilità genetica di specie più interessanti evolutivamente. Qui riportiamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus, una specie utilizzate per studiare l&#39;evoluzione deg...

La comprensione delle basi genetiche dell&#39;evoluzione tratto è un obiettivo di ricerca critica di biologi evoluzionisti. Notevoli progressi sono stati fatti per identificare loci sottostanti l&#39;evoluzione dei tratti e individuare geni candidati all&#39;interno di questi loci (ad esempio 1-3). Tuttavia, funzionalmente testare il ruolo di questi geni è rimasta sfidando come molti organismi utilizzati per studiare l&#39;evoluzione dei tratti non sono attualmente geneticamente trattabili. L&#39;avvento delle tecnologie di editing genoma è notevolmente aumentato manipolabilità genetica di una vasta gamma di organismi. Trascrizione nucleasi attivatore simile effettrici (Talens) e cluster regolarmente intervallati brevi ripetizioni palindromi (CRISPRs) sono stati utilizzati per generare mutazioni nei geni mirati in una serie di organismi (ad esempio 4-11). Questi strumenti, applicati ad un sistema evolutivamente rilevanti, hanno il potenziale per rivoluzionare il modo in cui i biologi evoluzionisti studiare le basi genetiche dell&#39;evoluzione. Astianatte mexicanus è una specie di pesci che esiste in due forme:. Un fiume-dimora forma di superficie (pesce di superficie) e molteplici forme cavernicoli (cavefish) A. mexicanus cavefish si è evoluta da antenati dei pesci di superficie (recensito in 12). Le popolazioni di cavefish hanno sviluppato un certo numero di caratteristiche tra cui la perdita degli occhi, diminuzione o perdita della pigmentazione, aumento del numero di papille gustative e neuromasti cranici, e cambiamenti nel comportamento come la perdita di comportamento scolastico, maggiore aggressività, cambiamenti di alimentazione postura e iperfagia 13 -19. Cavefish e pesce di superficie sono interfertili, e gli esperimenti di mappatura genetica sono stati effettuati per identificare loci e geni candidati per i tratti rupestri 1,20-26. Alcuni geni candidati sono stati testati per un ruolo funzionale nel contribuire a tratti rupestri in coltura cellulare 1,19, in organismi modello di altre specie di 21 o da 27 o sovraespressione atterramento transitoria ucantare morpholinos 28 in A. mexicanus. Tuttavia, ciascuno di questi metodi ha limitazioni. La capacità di generare alleli mutanti di questi geni in A. mexicanus è fondamentale per comprendere la loro funzione nell&#39;evoluzione del cavefish. Così, A. mexicanus è un organismo candidato ideale per l&#39;applicazione di tecnologie di modifica del genoma. Qui descriviamo un metodo per la modifica del genoma in A. mexicanus utilizzando Talens. Questo metodo può essere utilizzato per valutare mosaico iniettato pesce fondatore per fenotipi e per isolare le linee di pesce con mutazioni nei geni stabili di interesse 29.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stazione</td><td></td><td></td><td></td>di iniezione</tr><tr><td>Apparecchio</td><td></td><td></td><td></td>gel</tr><tr><td>Estrattore</td><td></td><td></td><td></td>di aghi</tr><tr><td>Nanodrop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td> Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nota: Per quanto ne sappiamo, i materiali di consumo di diverse aziende possono essere utilizzati se non diversamente indicato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit 2.0</td><td>Addgene</td><td>Kit #1000000024</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents LB Agar, Miller (granulato)</td><td>Fisher</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents Terreni microbiologici: LB Broth, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>Teknova TET-15 in 50% EtOH</td><td>Teknova (ordinato tramite Fisher)</td><td>50-843-314</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina dicloridrato, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP2957-1</td><td></td></tr><tr><td>Super Ampicillina (1.000x Soluzione</td> <td>DNA Technologies</td><td>6060-1</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific X-Gal, pronta all'uso</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (ordinata tramite Fisher)</td><td>FERR0941</td><td></td></tr><tr><td>IPTG, Fisher BioReagents</td><td>Fisher</td><td>BP1620-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher</td><td>08-757-13</td><td></td></tr><tr><td>BsaI</td><td>New England Biolabs (ordinata tramite Fisher)</td><td>50-812-203</td><td>Utilizzare BsaI, non BsaI-HF (come descritto nel protocollo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>New England Biolabs</td><td>ha fornito enzimi</td><td></td>di restrizione</tr><tr><td>10x tampone ligasi T4</td><td>Promega (ordinato tramite Fisher)</td><td>PR-C1263</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Master mix</td><td>Promega (ordinato tramite Fisher)</td><td>PRM7123</td><td>È possibile utilizzare altri Taq, ma la reazione deve essere regolata di conseguenza</td></tr><tr><td>Kit di legatura rapida</td><td>New England Biolabs (ordinato tramite Fisher)</td><td>50-811-728</td><td>Utilizziamo la ligasi rapida per tutte le reazioni di assemblaggio TALEN</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 E.coli chimicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C4040-06</td><td>È possibile utilizzare altre cellule chimicamente competenti o cellule competenti fatte in casa</td></tr><tr><td>Esp 3I</td><td>Thermo Sci Fermentas Inc (ordinato tramite Fisher)</td><td>FERER0451</td><td></td></tr><tr><td>Epicentro della DNasi ATP-dipendente sicuro per il plasmide</td><td>(ordinato tramite Fisher)</td><td>NC9046399</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>Il kit Qiagen deve essere utilizzato per la preparazione iniziale del plasmide (come descritto nel protocollo Golden Gate TALEN e TAL Effector Kit)</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate LE Quick Dissolve Agaraose</td><td>BioExpress</td><td>E-3119-125</td><td></td></tr><tr><td>Sac I</td><td>Promega (ordinato tramite Fisher)</td><td>PR-R6061</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T3 Kit di trascrizione</td><td>Ambion</td><td>AM1348M</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax-Gly Sample Loading Dye&nbsp;</td><td>Ambion (ordinato tramite Fisher)</td><td>AM8551</td><td></td></tr><tr><td>Eliminase</td><td>Decon (ordinato tramite Fisher)</td><td>04-355-32</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pipette monouso in vetro soda-calcico Pasteur Fisher</td><td></td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro standard</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcaps</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Microloader Tips per Femtojet Microinjector</td><td>Eppendorf (ordinato tramite Fisher)</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td></td></tr></tbody></table>

genome editing in<em&gt; mexicanus astianatte</em&gt; uso trascrizione activator simile effector nucleasi (talens)

Genome Editing in Astyanax mexicanus Using Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs)

Identificare gli alleli dei geni alla base del cambiamento evolutivo è essenziale per capire come e perché avviene l'evoluzione. A tal fine, molto lavoro recente si è concentrato sull'identificazione di geni candidati per l'evoluzione dei caratteri in una varietà di specie. Tuttavia, fino a poco tempo fa è stato difficile convalidare funzionalmente geni candidati interessanti. Strumenti recentemente sviluppati per l'ingegneria genetica consentono di manipolare geni specifici in un'ampia gamma di organismi. L'applicazione di questa tecnologia in organismi evolutivamente rilevanti consentirà una comprensione senza precedenti del ruolo dei geni candidati nell'evoluzione. L'Astyanax mexicanus (A. mexicanus) è una specie di pesce con forme sia superficiali che cavernicole. Molteplici linee indipendenti di forme cavernicole si sono evolute da pesci di superficie ancestrali, che sono interfertili tra loro e con i pesci di superficie, consentendo di chiarire le basi genetiche dei tratti delle grotte. A. mexicanus è stato utilizzato per una serie di studi evolutivi, tra cui l'analisi di linkage per identificare i geni candidati responsabili di una serie di tratti. Pertanto, A. mexicanus è un sistema ideale per l'applicazione dell'editing genomico per testare il ruolo dei geni candidati. Qui riportiamo un metodo per utilizzare nucleasi effettrici simili ad attivatori di trascrizione (TALEN) per mutare geni in A. mexicanus di superficie. L'editing del genoma con TALEN in A. mexicanus è stato utilizzato per generare mutazioni nei geni della pigmentazione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per valutare il ruolo dei geni candidati per una serie di altri tratti che si sono evoluti nelle forme di grotta di A. mexicanus.

Talen coppia iniezioni provocano vincolante delle RVDS a specifici nucleotidi del DNA e quindi dimerizzazione di domini FokI, con conseguente rotture a doppia elica 39, che possono essere riparati attraverso non omologhe fine di entrare (NHEJ). NHEJ spesso introduce errori che si traducono in inserzioni o delezioni (indels). Indels possono essere identificati amplificando la regione circostante il sito di destinazione TALEN e digerire l&#39;amplicone risultante con un...

Gene-targeting mutagenesi è ora possibile in una vasta gamma di organismi che utilizzano tecniche di editing genoma. Qui, dimostriamo un protocollo per la mutagenesi genica mirata utilizzando trascrizione attivatore come nucleasi effettrici (Talens) in Astianatte mexicanus, una specie di pesci che comprende pesce di superficie e cavefish.

Genome Editing in<em&gt; Mexicanus Astianatte</em&gt; Uso Trascrizione Activator simile Effector nucleasi (Talens)

Identifying alleles of genes underlying evolutionary change is essential to understanding how and why evolution occurs.  Towards this end, much recent ...

L'obiettivo generale di questa procedura è introdurre mutazioni in geni specifici del pesce delle grotte Astyanax mexicanus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia evolutiva riguardo alla base genetica dell'evoluzione di tratti cavernicoli. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'effetto della perdita del gene specifico può ora essere testato in Astyanax mexicanus.Dopo aver progettato e assemblato nucleasi effettore simili all'attivatore della trascrizione, o TALEN, secondo il protocollo descritto, utilizzare due microlitri di Sac1 per digerire quattro microgrammi di template con sequenza verificata a 37 gradi Celsius per due ore. Eseguire due microlitri del plasmide digerito con Sac1 su un gel di agarosio all'1,5% e verificare la presenza di una singola banda per confermare la digestione. Per effettuare la produzione di mRNA T3, utilizzare 0,5 microgrammi di template linearizzato per impostare reazioni dimezzate seguendo un protocollo standard.Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi aggiungere zero virgola quattro microlitri di DNasi e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo la purificazione dell'mRNA, per v

genome-editing-astyanax-mexicanus-using-transcription-activator-like

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Questo video dimostra una tecnica di editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco in cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Poiché le hPSC possono potenzialmente essere differenziate in vari tipi di cellule, questa tecnologia è utile per studi patologici e farmacologici in vitro in modo paziente-specifico.

Editing del genoma basato sulla nucleasi a dita di zinco: una tecnica per modificare il genoma nelle cellule staminali pluripotenti umane mediante meccanismo di riparazione dipendente dall'omologia a doppio filamento

Nucleasi di stilisti come nucleasi dito di zinco (ZFNs) e attivatore di trascrizione come nucleases effettrici (Talens) possono essere utilizzati per modificare il genoma di embrioni preimpianto di topo attivando sia la fine nonhomologous giunzione (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR) percorsi. Questi progressi consentono la rapida generazione di mouse con precise modificazioni genetiche.

Genoma Ingegneria mouse usando Nucleases Designer

Manipolazioni transgeniche e la modifica del genoma sono fondamentali per il collaudo funzionale i ruoli dei geni ed elementi -regulatory cis. Ecco una dettagliata protocollo microiniezione per la generazione di modifiche genomiche (compresi costrutti Tol2-mediate fluorescenti giornalista transgene, Talens, e CRISPRs) è presentato per il pesce modello emergente, il Spinarello.

Microiniezione per Transgenesi e Genome Editing in Threespine spinarelli

Utilizzando un Cas9 preassemblati complesso ribonucleoproteico (RNP) è un metodo potente per l'editing genomico precisa, efficiente. Qui, si evidenzia sua utilità in una vasta gamma delle cellule e degli organismi, tra cui cellule umane primarie e classico ed emergenti organismi modello.

Enhanced Genome Editing con Cas9 ribonucleoproteina nelle Diverse cellule e degli organismi

Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.

Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano

Presentato qui è un protocollo per eseguire il knock-out genico limitato nel tempo e nello spazio nei midollo spinale axolotl iniettando il complesso CAS9-gRNA nel canale centrale del midollo spinale seguito dall'elettroporazione.

Knock-out gene diretto delle cellule staminali neurali del midollo spinale ad axolotl tramite elettroporazione dei complessi CAS9 Protein-gRNA

L'obiettivo di questo protocollo è quello di consentire l'editing CRISPR/Cas9 senza soluzione di continuità del genoma di C. elegans utilizzando complessi di ribonucleoproteine assemblati e il marcatore co-CRISPR dpy-10 per lo screening. Questo protocollo può essere utilizzato per apportare una varietà di modificazioni genetiche in C. elegans tra cui inserzioni, delezioni, sostituzioni geniche e sostituzioni codone.

CRISPR/Cas9 Editing del gene C. elegans rbm-3.2 utilizzando il marcatore di screening dpy-10 Co-CRISPR e complessi di ribonucleoproteine assemblati.

Questo protocollo descrive come eseguire un efficiente editing della base adenina senza limitazioni PAM per costruire un modello preciso di malattia del pesce zebra utilizzando zSpRY-ABE8e.

Editing di base efficiente senza PAM per la modellazione del pesce zebra di malattie genetiche umane con zSpRY-ABE8e

L'efficienza del metodo I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) è paragonabile alla microiniezione tradizionale, che richiede la raccolta di zigoti da femmine donatrici e il trasferimento a femmine pseudo-gravide. Questo protocollo dimostra la sua efficacia introducendo mutazioni indotte da CRISPR/Cas9 nel locus ROSA26 sul cromosoma 6.

Miglioramento dell'editing del genoma tramite la somministrazione di acidi nucleici oviduttali Tecnica di elettroporazione in vivo basata sulla somministrazione per la generazione di topi knockout

La somministrazione degli editori genomici come RNA è un mezzo particolarmente potente per modificare i genomi delle cellule e delle linee cellulari primarie dei mammiferi. L'obiettivo di questo protocollo è fornire editori genomici come mRNA nelle cellule e linee cellulari primarie dei mammiferi, seguiti da sequenziamento e analisi mirati di Illumina per quantificare gli esiti di editing.

Editing genomico nelle cellule primarie di mammiferi tramite elettroporazione dell'RNA editor

Scopri la mutagenesi genica mirata in Astyanax mexicanus usando i TALEN. Questo metodo consente di studiare la base genetica dei tratti cavernicoli e testare la funzione genica in vivo.

Genome Editing in

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