Completamente dispositivo automatizzato centrifuga Microfluidic per il rilevamento di proteine Ultrasensitive da sangue intero
16 aprile 2016
Questo protocollo dimostra come raggiungere la sensibilità di rilevamento femtomolare delle proteine in 10 μL di sangue intero entro 30 minuti. Ciò può essere ottenuto utilizzando tappetini nanofibrosi elettrofilati integrati in un lab-on-a-disc, che offre un'elevata superficie e un'efficace miscelazione e lavaggio per un migliore rapporto segnale/rumore.
L'obiettivo generale di questa procedura è migliorare la sensibilità di rilevamento dell'ELISA utilizzando nanofibre filate naturali. Questo video mostra come ottenere la sensibilità di rilevamento femtomolare delle proteine in 10 microlitri di campioni di sangue intero entro 30 minuti. In una piattaforma lab-on-a-disc, la forza centrifuga viene utilizzata per trasferire il liquido attraverso le camere e l'intero processo è completamente automatizzato.
La sensibilità di rilevamento potrebbe essere notevolmente migliorata dall'integrazione di nanofibre. Tuttavia, il problema era che la nanofibra è molto fragile e difficile da maneggiare. In questo video, introduciamo un semplice processo per fissare fragili tappetini in nanofibra di biossido di titanio su un disco di plastica.
Per fabbricare tappetini in nanofibra di biossido di titanio su substrato di silicone mediante elettrofilatura, il substrato di silicone viene prima silanizzato, rivestito con PDMS e prepolimerizzato. Un tappetino in nanofibra viene quindi trasferito a questo PDMS prepolimerizzato e questo prodotto viene perforato per produrre un pezzo circolare per il fissaggio. Rivestire la camera di reazione con una goccia di PDMS come adesivo e attaccare il pezzo circolare sul fondo della camera.
Quindi, polimerizzare il PDMS in forno. Infine, assembla gli strati del disco in un unico dispositivo completo per ELISA. Questa tecnica di trasferimento delle nanofibre ci consente di utilizzare l'elevata superficie delle nanofibre per la bioanalisi.
Il dispositivo microfiletico centrifugo offre la piena integrazione e automazione di tutti i processi richiesti nell'ELISA. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti è che potrebbe rilevare concentrazioni femtomolari di proteine da soli 10 microlitri di sangue intero. Preparare le soluzioni precursori come descritto nel protocollo di test allegato.
Quindi caricare la soluzione nell'elettrofilatore e fabbricare le nanofibre mediante elettrofilatura, utilizzando le condizioni ottimali. Quando i tappetini in nanofibra polimerica sono preparati, calcinarli in una fornace sotto vuoto. Dopo la calcinazione, i tappetini in nanofibra di biossido di titanio vengono finalmente preparati.
Prepara il layout microfiletico utilizzando un software di progettazione 3D come SOLIDWORKS e trasferisci il progetto alla fresatrice CNC. Azionare la fresatrice CNC per fabbricare il disco con canali e camere. Il disco e il tappetino in nanofibra sono ora pronti per essere integrati.
Preparare una camera a vuoto, un substrato di silicone e il fluorosilano. Silanizzare il substrato siliconico con fluorosilano sotto vuoto per 30 minuti. Preparare il PDMS ospite preparando il prepolimero con un agente indurente in un rapporto di 10 a uno e centrifugare il rivestimento sul substrato siliconico silanizzato a 650 giri/min per 60 secondi.
Polimerizzare il PDMS rivestito sul wafer silanizzato a 65 gradi Celsius per 10 minuti per renderlo adesivo. Ora trasferisci quei tappetini in nanofibra sul silicone rivestito di PDMS applicando una pressione appropriata utilizzando un oggetto piatto come un vetrino. Cuocere il campione a 80 gradi Celsius per un'ora per polimerizzare completamente il PDMS adesivo.
Erogare alcune gocce di etanolo sui tappetini in nanofibra attaccati allo strato PDMS e praticare un foro di sei millimetri di diametro utilizzando un PunchIt. Quindi staccare i tappetini in nanofibra perforati attaccati al PDMS dal substrato di silicone. Quindi, rivestire la camera di reazione di legame nel disco con circa 20 microlitri di miscela PDMS e posizionare le nanofibre attaccate al PDMS nelle camere.
Quindi, incubare il disco integrato nel tappetino in nanofibra a 80 gradi Celsius per un'ora. Preparare una soluzione all'1% in volume per volume di GPDES in etanolo. Quindi, trattare le nanofibre nel disco con plasma di ossigeno.
Erogare 100 microlitri di soluzione GPDES su ciascun tappetino in nanofibra e incubare a temperatura ambiente per due ore in un contenitore sigillato. Dopo l'incubazione, rimuovere la soluzione GPDES picchiettando il disco su un tergicristallo. Lavare con etanolo, togliere e infornare a 80 gradi Celsius per un'ora.
Dopo la cottura, lavare con etanolo e picchiettare per rimuoverlo. Ripetere questo processo e asciugare con un getto di azoto. Per l'immobilizzazione degli anticorpi, erogare la soluzione di anticorpi catturati diluita.
Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 gradi per quattro ore. Lavare via la soluzione rimanente con un tampone di lavaggio. A questo punto, assemblare il disco utilizzando un nastro biadesivo.
Applicare una pressione ragionevole per assemblare gli strati in un disco completo. Riempire le camere di reazione legante con tampone bloccante e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora. Lavare due volte con il tampone di lavaggio e conservare il disco a 40 gradi Celsius fino al momento dell'uso.
Caricare i reagenti, i tamponi di lavaggio e 10 microlitri di sangue intero nelle camere dei reagenti e dei campioni. Posizionare il disco in una macchina di visualizzazione personalizzata per l'immunodosaggio automatizzato. Il sistema di visualizzazione contiene un rotore collegato a un computer per il funzionamento automatizzato del disco insieme a una luce stroboscopica e una telecamera CCD per scattare immagini.
Far girare il disco a 3, 600 giri/min per 60 secondi per separare i globuli rossi. Mescolare il plasma con gli anticorpi di rilevamento. Trasferire la miscela nella camera di reazione integrata con tappetino in nanofibra di biossido di titanio.
Dopo l'immunoreazione, lavare le nanofibre trasferendo il tampone di lavaggio nella camera di reazione. Quindi, trasferire la soluzione del substrato chemiluminescente nella camera di reazione di legame e incubare in modalità di miscelazione per un minuto. Infine, trasferire la soluzione del substrato reagito nella camera di rilevamento.
Al termine di tutta la reazione, trasferire il disco in un sistema di rilevamento e leggere il segnale chemiluminescente utilizzando un software personalizzato. Il funzionamento del disco e il sistema di rilevamento possono essere integrati in un'unica piattaforma. Ottimizzando la tensione e il fluorato, sono stati ottenuti tappetini uniformi in nanofibra come mostrato in questa immagine SEM.
Al fine di ottimizzare il tempo di polimerizzazione del PDMS, è stata misurata la forza di adesione. Se era troppo corto, il tappetino in nanofibra veniva incorporato nel PDMS o staccato se troppo lungo. Dopo l'ottimizzazione, il tappetino in nanofibra è stato quindi fissato stabilmente al PDMS.
L'intervallo lineare per la rilevazione della proteina C-reattiva da due piattaforme è mostrato in questo grafico. Utilizzando il laboratorio di integrità delle nanofibre sul disco, siamo stati in grado di ottenere una sensibilità di rilevamento altamente migliorata della proteina C-reattiva da soli 10 microlitri di siero entro 30 minuti. Le tecnologie attualmente disponibili, come l'ELISA basato su piastre a 96 pozzetti, richiedono un volume di campione maggiore e un tempo di rilevamento più lungo.
Nel complesso, l'ELISA basato su disco integrato in nanofibra ha mostrato un'ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza con un limite di rilevamento di sei femtomoli di proteina C-reattiva. Questa sensibilità di rilevamento, aiutata dall'elevata area superficiale fornita dalla nanofibra integrata nel disco, ha superato quella dell'ELISA convenzionale, che era limitato a 2.000 femtomoli. Dopo aver visto questo video, ci auguriamo che tu abbia una buona comprensione di come preparare un dispositivo microfiletico centrifugo, come integrare le nanofibre fasiche e come eseguire il rilevamento delle proteine utilizzando ELISA.
Questa tecnica può essere utile per rilevare proteine a basso legame in una quantità molto piccola di campioni biologici.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra come ottenere una sensibilità di rilevamento a livello femtomolare di proteine in 10 µL di sangue intero entro 30 minuti. Il metodo utilizza membrane di nanofibre elettrofilate integrate in una piattaforma lab-on-a-disc, migliorando il rapporto segnale-rumore grazie a un efficiente mescolamento e lavaggio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biotecnologia
- Rilevamento delle proteine
- Nanotecnologia
Sfondo
- L'ELISA è un metodo comune per la rilevazione delle proteine.
- Migliorare la sensibilità della rilevazione è fondamentale per una diagnosi accurata.
- Le nanofibre naturali a filamento possono aumentare la sensibilità, ma sono fragili.
- I sistemi automatizzati di tipo lab-on-a-disc possono semplificare il processo.
Scopo dello studio
- Migliorare la sensibilità di rilevamento dell'ELISA.
- Dimostrare l'uso di nanofibre in un sistema lab-on-a-disc.
- Fornire un metodo per la manipolazione di membrane di nanofibre fragili.
Metodi Utilizzati
- Integrazione di membrane di nanofibre di biossido di titanio su un disco di plastica.
- Utilizzo della forza centrifuga per trasferire liquidi attraverso camere.
- Automazione dell'intero processo di rilevamento.
- Valutazione della sensibilità del rilevamento in campioni di sangue intero.
Risultati principali
- Raggiunta sensibilità nell'ordine dei femtomoli per la rilevazione delle proteine.
- Dimostrate efficaci capacità di miscelazione e lavaggio.
- Mostrata la fattibilità dell'uso di nanofibre fragili in un'applicazione pratica.
- Convalidato il processo automatizzato per analisi rapida.
Conclusioni
- L'integrazione di nanofibre migliora significativamente la sensibilità di rilevamento.
- La tecnologia lab-on-a-disc offre un approccio promettente per saggi proteici.
- Questo metodo può essere adattato per varie applicazioni diagnostiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questa tecnologia risponde all'esigenza critica di una rilevazione ultrasensibile delle proteine in campioni clinici di piccolo volume, consentendo la scoperta precoce di biomarcatori a partire da quantitativi minimi di sangue intero. Integrando nanofibre elettrofilate in una piattaforma microfluidica centrifuga, raggiunge una sensibilità nell'ordine dei femtomoli entro 30 minuti, migliorando significativamente il limite di rilevazione rispetto al tradizionale ELISA. Questo progresso favorisce la validazione degli obiettivi e l'identificazione dei candidati principali riducendo i falsi negativi nel dosaggio di proteine a bassa abbondanza, influenzando direttamente le decisioni di riduzione del rischio preclinico e di priorità del portafoglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di proteine bersaglio a bassa abbondanza nel sangue intero, migliorando la fiducia nelle associazioni tra bersaglio e malattia.
- Valore operativo: Riduce il consumo del campione a 10 µL, permettendo di utilizzare campioni clinici preziosi in più saggi multiplex.
- Valore predittivo: Il limite di rilevamento nel rango dei femtomoli migliora il rapporto segnale-rumore, favorendo una quantificazione più affidabile dei biomarcatori nei flussi di lavoro di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce una piattaforma standardizzata e automatizzata per lo sviluppo di saggi immunoanalitici con manipolazione e mescolamento dei fluidi riproducibili.
- Valore operativo: Elimina i passaggi di pipettaggio manuale, riducendo la variabilità e aumentando la produttività nelle campagne di screening di anticorpi.
- Prontezza del saggio: Consente analisi multiplex con consumo minimo di reagenti, facilitando la validazione di target basata su pannelli.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo una quantificazione proteica coerente tra diversi tipi e volumi di campioni.
- Controllo del rischio: L'elevata sensibilità riduce la probabilità di non rilevare segnali precoci di farmacocinetica o farmacodinamica nei modelli di malattia.
- Utilità preclinica: Compatibile con i volumi ematici di piccoli animali, supporta studi longitudinali senza richiedere prelievi terminali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso della scoperta precoce, sostenendo la validazione dell'obiettivo guidata da ipotesi mediante la rilevazione quantitativa di proteine in matrici clinicamente rilevanti.
- Biologia della scoperta: Facilita la riduzione del rischio meccanicistico consentendo il rilevamento di biomarcatori specifici per il percorso nel sangue intero, migliorando la fiducia sul bersaglio.
- Screening: Offre prestazioni di immunodosaggio pronte per l'automazione con un dosaggio e un lavaggio preciso dei fluidi, essenziali per una valida riproducibilità dei risultati positivi.
- Analisi: Genera letture quantitativi chemiluminescenti su sei ordini di grandezza, consentendo un confronto accurato dell'espressione proteica tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Supporta l'allineamento dei biomarcatori rilevando proteine clinicamente rilevanti (ad esempio, PCR, cTnI) in sangue minimamente processato.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione del laboratorio su disco consente l'adattamento della piattaforma a diversi immunodosaggi, promuovendo la standardizzazione di reagenti e flussi di lavoro.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a limiti di rilevamento e intervallo dinamico migliorati.
- Valore operativo: L'automazione completa riduce il tempo di manipolazione manuale e la variabilità tra utenti, migliorando la riproducibilità del saggio tra diversi siti.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione basate su dati biomolecolari solidi ottenuti da campioni limitati, riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce l'avanzamento con adeguata gestione del rischio fornendo una quantificazione affidabile di bersagli a bassa abbondanza già nelle fasi iniziali del processo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'elettrofilatura, nella manipolazione di nanofibre e nella progettazione di dispositivi microfluidici per una corretta fabbricazione.
- Presuppone l'accesso a macchinari per fresatura CNC, trattamento al plasma e attrezzature a vuoto per la preparazione del disco e del feltro di nanofibre.
- Necessita della standardizzazione dei protocolli di rivestimento e reticolazione del PDMS per garantire un'adesione costante delle nanofibre tra diversi lotti.
- L'adattamento a bersagli proteici alternativi richiede una nuova ottimizzazione della chimica superficiale e delle condizioni di incubazione.
- I limiti pratici includono la necessità di condizioni ambientali controllate durante il trasferimento delle nanofibre e la possibile variabilità nell'uniformità del feltro di fibre.
