Fenotipica e analisi funzionale di cellule T regolatorie attivati ​​Isolato dal linfocitica cronica coriomeningite topi infettati da virus

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la funzione soppressiva in vitro delle cellule T regolatorie, isolate da topi con infezione cronica da virus. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande sul fenotipo e sulla funzione soppressiva in vitro delle cellule T regolatorie attivate durante un'infezione virale cronica. Questa tecnica può valutare l'effetto diretto delle cellule T regolatorie sull'individuo con una risposta positiva alle cellule T in vitro.

Questo è un grande vantaggio di questa tecnica. Inizia trasferendo da cinque volte dieci al quinto linfociti splenici totali in 50 microlitri di tampone facs in ciascun pozzetto di una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U, seguito da 150 microlitri di tampone facs. Centrifugare la piastra ed eliminare il surnatante.

Quindi agitare i pellet cellulari e lavare le cellule altre due volte in 200 microlitri di tampone facs per pozzetto. Dopo il secondo lavaggio, risospendere i pellet in 50 microlitri di cocktail di anticorpi per pozzetto, per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Quindi lavare le cellule due volte nel tampone facs e decantare il surnatante.

Successivamente, fissare le cellule per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius con 100 microlitri di tampone di fissazione, seguiti da due lavaggi con tampone di lavaggio di permeabilizzazione. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule in 50 microlitri di anticorpo anti-FOXP3. Per preparare le perle rivestite anti CD3 CD28, trasferire il volume appropriato di perle magnetiche in un tubo da 15 millilitri e aggiungere un volume uguale di PPS.

Miscelare delicatamente la soluzione mediante pipettaggio e centrifugare le microsfere magnetiche. Al termine del lavaggio, scartare il surnatante e diluire le perle in 50 microlitri di terreno completo per pozzetto. Successivamente, seminare 50 microlitri di una volta dieci al quinto CD4 positivo CD25 cellule T regolatorie positive per pozzetto in una piastra inferiore a 96 pozzetti, seguito da 50 microlitri di una volta dieci al quinto CD8 positivo cellule T responder per pozzetto.

Quando tutte le cellule sono state piastrate, aggiungere 50 microlitri di perle rivestite anti CD3 CD28 diluite a ciascun pozzetto e aggiungere fino a 50 microlitri di terreno per portare il volume totale di ciascun pozzetto fino a 200 microlitri. Quindi coprire il piatto con un foglio di alluminio e metterlo a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica per 72 ore. Per analizzare la produzione di citochine delle cellule T CD8 positive, dopo tre giorni di coltura, trasferire i surnatanti in un'altra piastra da 96 pozzetti e analizzare i surnatanti mediante ELISA, secondo le istruzioni del produttore.

Per analizzare la proliferazione delle cellule T CD8 positive, lavare tre volte la piastra di cellule con tampone facs. Quindi risospendere le pastiglie in 50 microlitri di un cocktail di anticorpi appropriato contro le cellule T CD8 positive proliferate per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte nel tampone facs e fissarle per 20 minuti al buio a quattro gradi Celsius con 100 microlitri di tampone di fissaggio.

Infine, lavare le celle altre due volte nel tampone facs e risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone facs. Quindi misurare la percentuale di proliferazione delle cellule T CD8 positive marcate con filato mediante citometria a flusso. Nei linfociti splenici ottenuti da topi naïve e infetti, PD-1 è specificamente upregolato sia nelle cellule convenzionali FOXP3 negative CD4 positive che nelle cellule FOXP3 negative CD8 positive di topi infetti da LCMV clone 13.

La frequenza di cellule T regolatorie CD4 positive per FOXP3 è due volte superiore nei topi infetti con clone LCMV 13 rispetto ai topi naïve, con la maggior parte delle cellule CD4 positive per FOXP3 positive che mostrano anche un fenotipo PD-1 attivato elevato. Le cellule T CD8 positive responder possono essere separate con successo senza una contaminazione significativa da parte di altre cellule immunitarie. Dopo l'isolamento delle cellule T regolatorie, è possibile ottenere una popolazione dominante di cellule T CD25 positive CD4 positive con una purezza superiore all'80%.

La stimolazione di cellule T regolatorie e responder isolate da parte di perle rivestite anti CD3 CD28 provoca l'inibizione delle cellule T responder CD8 positive in modo dose-dipendente. Infatti, quando le cellule T CD8 positive responder sono co-coltivate con cellule T regolatorie croniche in un rapporto di uno a uno, la proliferazione delle cellule T CD8 positive responder è significativamente inibita. La produzione di interferone gamma da parte delle cellule CD8 positive responder è anche significativamente inibita quando le cellule T CD8 positive responder sono co-coltivate con cellule T regolatorie attivate da topi cronicamente infetti, rispetto alla co-coltura con cellule T regolatorie a riposo da topi naïve.

Abbiamo scoperto che questa tecnica può essere completata in 80 ore se viene eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare le cellule T regolatorie appena isolate subito dopo il loro isolamento. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della medicina per esplorare la funzione delle cellule T regolatorie in una malattia infiammatoria cronica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare una procedura di soppressione delle cellule T regolatorie in vitro, utilizzando un sistema di co-coltura di cellule T regolatorie e responder.