Name: Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine Ultrasensitive da sangue intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Scopri un metodo automatizzato per il rilevamento di proteine a sensibilità femtomolare in 10 µL di sangue intero in soli 30 minuti. Utilizza nanofibre di biossido di titanio integrate in una piattaforma lab-on-a-disc per migliorare il rapporto segnale-rumore.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la Ricerca Nazionale di Corea (NRF) sovvenzioni (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una sovvenzione da parte della Corea Salute Technology R &amp; S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (A121994) e IBS-R020-D1 finanziata dal governo coreano.

NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani ed è stato raccolto in un tubo di raccolta del sangue. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari. 1. Realizzazione di TiO2 NF Mat <ol><li> Preparazione della soluzione di precursore 22 <ol><li> Sciogliere 1.5 g di titanio tetraisopropoxide (TTIP) in una miscela di etanolo (99,9%, 3 ml) e acido acetico glaciale (3 ml) e miscelare la soluzione a temperatura ambiente (25 ° C) per 30 minuti su un agitatore magnetico. </li><li> Sciogliere 11% in peso di polivinil pirrolidone (PVP) in 3,64 g di etanolo (99,9%) e agitare la soluzione a 65 ° C per 1 ora con un agitatore magnetico a piastra calda. </li><li> Combinare e mescolare le due soluzioni a 65 ° C per 4 ore su un agitatore magnetico a piastra calda. </li></ol></li><li> electrospinning <ol><li> Caricare la soluzione preparata in una siringa collegata ad un ago di acciaio inox da 200 micron diame internoter. Versare la soluzione direttamente nella siringa dopo aver rimosso lo stantuffo. </li><li> Introdurre la soluzione costantemente ad una velocità di flusso di 0,3 ml / h per 10 min su un Si fetta (2 cm x 2 cm) posto su un substrato a massa ad una tensione continua elevata (15 kV). Durante l&#39;elettrofilatura, impostare la distanza tra l&#39;ago e il substrato a massa a 10 cm. </li></ol></li><li> Calcinazione del tappeto NF <ol><li> Posizionare il tappetino NF in un forno e aumentare la temperatura fino a 500 ° C con una velocità di rampa di 3 ° C / min in condizioni di alto vuoto (5 x 10 -5 torr). </li><li> Mantenere la temperatura a 500 ° C per 3 ore. Raffreddare la temperatura dei campioni alla RT (25 ° C) nel forno. </li></ol></li></ol> 2. Integrazione del TiO2 NF Mat in un Microfluidic disco centrifugo <ol><li> Realizzazione di un disco <ol><li> Utilizzare il software di progettazione 3D (ad esempio, SolIDWorks o simile) per raffigurano camere, canali o valvole di ogni strato di disco. Convertire i file di progettazione di codice a controllo numerico computerizzato (CNC) utilizzando il codice che genera il software (ad esempio, Edgecam o simili). Utilizzare i software in base al manuale di istruzioni 23,24. Nota: Le dimensioni del canale tipici usati in questo dispositivo sono 1,0 millimetri x 0.3 mm (larghezza x profondità). </li><li> Aprire il software di funzionamento della fresatrice CNC (ad es., DeskCNC o simili) e caricare il codice CNC al software operativo e selezionare la seguente nell&#39;ordine: &quot;AUTO&quot; -&gt; &quot;G codice aperto&quot; -&gt; Selezionare il codice CNC generato. </li><li> Fissare la piastra PC sulla fresatrice CNC: utilizzare 1 piastre mm PC per lo strato superiore e piastre PC 5 mm per lo strato del disco. Eseguire la fresatrice CNC per tagliare ogni strato del disco facendo clic sul pulsante &quot;Start&quot;. </li></ol></li><li> Trasferimento di TiO2 NF tappetino sul disco<ol><li> Inserire un substrato di silicio e una piccola capsula di Petri contenenti 40 ml di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano in una camera a vuoto sotto vuoto per 30 min. Il fluorosilane vaporizza e viene rivestita sul substrato. </li><li> Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero con un agente indurente in un rapporto di 10: 1 e degasare in una camera a vuoto. Spin-coat PDMS su un substrato di silicio a 650 rpm per 60 sec. </li><li> Curare il PDMS stesi su substrato di silicio in stufa a 65 ° C per 10 minuti per ottenere uno stato aderente. NOTA: Tempo di polimerizzazione può essere variata a seconda delle condizioni ambientali, e la forza di adesione può essere una prova di virata utilizzando un reometro. </li><li> Trasferire il tappetino TiO2 NF preparato da electrospinning e calcinazione sul silicio PDMS-rivestite utilizzando una pinzetta. Quindi, applicare manualmente una pressione conforme sul TiO2 NF tappeto trasferito con un oggetto piatto (ad es., Vetrino) e rimuovere l&#39;oggetto. Metterequesto campione in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente lo strato PDMS. </li><li> Coat camere di reazione vincolanti il disco con 20 microlitri del / indurimento miscela agente PDMS (10: 1), che agisce come uno strato adesivo per fissare TiO 2 NF stuoia sul disco. </li><li> Versare 50 ml di etanolo (99,9%) del TiO 2 NF mat sullo strato PDMS, tagliare il tappetino NF con una foratura di diametro di 6 mm, e trasferire il taglio TiO 2 NF tappetino per camere di reazione di legame rivestite con 20 microlitri dei PDMS nel passaggio precedente. NOTA: In questo passaggio, etanolo sarà utile per scollegare il NF stuoia taglio TiO 2 dal substrato di Si. </li><li> Incubare la NF stuoia disco integrato TiO 2 in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente il PDMS. </li></ol></li><li> Modifica della superficie del TiO 2 NF mat sul disco <ol><li> Prepare 1% v / v soluzione di (3-glicidossipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) in etanolo (99,9%). </li><li> Trattare il disco integrato TiO2 NF tappeto con plasma di ossigeno a 140 W, il flusso di ossigeno 50 sccm per 180 sec. Dispensare 100 ml di soluzione di GPDES su ogni tappeto nanofibre e incubare a RT (25 ° C) per 2 ore. </li><li> Lavare il substrati brevemente dispensando etanolo (99,9%) con una bottiglia di lavaggio, quindi rimuovere l&#39;etanolo completamente invertendo il disco e assorbente contro un panno pulito. Polimerizzare a 80 ° C per 1 ora. Lavare due volte con etanolo (99,9%) nello stesso modo come sopra, per rimuovere le fisicamente adsorbite e non legati molecole GPDES. </li><li> Asciugare con un flusso di azoto, a secco sotto vuoto. NOTA: Il disco può essere conservato in un contenitore sigillato a RT (25 ° C) fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Immobilizzazione di anticorpi sulla superficie <ol><li> Fare una soluzione di 200 mg / ml di anticorpi di cattura (monoclonale anti topohsCRP umana o monoclonale di topo anti-cTnI) diluendo gli anticorpi con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Dispensare 5 ml di soluzione su ogni tappeto NF in un disco utilizzando una micropipetta. Vedi l&#39;elenco dei materiali per ulteriori informazioni sui anticorpi. </li><li> Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 4 ore. Lavare gli anticorpi rivestiti NF tappeto con lo 0,1% tampone BSA-PBS. Riempire la camera con 100 ml di tampone di lavaggio utilizzando una micropipetta, rimuovere il buffer aspirando o decantazione. Infine, capovolgere il disco e asciugare contro un panno pulito, e poi montare il disco. </li></ol></li><li> gruppo disco <ol><li> Disegnare il disegno del disco su nastro biadesivo utilizzando un programma CAD (ad esempio, AutoCAD o simili). Caricare il disegno CAD al plotter da taglio. </li><li> Tagliare il nastro biadesivo con il plotter da taglio. Stacchi un strato di protezione di doppio nastro adesivo e fissare it sulla parte superiore dello strato disco. Staccare l&#39;altro strato di protezione e fissare lo strato superiore sullo strato disco. </li><li> Caricare il disco preliminarmente riuniti nella pressa e allineare con precisione i livelli superiore / adesivi / disco utilizzando segni di allineamento in ogni strato per collegare ciascuna valvola, canale, e le camere. Applicare una pressione conforme utilizzare la macchina di pressatura. </li></ol></li></ol> 3. Immunoassay <ol><li> Riempire le camere con 1% tampone BSA-PBS utilizzando una micropipetta e incubare il disco a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere il buffer mediante aspirazione utilizzando una micropipetta. Eseguire questo passaggio per bloccare i siti non-reagito e per ridurre l&#39;adsorbimento non specifico di proteine ​​in un disco. </li><li> Lavare due volte con 0,1% BSA-PBS compilando ed aspirando le camere con una micropipetta. NOTA: A questo punto il disco può essere conservato a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li><li> Carico 10 ml di antigene-spillo sangue intero o nel siero privo di CRP per il rilevamento CRP sul disco utilizzando un micropipette. Per rendere i grafici di calibrazione, utilizzare concentrazioni di CRP da 1 pg / ml a 100 ng / ml; e cTnI da 10 pg / ml a 100 ng / ml. NOTA: A causa dei livelli elevati di CRP nel sangue intero, che è di solito nella gamma micron, senza siero-CRP è stato utilizzato per dimostrare il limite di rilevamento basso del dispositivo. </li><li> Girare il disco a 3.600 rpm (391 xg) per 60 sec per separare i globuli rossi. </li><li> Aprire il rubinetto # 1 per irraggiamento laser, e il trasferimento di 4 ml di plasma surnatante alla camera contenente 8 ml di ricerca degli anticorpi coniugati con HRP facendo girare il disco a 2.400 giri al minuto per 3 sec. NOTA:. I procedimenti generali per l&#39;azionamento della valvola e la visualizzazione di funzionamento del disco sono descritti in dettaglio in una precedente relazione 21 </li><li> Applicare una modalità di miscelazione (15 Hz s -1, 15 °) per 5 secondi per il legame degli anticorpi della proteina e rilevamento. </li><li> Aprire la valvola # 2, e trasferire il composto preparato al punto 6 alla camera di reazione di legame (2.400 rpm, 3 sec). Quindi, applicare una modalità di miscelazione (60 Hz s -1, 2 °) per 20 minuti per ottenere un immunoreaction tra la miscela e gli anticorpi leganti sui TiO 2 NFs. Dopo la reazione, valvola aperta # 3 e trasferire la miscela residua nella camera di scarico (2.400 rpm, 10 sec). </li><li> Trasferire il tampone di lavaggio (600 microlitri) alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 4 e girare il disco (2.400 rpm, 4 sec). Quindi applicare una modalità di miscelazione (30 Hz s -1, 30 °) per 120 secondi per lavare i TiO2 NFs nella camera. </li><li> Lavare le TiO2 NFs altre due volte seguendo stessa condizione di passo 3,8, e rimuovere completamente il tampone di lavaggio residua facendo girare il disco a 2.400 rpm per 20 sec. Quindi, chiudere la valvola # 5. </li><li> Per la reazione chemiluminescente, applicare un metodo di miscelazione (30 Hz s -1, 2 °) per 1 min dopo il trasferimento della soluzione di substrato chemiluminescente alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 6 e filaturail disco a 2400 rpm per 10 sec successivamente. </li><li> Trasferire la soluzione di substrato reagito alle camere di rilevamento aprendo la valvola # 7 e girare il disco a 2.400 rpm per 10 sec. </li><li> Misurare segnali chemiluminescenza dalla soluzione di substrato reagito utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) sistema di rilevamento attrezzato modulo. NOTA: Il sistema di rilevamento è una macchina su misura utilizzando i seguenti componenti: motore di punto, i componenti ottico-meccanici, fasi di traduzione e disponibile in commercio PMT. Le parti optomechanical e il motore passo sono assemblati per tenere il dispositivo, e il motore può ruotare il disco. La rilevazione viene eseguita da PMT fissato sulle parti optomeccanici, e si trova sopra le camere di rilevamento del dispositivo. Manipolando il motore passo-passo, le camere di rilevamento sono allineati proprio sotto la zona di rilevamento di PMT. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il saggio su TiO 2 NF disco integrato è una tecnica rapida, economica e conveniente per la rilevazione ultrasensibile di basse proteine ​​abbondanti presenti in molto basso volume di sangue. Questa tecnica ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione (10 microlitri) ed è suscettibile di analisi di campioni multipli simultaneamente. Questo fornisce un grande potenziale come dispositivo di multiplexing immunologico. Il dispositivo ha il vantaggio che non richiede Campione fasi di pretrattamento come...

Diverse piattaforme per la diagnosi della malattia sono stati sviluppati sulla base di materiali su scala nanometrica 1,2, come nanofili, 3 nanoparticelle, nanotubi 4, 5 e nanofibre (NFS) 6-8. Questi nanomateriali offrono ottime prospettive nella progettazione di nuove tecnologie per saggi biologici altamente sensibili per le loro proprietà fisico-chimiche uniche. Ad esempio, mesoporosa zinco nanofibre ossido sono stati utilizzati per la rivelazione sensibile femto-molare di biomarcatori cancro al seno. 9 Recentemente, nanomateriali a base di biossido di titanio (TiO 2) sono stati esplorati per applicazioni bioanalitici 10 considerando la loro stabilità chimica, 11 denaturazione proteica trascurabile , 12 e biocompatibilità. 13 Inoltre, i gruppi idrossilici sulla superficie di TiO 2 facilitare modificazione chimica e l&#39;attacco covalente di biomolecole. 14,15 modellato TiO 2 thin film 16 o TiO 2 nanotubi 17 sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità di rilevazione di una proteina bersaglio, aumentando l&#39;area superficiale; Tuttavia, il processo di fabbricazione è piuttosto complessa e richiede attrezzature costose. D&#39;altra parte, NFS elettrofilate stanno ricevendo attenzione a causa della loro elevata area superficiale, così come processo semplice e di fabbricazione a basso costo; 18,19 ancora, la caratteristica fragile o allentato del NF mat elettrofilate TiO 2 rende difficile da gestire e integrazione con dispositivi microfluidici. 6,20 Pertanto, le TiO2 tappetini NF sono stati raramente utilizzati in applicazioni bioanalitiche, in particolare quelle che richiedono condizioni di lavaggio difficili. In questo studio, per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per il trasferimento del elettrofilate NF stuoie sulla superficie di un substrato bersaglio utilizzando uno strato adesivo polidimetilsilossano sottile (PDMS). Furthermore, abbiamo dimostrato con successo l&#39;integrazione di elettrofilate TiO 2 NF stuoie su un dispositivo microfluidico centrifuga in policarbonato (PC). Utilizzando questo dispositivo, una rivelazione sensibile alto, completamente automatizzato e integrato di proteina C-reattiva (CRP) e troponina I cardiaca (cTnI) è stata raggiunta entro 30 minuti da solo 10 ml di sangue intero. 21 A causa della combinata vantaggi delle proprietà della FN e la piattaforma centrifuga, il saggio esposti un&#39;ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza da 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pm) con un limite inferiore di rilevamento di 0,8 pg / ml (~ 6 fM) per CRP e una gamma dinamica di 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un limite di rilevazione di 37 pg / ml (~ 1,5 pM) per cTnI. Questi limiti di rilevabilità sono ~ 300 ~ e 20 volte inferiore rispetto ai loro corrispondenti risultati convenzionali ELISA. Questa tecnica può essere applicata per la rilevazione di eventuali proteine ​​bersaglio, con anticorpi appropriati. Nel complesso, questo dispositivo could contribuiscono notevolmente alla diagnostica in vitro e saggi biochimici poiché può rilevare rare quantità di proteine ​​bersaglio con grande sensibilità anche da piccole quantità di campioni biologici; ad esempio, 10 ml di sangue intero. Sebbene abbiamo dimostrato solo la rilevazione di proteine ​​del siero utilizzando ELISA in questo studio, la tecnologia di trasferimento e l&#39;integrazione dei elettrofilate NFs con dispositivi microfluidici potrebbe essere più ampiamente applicato in altre reazioni biochimiche che richiedono una grande superficie per alta sensibilità di rilevazione.

<table><tbody><tr><td>Si wafer</td><td>LG SILTRON</td><td>Polished Wafer, grado di prova</td><td>Ø (mm) = 150, orientamento = < 100>, drogante = boro, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, spessore (&mu; m) = 650 - 700</td></tr><tr><td>Policarbonato (PC)&nbsp;</td><td>Daedong Plastic PCS</td><td>#6900</td><td>Spessore (mm) = 1 e 5&nbsp;</td></tr><tr><td>Titanio tetraisopropossido, 98%,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidone, Mw = 1,300,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437190</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)-1-triclorosilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>PDMS e agente indurente</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td></td></tr><tr><td>GPDES</td><td>Gelest Inc</td><td>SIG5832.0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>J T Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FE-SEM</td><td>FEI</td><td>Nova NanoSEM</td><td></td></tr><tr><td>Spettroscopia fotoelettronica a raggi X</td><td>ThermoFisher</td><td>K-alfa</td><td></td></tr><tr><td>Macchina di modellazione 3D</td><td>M& I CNC Lab, Corea</td><td></td><td>Fresatrice CNC</td></tr><tr><td>Macchina per l'erogazione della cera</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nastro biadesivo</td> personalizzato <td>FLEXcon, USA</td><td>DFM 200 trasparente 150 POLY H-9 V-95</td><td></td></tr><tr><td>Plotter da taglio</td><td>Graphtec Corporation, Giappone</td><td>Graphtec CE3000-60 MK2</td><td></td></tr><tr><td>Spin coater</td><td>MIDAS</td><td>SPIN-3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fornace (calcinazione)</td><td>R. D. WEBB COMPANY</td><td>WEBB 99</td><td></td></tr><tr><td>Reometro (Tack test)</td><td>Thermo Scientific</td><td>Haake MARS&nbsp; III - Pacchetto</td><td></td>ORM</tr><tr><td>Sistema al plasma</td><td>di ossigeno FEMTO</td><td>CUTE</td><td></td></tr><tr><td>Topo monoclonale antiumano hsCRP</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4C28</td><td>(clone # C5)</td></tr><tr><td>Topo monoclonale anti-cTnI</td><td>Hytest Ltd., Finlandia</td><td>4T21</td><td>(clone # 19C7)</td></tr><tr><td>HRP capra coniugata policlonale anti-hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab19175</td><td></td></tr><tr><td>HRP monoclonale di topo coniugato anti-cTnI</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab24460</td><td>(clone # 16A11)</td></tr><tr><td>hsCRP</td><td>Abcam plc., MA</td><td>ab111647</td><td></td></tr><tr><td>cTnI</td><td>Fitzgerald, MA</td><td>30-AT43</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Amresco Inc</td><td>E404</td><td></td></tr><tr><td>Provette per la raccolta del sangue</td><td>BD vacutainer</td><td>367844</td><td>K2 EDTA 7,2 mg più provette per la raccolta del sangue </td></tr><tr><td>SuperSignal ELISA femto</td><td>Invitrogen</td><td>37074</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre multilabel modulare</td><td>Perkin Elmer</td><td>Envision 2104</td><td></td></tr><tr><td>Macchina operatrice a disco</td><td>Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Corea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo fotomoltiplicatore personalizzato (PMT)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>H1189-210</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk</td><td>Versione 2012</td><td>Software di progettazione</td></tr><tr><td>Software CAD 3D SolidWorks&nbsp;</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Versione 2013</td><td>Software di progettazione 3D,</td></tr> <tr><td>versione software</td> <td>Edgecam</td> Vero <td>2009.01.06928</td><td>Software di generazione codice</td></tr><tr><td>DeskCNC</td><td>Carken Co.</td><td>versione 2.0.2.18</td><td>Software per fresatrice CNC</td></tr></tbody></table>

completamente dispositivo automatizzato centrifuga microfluidic per il rilevamento di proteine ​​ultrasensitive da sangue intero

Fully Automated Centrifugal Microfluidic Device for Ultrasensitive Protein Detection from Whole Blood

Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è un metodo promettente per rilevare piccole quantità di proteine in campioni biologici. I dispositivi che forniscono una piattaforma per ridurre il volume del campione e il tempo di analisi, nonché l'automazione completa, sono necessari per il potenziale utilizzo nella diagnostica point-of-care. Recentemente, abbiamo dimostrato la rilevazione ultrasensibile delle proteine sieriche, della proteina C-reattiva (CRP) e della troponina cardiaca I (cTnI), utilizzando un lab-on-a-disc composto da tappetini nanofibrosi (NF) di TiO2. Ha mostrato un'ampia gamma dinamica con sensibilità di rilevamento femtomolare (fM), da un piccolo volume di sangue intero in 30 minuti. Il dispositivo è costituito da diversi componenti per la separazione, il dosaggio, la miscelazione e il lavaggio del sangue che sono automatizzati per una migliore sensibilità da bassi volumi di campione. Qui, nel video dimostrativo, mostriamo i protocolli sperimentali e il know-how per la fabbricazione di NF e del disco, la loro integrazione e il funzionamento nel seguente ordine: processi per la preparazione del tappetino TiO2 NF; stampa transfer del tappetino TiO2 NF sul disco; modifica della superficie per reazioni immunitarie, assemblaggio e funzionamento del disco; Rilevamento su disco e risultati rappresentativi per il test immunologico. L'uso di questo dispositivo consente l'analisi multiplex con un consumo minimo di campioni e reagenti. Dati i vantaggi, il dispositivo dovrebbe trovare impiego in un'ampia varietà di applicazioni e dimostrarsi utile nel facilitare l'analisi di proteine poco abbondanti.

Usando questo protocollo, un dispositivo di microfluidica centrifuga completamente automatizzato per il rilevamento di proteine ​​dal sangue intero ad alta sensibilità è stato preparato. TIO 2 tappetini NF sono stati preparati da processi di elettrospinning e calcinazione. Al fine di realizzare NFS di diametro desiderato, la morfologia e lo spessore, condizioni quali la portata, la tensione, e il tempo spinning electrospinning sono stati ottimizzati. Se le condizioni non sono ...

Questo protocollo dimostra come raggiungere la sensibilità di rilevamento femtomolare delle proteine in 10 μL di sangue intero entro 30 minuti. Ciò può essere ottenuto utilizzando tappetini nanofibrosi elettrofilati integrati in un lab-on-a-disc, che offre un'elevata superficie e un'efficace miscelazione e lavaggio per un migliore rapporto segnale/rumore.

Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine ​​Ultrasensitive da sangue intero

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a promising method to detect small amount of proteins in biological samples. The devices providing a platform ...

L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la sensibilità di rilevamento dell'ELISA utilizzando nanofibre filate naturali. Questo video mostra come ottenere la sensibilità di rilevamento femtomolare delle proteine in 10 microlitri di campioni di sangue intero entro 30 minuti. In una piattaforma lab-on-a-disc, la forza centrifuga viene utilizzata per trasferire il liquido attraverso le camere e l'intero processo è completamente automatizzato.La sensibilità di rilevamento potrebbe essere notevolmente migliorata dall'integrazione di nanofibre. Tuttavia, il problema era che la nanofibra è molto fragile e difficile da maneggiare. In questo video, introduciamo un semplice processo per fissare fragili tappetini in nanofibra di biossido di titanio su un disco di plastica.Per fabbricare tappetini in nanofibra di biossido di titanio su substrato di silicone mediante elettrofilatura, il substrato di silicone viene prima silanizzato, rivestito con PDMS e prepolimerizzato. Un tappetino in nanofibra viene quindi trasferito a questo PDMS prepolimerizzato e questo prodotto viene perforato per produrre un pezzo circolare per il fissaggio. Rivestire la camera di reazione con una goccia di PDMS come adesivo e attaccare il pezzo circolare sul fondo della camera.Quindi, polimerizzare il PDMS in forno. Infine, assembla gli strati del disco in un unico dispositivo completo per ELISA. Questa tecnica di trasferimento delle nanofibre ci consente di utilizzare l'elevata superficie delle nanofibre per la bioanalisi.Il dispositivo microfiletico centrifugo offre la piena integrazione e automazione di tutti i processi richiesti nell'ELISA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti è che potrebbe rilevare concentrazioni femtomolari di proteine da soli 10 microlitri di sangue intero. Preparare le soluzioni precursori come descritto nel protocollo di test allegato.Quindi caricare la soluzione nell'elettrofilatore e fabbricare le nanofibre mediante elettrofilatura, utilizzando le condizioni ottimali. Quando i tappetini in nanofibra polimerica sono preparati, calcinarli in una fornace sotto vuoto. Dopo la calcinazione, i tappetini in nanofibra di biossido di titanio vengono finalmente preparati.Prepara il layout microfiletico utilizzando un software di progettazione 3D come SOLIDWORKS e trasferisci il progetto alla fresatrice CNC. Azionare la fresatrice CNC per fabbricare il disco con canali e camere. Il disco e il tappetino in nanofibra sono ora pronti per essere integrati.Preparare una camera a vuoto, un substrato di silicone e il fluorosilano. Silanizzare il substrato siliconico con fluorosilano sotto vuoto per 30 minuti. Preparare il PDMS ospite preparando il prepolimero con un agente indurente in un rapporto di 10 a uno e centrifugare il rivestimento sul substrato siliconico silanizzato a 650 giri/min per 60 secondi.Polimerizzare il PDMS rivestito sul wafer silanizzato a 65 gradi Celsius per 10 minuti per renderlo adesivo. Ora trasferisci quei tappetini in nanofibra sul silicone rivestito di PDMS applicando una pressione appropriata utilizzando un oggetto piatto come un vetrino. Cuocere il campione a 80 gradi Celsius per un'ora per polimerizzare completamente il PDMS adesivo.Erogare alcune gocce di etanolo sui tappetini in nanofibra attaccati allo strato PDMS e praticare un foro di sei millimetri di diametro utilizzando un PunchIt. Quindi staccare i tappetini in nanofibra perforati attaccati al PDMS dal substrato di silicone. Quindi, rivestire la camera di reazione di legame nel disco con circa 20 microlitri di miscela PDMS e posizionare le nanofibre attaccate al PDMS nelle camere.Quindi, incubare il disco integrato nel tappetino in nanofibra a 80 gradi Celsius per un'ora. Preparare una soluzione all'1% in volume per volume di GPDES in etanolo. Quindi, trattare le nanofibre nel disco con plasma di ossigeno.Erogare 100 microlitri di soluzione GPDES su ciascun tappetino in nanofibra e incubare a temperatura ambiente per due ore in un contenitore sigillato. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione GPDES picchiettando il disco su un tergicristallo. Lavare con etanolo, togliere e infornare a 80 gradi Celsius per un'ora.Dopo la cottura, lavare con etanolo e picchiettare per rimuoverlo. Ripetere questo processo e asciugare con un getto di azoto. Per l'immobilizzazione degli anticorpi, erogare la soluzione di anticorpi catturati diluita.Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 gradi per quattro ore. Lavare via la soluzione rimanente con un tampone di lavaggio. A questo punto, assemblare il disco utilizzando un nastro biadesivo.Applicare una pressione ragionevole per assemblare gli strati in un disco completo. Riempire le camere di reazione legante con tampone bloccante e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare due volte con il tampone di lavaggio e conservare il disco a 40 gradi Celsius fino al momento dell'uso.Caricare i reagenti, i tamponi di lavaggio e 10 microlitri di sangue intero nelle camere dei reagenti e dei campioni. Posizionare il disco in una macchina di visualizzazione personalizzata per l'immunodosaggio automatizzato. Il sistema di visualizzazione contiene un rotore collegato a un computer per il funzionamento automatizzato del disco insieme a una luce stroboscopica e una telecamera CCD per scattare immagini.Far girare il disco a 3, 600 giri/min per 60 secondi per separare i globuli rossi. Mescolare il plasma con gli anticorpi di rilevamento. Trasferire la miscela nella camera di reazione integrata con tappetino in nanofibra di biossido di titanio.Dopo l'immunoreazione, lavare le nanofibre trasferendo il tampone di lavaggio nella camera di reazione. Quindi, trasferire la soluzione del substrato chemiluminescente nella camera di reazione di legame e incubare in modalità di miscelazione per un minuto. Infine, trasferire la soluzione del substrato reagito nella camera di rilevamento.Al termine di tutta la reazione, trasferire il disco in un sistema di rilevamento e leggere il segnale chemiluminescente utilizzando un software personalizzato. Il funzionamento del disco e il sistema di rilevamento possono essere integrati in un'unica piattaforma. Ottimizzando la tensione e il fluorato, sono stati ottenuti tappetini uniformi in nanofibra come mostrato in questa immagine SEM.Al fine di ottimizzare il tempo di polimerizzazione del PDMS, è stata misurata la forza di adesione. Se era troppo corto, il tappetino in nanofibra veniva incorporato nel PDMS o staccato se troppo lungo. Dopo l'ottimizzazione, il tappetino in nanofibra è stato quindi fissato stabilmente al PDMS.L'intervallo lineare per la rilevazione della proteina C-reattiva da due piattaforme è mostrato in questo grafico. Utilizzando il laboratorio di integrità delle nanofibre sul disco, siamo stati in grado di ottenere una sensibilità di rilevamento altamente migliorata della proteina C-reattiva da soli 10 microlitri di siero entro 30 minuti. Le tecnologie attualmente disponibili, come l'ELISA basato su piastre a 96 pozzetti, richiedono un volume di campione maggiore e un tempo di rilevamento più lungo.Nel complesso, l'ELISA basato su disco integrato in nanofibra ha mostrato un'ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza con un limite di rilevamento di sei femtomoli di proteina C-reattiva. Questa sensibilità di rilevamento, aiutata dall'elevata area superficiale fornita dalla nanofibra integrata nel disco, ha superato quella dell'ELISA convenzionale, che era limitato a 2.000 femtomoli. Dopo aver visto questo video, ci auguriamo che tu abbia una buona comprensione di come preparare un dispositivo microfiletico centrifugo, come integrare le nanofibre fasiche e come eseguire il rilevamento delle proteine utilizzando ELISA.Questa tecnica può essere utile per rilevare proteine a basso legame in una quantità molto piccola di campioni biologici.

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