Name: Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri un metodo di citometria a flusso per isolare cellule endoteliali emogeniche e progenitori ematopoietici da tessuti embrionali murini. Questa tecnica consente l'isolamento affidabile di cellule vitali per analisi e coltura.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Etica Dichiarazione: Il protocollo descritto di seguito è stato rivisto da, ed è in conformità con le linee guida del, Institutional Animal Care di Yale University e del Comitato Usa. 1. Tutta la Embrione Ex V Ivo cultura per il sacco vitellino Studies (opzionale) <ol><li> Euthanize dighe in gravidanza a E7.0 - E7.5, e rimuovere le corna uterine in condizioni sterili, come descritto più dettagliatamente in seguito (passi 2,4-2,7). </li><li> Separare gli embrioni interi (con sacco vitellino intatto 12) da decidua circostante, e la sospensione in 50 ml di siero intero ratto in 50 ml provette di polistirene. </li><li> Bottiglie embrione gas per 3 minuti con 5% di CO 2 immediatamente come precedentemente descritto 12,18. Ripetere questo passaggio a 24 ore se la coltura di embrioni per 24 - 48 ore. </li><li> Incubare a rotolamento cultura 37 ° C per un massimo di 48 ore. Nota: Gli embrioni possono essere trattate ex vivo con agenti farmacologici (per esempio, inibitore Notch DAP.T 12) o solubili proteine ​​(cioè, fibronectina 19) mediante la pre-incubazione di embrioni per un massimo di 2 ore in terreno di coltura contenenti tali fattori, o mediante aggiunta di tali elementi al mezzo di coltura di laminazione per tutta la lunghezza della coltura ex vivo periodo. L&#39;espressione genica può essere manipolata in embrioni di pre-incubazione di embrioni con lentivirus in modo ottimale titolato per 2 ore 12. Tuorlo vascolare sac e sviluppo ematopoietiche possono essere monitorati in tempo reale utilizzando topi reporter transgenici e le tecniche di imaging ottico. </li></ol> 2. La dissezione di tuorlo d&#39;Sac (YS) o Aorta-gonade-mesonefro (AGM) da embrioni di topo <ol><li> Sterilizzare banco di laboratorio a spruzzo e pulire tutte le superfici con il 70% di etanolo per ridurre la contaminazione nelle successive colture cellulari. Inserire un underpad assorbente sulla superficie banco di laboratorio. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici con il 70% di etanolo. strumenti chirurgici consigliati sono due # 5 vigore drittops, e uno forbici 8,5 cm rette. </li><li> Se si lavora con embrioni da ex vivo cultura, rimuovere con attenzione gli embrioni interi da 50 ml tubi Falcon e procedere immediatamente al punto 2.8. In caso contrario, saltare questo passaggio e passare al punto 2.4. </li><li> Euthanize diga incinta a appropriata all&#39;età embrionali (E8.5 se YS di raccolta; E10.5 se la raccolta AGM). Nota: La tecnica descritta impiega un approccio di eutanasia dual-metodo - dose letale di un anestetico volatile seguita da dislocazione cervicale meccanico - per ridurre al minimo il dolore degli animali e angoscia, e per garantire la cessazione minimamente invasiva e umano dei soggetti animali. Questa tecnica combinata per piccoli roditori l&#39;eutanasia è raccomandato dalla American Veterinary Medical Association se effettuata da un investigatore esperto e competente (Linee guida AVMA per l&#39;eutanasia degli animali: edizione 2013). <ol><li> Anestetizzare mouse utilizzando una dose letale di isoflurano (&gt; 5% in O 2) per 3-5 min. (CautiON: Isoflurane è un inalante tossica; usare sotto una cappa con dispositivi di protezione adeguati respiratoria.) </li><li> Dopo l&#39;esposizione di topi a isoflurano, controllare almeno tre segni di livello anestetico - perdita del riflesso di raddrizzamento, perdita di punta pizzico reflex, e riduzione della frequenza respiratoria - per garantire i soggetti hanno raggiunto un piano anestetico profondo prima di procedere con l&#39;eutanasia meccanico. </li><li> Cervicale dislocate diga di indurre rapidamente la morte. </li></ol></li><li> Posizionare eutanasia supina diga sul underpad e liberamente spruzzare basso addome con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un&#39;incisione verticale lungo la linea mediana della parete addominale inferiore. Apportare ulteriori ~ incisioni orizzontali 1 pollice che si estende a destra ea sinistra dal punto medio della incisione verticale, e sezionare via la parete addominale per esporre completamente a destra ea sinistra corna uterine ciascuno contenente più embrioni gestazione. </li><li> Utilizzando pinze, tenere premuto uno dei due corna uterinee usare le forbici per separarlo dal mesometrio. Mettere utero sezionato su ghiaccio in soluzione salina bilanciata sterile di Hank (HBSS) in una piastra di coltura tissutale polistirolo 60mm. Ripetere l&#39;operazione per altro corno uterino. </li><li> Sotto un microscopio ottico dissezione di serie, usare il forcipe per tirare via strato muscolare dell&#39;utero sac per rivelare il sacco gestazionale sottostante e decidua. Isolare YS (Figura 2A) rimuovendo delicatamente la sacca dall&#39;embrione chiusa. Rimuovere il tessuto YS dall&#39;embrione adeguata alla origine embrionale dei vasi vitellina. </li><li> Per isolare il AGM, rimuovere il YS e transetto l&#39;embrione di sotto del livello del cuore e arti anteriori e scartare la regione torace e testa. Successivamente, transetto l&#39;embrione appena sotto il livello delle arti posteriori e rimuovere ed eliminare il tessuto coda. Rimuovere le zampe posteriori e tessuto ventrale eccesso dal restante sezione, che contiene l&#39;AGM (Figura 2B). </li><li> Pool YS o AGM tessuti da embrioni multipli e negoziosul ghiaccio in HBSS + (HBSS supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,3 mg / ml di L-glutammina) in una provetta pulita da 1,5 ml. </li></ol> 3. La digestione del tessuto primario in una cella singola sospensione <ol><li> provetta contenente YS raccolte o tessuti AGM per 5 min a 2000 xg a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e tessuti risospendere in 1 ml o 0,05% (per YS) o 0,2% (per AGM) collagenasi di tipo II diluita in HBSS +. Incubare per 30 minuti in bagno d&#39;acqua a 37 ° C, invertendo il tubo ogni 5 minuti per mescolare. </li><li> Delicatamente dissociarsi meccanicamente il tessuto passando campione di 10 volte attraverso una pipetta P1000. Se avere difficoltà aspirazione dei tessuti parzialmente digerito, pipetta foro punta può essere ampliato tagliando ~ 5 mm punta con un paio di forbici. </li><li> Campione Centrifugare per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml ghiacciata HBSS +. </li><li> Passare campione attraverso un 70 &amp;# 956; colino cella m. </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro manuale o automatica. </li><li> Campione Centrifugare per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. campione Risospendere in DMEM + (4,5 g / L di glucosio Dulbecco Modified Eagle Medium supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino e 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina, e 0,3 mg / ml di L-glutammina) pre- riscaldato a 37 ° C tale che le cellule sono ad una concentrazione finale di 1 x 10 6 cellule / ml. </li></ol> 4. trattamento delle cellule con Nucleic Acid Dye e di etichettatura con fluorescente coniugati anticorpi <ol><li> Aliquota di almeno 100 ml di campione (1 x 10 5 cellule) in nuove provette da 1,5 ml per l&#39;incubazione degli anticorpi. </li><li> Includere il seguente campione e provette di controllo necessarie: senza macchia; solo CKIT-APC; solo CD45-FITC; solo CD31-PE; solo Flk1-PECy7; Hoechst 33342 solo; Hoechst 33342 solo + Verapamil; Esempio (riceve tutti i colori, non riceverà Verapamil). Utilizzare un minimo di 1 x 10 <sup&gt; 5 cellule in 100 ml per i tubi di controllo. Nota: Un volume maggiore di cellule può essere aggiunto alla provetta campione alla stessa concentrazione di massimizzare il rendimento del filtrate Hemogenic CE e HSPC. </li><li> Aggiungere Verapamil diluito in etanolo al 95% (vedi la discussione per logica) al &quot;Hoechst 33342 solo + Verapamil&quot; tubo di controllo ad una concentrazione finale di 50 micron. Incubare tutte le provette per 5 minuti a 37 ° C. (ATTENZIONE: Verapamil è un potente agente bloccante dei canali del calcio ed è estremamente tossica Maneggiare con guanti.). </li><li> Aggiungere Hoechst 33342 al &quot;Hoechst 33342 solo&quot; controllo, all&#39;unica + Verapamil controllo Hoechst 33342, e al tubo &quot;campione&quot; per una concentrazione finale di 5 mg / ml. Incubare tutte le provette per 1 ora a 37 ° C, al riparo dalla luce. Mescolare delicatamente capovolgendo ogni 15 min. (ATTENZIONE: Hoechst 33342 è un colorante nucleare tossico e deve essere maneggiato con i guanti). </li><li> Centrifuga tutto SAMPles per 5 minuti a 2.000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare ad una concentrazione di 1 x 10 5 cellule / ml in HBSS freddo +. </li><li> Aggiungere anticorpi coniugati fluorescenza ad opportuni tubi di controllo anticorpi sola, e al tubo &quot;campione&quot; per una concentrazione finale di 2 mg / ml. Incubare in ghiaccio per 30 minuti, al riparo dalla luce. </li><li> Centrifugare tutte le provette per 5 min a 2000 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in 500 microlitri ghiacciata HBSS. campioni di filtrare attraverso maglie tappo del filtro di 5 ml a fondo tondo tubi in polistirolo FACS e memorizzare sul ghiaccio, al riparo dalla luce, per FACS immediati. </li></ol> 5. identificazione e l&#39;isolamento delle cellule endoteliali e Hemogenic HSPC da FACS Nota: Questo protocollo è stato ottimizzato utilizzando un sistema BD FACSAria 5-laser dotato di 100 MW 355 nm laser UV, un 200 MW 405 nm laser viola, un 200 MW 488 nm laser blu, una da 200 MW a 532 nm laser verde, e un 150 mw 637 nm Rossolaser. Le cellule sono state filtrate in PBS sterile come fluido di trasporto e in condizioni asettiche, e attraverso un ugello 100 micron con portata impostata ad una pressione campione di 1 tale che un massimo di 1.500 - sono acquisiti 2.000 eventi al secondo per minimizzare lo stress cellulare. <ol><li> In queste impostazioni sopra descritte, utilizzare tubi di controllo del colore &quot;non colorati&quot; e singole per ottimizzare FACS cell sorter intensità laser ed eseguire il controllo di compensazione spettrali multi-colore in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare in avanti e scatter lato per eseguire delle cellule dal vivo e doublet discriminazione da eventi totali (vedi le istruzioni del produttore per maggiori dettagli). Nota: Questo protocollo si traduce tipicamente in ~ 70 - 80% di cellule vitali. Se i problemi si incontrano con bassa vitalità cellulare, garantire che i tessuti sono inizialmente sezionati rapidamente in ghiaccio mezzi fredda, e che tutti i passaggi tranne quelle che specificano tuttavia vengono effettuate su ghiaccio, con blanda pipettaggio per minimizzare tranciatura e morte cellulare(Vedi la discussione per maggiori dettagli sulla conservazione vitalità cellulare). </li><li> Utilizzare una trama differenziale lineare scala di Hoechst Red vs. Hoechst blu fluorescenza per identificare la popolazione lato (SP) eventi (Figura 3A). Utilizzare il controllo &quot;Hoechst 33342 solo + Verapamil&quot; come controllo negativo per verificare che le porte siano opportunamente elaborate per il campione. SP apparirà come una spalla sinistra delle cellule non-SP, e verrà ridotto nel controllo Verapamil-trattata. La popolazione non-SP sarà utilizzato per identificare non hemogenic CE (Figura 3B). </li><li> Creare ulteriori trame differenziale di fluorescenza (assi di log-scala) e disegnare cancelli figlia della SP per identificare le cellule endoteliali hemogenic (Figura 3C-E). Nota: le cellule endoteliali Hemogenic sono profilate come cellule Flk1 + / CKIT + / CD45- SP (Figura 3D), e HSPC sono Flk1- / CKIT + / CD45 + cellule SP (Figura 3E). Hemogenic endoteliale cells possono essere analizzati in parallelo con le cellule endoteliali non hemogenic, che sono identificate in questo approccio le cellule non-SP CD31 + / CD45- (Figura 3B). </li><li> Recupero delle cellule endoteliali hemogenic o frazione HSPC su metilcellulosa contenente le piastre per la cultura ematopoietiche (vedi sotto), o in altri buffer per la successiva elaborazione e analisi. </li></ol> 6. emopoietiche differenziazione nella cultura <ol><li> Aggiungere 0,5 ml (135 ml / cm 2) metilcellulosa basato ematopoietiche cultura media per numero desiderato di pozzetti di una piastra di coltura tissutale da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Aggiungere 0,5 ml di acqua sterile nella pozzetti non utilizzati per ridurre al minimo l&#39;evaporazione. Preparare aperta e mantenerlo a temperatura ambiente fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Ordina 1 - 10 cellule per l&#39;analisi clonale, o fino a 1.000 cellule endoteliali hemogenic (Flk1 + / CKIT + / cellule CD45- SP) o HSPC (cellule Flk1- / CKIT + / CD45 + SP) per l&#39;espansione della massa e la differenziazione direttamente in ciascun pozzetto dellapiatto contenente metilcellulosa. formazione di colonie viene rilevato in circa il 10 - 20%. </li><li> In una cappa coltura di tessuti sterili, utilizzare una punta P1000 con la punta tagliata di ampliare il suo foro, per risospendere delicatamente ogni pozzetto dei media metilcellulosa teste di serie 2 - 3 volte, avendo cura di evitare la creazione di bolle. Questo assicura sospensione delle cellule ordinati in metilcellulosa semisolido per la crescita ottimale. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 settimane. </li><li> Monitorare colture cellulari singoli per la formazione di colonie di cellule ematopoietiche differenziate nel tempo (Figura 4). Punteggio pozzi per numero e tipo di colonie ematopoietiche differenziati nei giorni 1, 3, 7, e 14 con il metodo (s) indicato di seguito al punto 6.7. <ol><li> piastre punteggio giorno 1 per confermare confluenza e continua vitalità delle cellule ordinati. </li><li> Di giorno 3, controllare la prima formazione di colonie di cellule endoteliali hemogenic aderenti con &quot;ciottolitono &quot;morfologia (vedi Goldie et al. 11 e Marcelo et al. 12 per la rappresentazione del giorno 3 morfologia). </li><li> In giorni 5 - 7, verificare la presenza di formazione di cluster HSPC arrotondati in pozzetti contenenti ordinato hemogenic CE. HSPC occorre osservare adiacente al appiattito hemogenic CE visualizzazione di una morfologia delle cellule endoteliali &quot;ciottoli&quot;. Nota: le cellule endoteliali Hemogenic dovrebbero formare colonie ematopoietiche (determinati dal numero di colonie ematopoietiche), e devono dimostrare la capacità di differenziazione multi-lignaggio (determinata dalla osservazione di diversi tipi di colonie da una singola cellula). Abbiamo già osservato che ~ 20% di hemogenic CE o HSPC recuperato da FACS sopravvivere per formare la differenziazione e la proliferazione di colonie ematopoietiche in metilcellulosa 11. </li></ol></li><li> Per valutare la formazione di colonie al microscopio fase: <ol><li> Visualizzare e contare le colonie a basso ingrandimento under un microscopio ottico di fase, e identificare BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM colonie dalla morfologia delle colonie, come descritto da Goldie et al. 11. </li></ol></li><li> Per valutare la formazione di colonie dalla morfologia delle cellule: <ol><li> Aspirare singole colonie dalla superficie metilcellulosa in una punta P1000 con l&#39;estremità tagliata per allargare il foro. Questo facilita l&#39;aspirazione del mezzo metilcellulosa viscoso e garantisce il prelievo successo della colonia. </li><li> Risospendere raccolse colonie in 200 ml HBSS e girare su un vetrino utilizzando un citocentrifuga a 28 g per 5 min. </li><li> Fissare i vetrini in metanolo 100% per 5 min (ATTENZIONE: Il metanolo è tossico e deve essere utilizzato solo in una cappa chimica con ventilazione appropriata e dispositivi di protezione individuale). </li><li> Immergere i vetrini in 0,04% Giemsa per 20 min (ATTENZIONE:. Giemsa contiene metanolo Utilizzare in una cappa chimica con ventilazione e persona appropriataAl dispositivi di protezione). </li><li> Sciacquare i vetrini in acqua deionizzata. </li><li> Montare i vetrini con vetrini, e l&#39;immagine ad alto ingrandimento al microscopio ottico normale, paragonando la morfologia delle cellule a quello classicamente osservato in cellule ematopoietiche da midollo osseo adulto che sono coltivate in mezzi metilcellulosa. Per esempi, consultare le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Per valutare la formazione di colonie da parte delle cellule espressione di marcatori lignaggio ematopoietiche da FACS: <ol><li> Aggiungere 2 ml di HBSS a ciascun pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenenti le colonie coltivate su 0,5 ml metilcellulosa (cioè, diluire disponibile in commercio magazzino metilcellulosa 1: 4). Pipetta su e giù per mescolare, e trasferimento in provetta (s). </li><li> campione Centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C utilizzando un tavolo microcentrifuga standard. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare (s) in 1 ml HBSS +, mettendo in comune i campioni se lo si desidera. </li><li> Centrifucampione ge a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet cellulare (s) in 400 microlitri HBSS +. </li><li> parte aliquota in quattro provette da 1,5 ml come segue: senza macchia; solo B220-FITC; GR-1-FITC solo; Ter119-FITC solo. </li><li> Aggiungere anticorpo fluorescente coniugato nella provetta appropriata per una concentrazione finale di 2 mg / ml. Incubare a 37 ° C per 15 min. </li><li> campione Centrifugare a 2.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet di cellule in ghiacciata 0,5 ml HBSS. </li><li> Analizzare ogni campione da FACS per l&#39;espressione di ogni marcatore lignaggio ematopoietico: B220 segna cellule B 20; GR-1 segni di cellule mieloidi 21; Ter119 segna cellule eritroidi 22. Nota: ulteriori anticorpi mirati altri marcatori ematopoietiche lignaggio possono essere incorporati in questo approccio, se lo si desidera. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Questo lavoro è stato sostenuto byNIH sovvenzioni HL128064, Innovazioni HL096360, EB017103, e CT concedere 15-RMB-YALE-04, a KKH, e NICHD / NIH T32HD007094.

Rimangono molte domande senza risposta nel campo dello sviluppo hematovascular - un campo che è ancora nella sua infanzia a causa delle difficoltà tecniche insite nello studio di popolazioni di cellule transitori e piccole che emergono solo durante specifici finestre di sviluppo. Le tecniche di cui sopra migliorano molte di queste difficoltà, consentendo per l&#39;isolamento di singole cellule, anche dalla cellule endoteliali hemogenic e popolazioni HSPC nei tessuti embrionali in momenti critici dello sviluppo che utilizzano reagenti e attrezzature che sono in genere disponibili nella maggior parte dei laboratori. Il nostro protocollo consente inoltre di isolamento parallelo di frazioni cellulari endoteliali non hemogenic dal YS e AGM, che possono essere utilizzati per analisi indipendenti, o come controlli per la frazione di cellule endoteliali hemogenic in analisi successive. Un punto chiave l&#39;isolamento delle cellule endoteliali hemogenic utilizzando questo metodo FACS basata multicolore è opportuno co spettralempensation e il disegno preciso di cancelli monocolore. Come tale, è fortemente raccomandato che i controlli senza macchia e monocolore essere inclusi in tutte le prove sperimentali, e che - insieme con i campioni trattati con anticorpi di controllo isotipo-matched - essere utilizzato per stabilire inizialmente una corretta compensazione spettrale e il disegno di cancelli. Tuttavia, la colorazione non specifica è minima da questo protocollo, in tal modo i controlli non colorati e single-colore sono sufficienti per la verifica di routine di cancelli, una volta impostazioni sorter FACS sono state ottimizzate. cancelli SP impreciso disegnati sono una preoccupazione particolare con l&#39;approccio descritto nella presente relazione. Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule staminali multipotenti esibiscono efflusso preferenziale di Hoechst rosso 17, formando la base fisiologica per il loro aspetto nel SP da FACS. Abbiamo dimostrato che le cellule endoteliali hemogenic e HSPC sono ugualmente trovato all&#39;interno della frazione di cellule SP 5,11. Farmaci come il canale di calciohibitor Verapamil bloccare questo comportamento tintura efflusso Hoechst nelle cellule SP tramite il blocco di una serie di trasportatori di resistenza transmembrana multidrug. In cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, questo avviene principalmente per via ABCG2 / BCRP1 trasportatore 24. In genere induce verapamil&gt; 50% blocco del SP, però, ha dimostrato di essere colpiti da tempi di sviluppo, presumibilmente a causa di cambiare espressione dei tipi di trasportatore multiresistente multipla con differenziale Hoechst il grado complessivo di Hoechst efflusso e la sua successiva blocco da parte Verapamil visto capacità di efflusso, e la sensibilità di Verapamil 5. Pertanto, si raccomanda vivamente di Verapamil-trattata Hoechst macchiato di controllo negativo essere Sono compresi per garantire una corretta gating SP: se una porta SP sia formalmente, una notevole riduzione del numero di cellule SP deve essere rilevato in campioni colorati con Hoechst in la presenza di Verapamil. Abbiamo precedentemente dimostrato che risoltoCellule SP dal sacco E9.5 murino tuorlo hanno un ~ 80-90 volte maggiore capacità di generare HSPC nella cultura ematopoietiche metilcellulosa-based rispetto ad un numero corrispondente di E9.5 non frazionata, non Hoechst macchiato intere cellule del tessuto YS 5. Ulteriore caratterizzazione della SP ha dimostrato che nel sacco vitellino murino durante ematopoietico precoce e lo sviluppo vascolare E8.0, vi è apprezzabile espressione di VE-caderina e FLK-1, ma a bassa espressione di stelo (c-Kit) e marcatori ematopoietici (CD45). Così, a questo timepoint sviluppo, primordiale (non hemogenic), CE, definito come FLK-1 + / CD31 + cellule non SP / CD45- predominano. Questo profilo di espressione turni come espressione marcatore endoteliale diminuisce e CD45 e c-Kit espressione aumenta, in concomitanza con una crescente capacità di generare HSPC in vitro tra E9.5 e E11.5 5. Questo suggerisce l&#39;attività ematopoietiche del tessuto YS è contenuto all&#39;interno del SP, diventando più evidente tra E9.5 e E11.5, e si verificasseroing attraverso una perdita temporizzato delle caratteristiche endoteliali e graduale acquisizione della capacità ematopoietiche. Come tale, l&#39;espressione dei trasportatori multidrug resistance che danno origine al fenotipo SP sono un importante marcatore fenotipico dell&#39;endotelio hemogenic 5; infatti, le cellule non-SP dal AGM non presentano formano il sangue potenziale 12. Così, successo isolamento della SP tramite Hoechst colorazione sia nel YS e AGM assicura che le cellule saranno scelti dal vano di cellule staminali ematopoietiche di un determinato tessuto, e successiva colorazione anticorpale di cellule all&#39;interno questa frazione consentirà discriminazione della hemogenic (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) rispetto HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) popolazioni 5,11,12. Inoltre, è stato precedentemente osservato che le cellule CD41 + nel SP del sacco vitellino e tessuti AGM sono in grado di formazione di colonie multi-lineage in cultura basata metilcellulosa 11,12. Definiamo cellule endoteliali hemogenic come cellule CD45- SP Flk1 + c-Kit +s utilizzando CD45 come marcatore designato di lignaggio ematopoietico piuttosto che CD41 data la nostra ricerca che l&#39;espressione di CD45 Flk1 ed è praticamente escludono a vicenda 5,11. Questo permette un isolamento puro di cellule all&#39;interno della SP c&#39;hanno endoteliale (FLK-1) e stelo caratteristiche (c-Kit) necessari per endoteliale di transizione ematopoietiche, ma che non hanno ancora subito questo cambiamento, come determinato dalla mancanza di CD45 in questi cellule. Sarebbe utile considerare sub-frazionamento della popolazione HSPC, definito come cellule FLK-1- / c-Kit + / CD45 + / SP, in CSF1R + (macrofagi dei tessuti) e Csf1r- frazione (HSC), come recentemente riportato da Gomez e colleghi 25, in quanto ciò fornirebbe una maggiore risoluzione della vera HSPC contro popolazioni tessuto macrofagi progenitrici, ma questo non dovrebbe pregiudicare l&#39;integrità della frazione delle cellule endoteliali hemogenic cui isolamento abbiamo delineato dal CSF1R è un marcatore di progenitori macrofagi 26. Hemogcellule endoteliali ENIC sono una sottopopolazione rare sia YS e AGM (comprendente 1 - 3% di cellule endoteliali), e quindi una sfida importante nella loro studio è resa cella insufficiente per applicazioni successive. Questo protocollo di solito si traduce nel 70-80% delle cellule rimanenti vitali per il momento di smistamento, e una tipica hemogenic cellule endoteliali sorta di tessuti pool ottenuto da embrioni multipli può produrre solo poche centinaia di cellule anche in condizioni ottimali, con solo il 10-20% di cellule incorporati in colonie metilcellulosa produzione recuperato. Per massimizzare il numero di cellulare ordinata, è fortemente raccomandato che gli investigatori adottare misure per garantire il tessuto e la vitalità delle cellule in ogni fase della procedura: i tessuti dovrebbero essere rapidamente sezionati e messe in comune, ed i campioni devono essere tenuti in ghiaccio, quando possibile. I campioni devono essere preparati freschi immediatamente prima FACS ordinamento, e ordinati in tubi di raccolta contenenti alto contenuto di siero, o direttamente nella cultura metilcellulosa come descrittod sopra. Se persistono problemi di redditività, provette per il prelievo possono essere pre-rivestite con siero per migliorare ulteriormente la sopravvivenza delle cellule ordinato. Se hemogenic rendimento delle cellule endoteliali rimane bassa, adulto midollo osseo o perline fluoroforo coniugato disponibili in commercio possono essere utilizzati per la compensazione spettrale in luogo delle embrionali controlli singolo colore derivate dal tessuto descritti nel presente documento. Se le cellule ordinati sono destinati per la cultura, le cellule endoteliali hemogenic e HSPC devono essere ordinati direttamente nei pozzetti di coltura dei tessuti. Se le cellule ordinati sono destinati DNA o RNA Analisi dell&#39;espressione genica correlati, cellule endoteliali hemogenic e non hemogenic e HSPC possono essere ordinati direttamente in tubi di raccolta contenenti tampone di lisi del campione per ridurre al minimo la perdita di cellule. La tecnica descritta consente successo (e simultanea) isolamento delle cellule endoteliali hemogenic e non hemogenic, nonché HSPC e globuli matura frazioni degli stessi tessuti embrionali. Questo approccio consente inoltre Study delle basi molecolari delle transizioni critiche che si verificano come cellule endoteliali generano sangue. Conoscenze acquisite da questi studi evolutivi possono poi essere utilizzati per ottimizzare la generazione di cellule endoteliali umane e hemogenic HSPC progenie da pluripotenti, e potenzialmente autologo, le cellule staminali per il trattamento dei disturbi ematopoietici prevalenti.

Un sistema circolatorio funzionale richiede lo sviluppo parallelo di vasi sanguigni e cellule del sangue. Nelle prime fasi di sviluppo del sangue (emopoiesi primitivo), l&#39;origine di eritroblasti rimane vigorosamente dibattuto 1. Al contrario, nelle fasi successive di sviluppo delle cellule del sangue (emopoiesi definitiva), è diventato sempre più chiaro che il multi-lignaggio HSPC derivano da cellule specializzate vascolari endoteliali che acquisiscono la formazione di sangue potenziali (cellule endoteliali hemogenic) all&#39;interno del sacco vitellino, placenta, e AGM 2-5, così come nel vitellina e vasi ombelicali, l&#39;endocardio embrionali 6, e la testa vascolare 7. La specifica delle cellule endoteliali hemogenic all&#39;interno di questi tessuti distinti avviene a fasi specifiche di sviluppo; per esempio, all&#39;interno del sacco vitellino a ~ E8.25 e all&#39;interno del AGM in ~ E10 8-12. Tuttavia, anche in queste specifiche finestre di sviluppo, la popolazione di endo hemogeniccellule thelial rappresenta una piccola frazione di tutte le cellule endoteliali (1 - 3% del sacco vitellino e cellule endoteliali AGM) 11,12. Il processo di &quot;specificazione&quot; hemogenic cellule endoteliali è fondamentale per murina, così come umana, emopoiesi. Cellule ematopoietiche hanno dimostrato di germogliare dalla endotelio dei vasi sac tuorlo e l&#39;aorta in embrioni umani 13, e diversi laboratori hanno dimostrato che la produzione delle cellule del sangue da cellule staminali pluripotenti umane richiede un cellule endoteliali intermedio 14-16. Così, definendo il fenotipo delle cellule endoteliali hemogenic murine e comprendere gli eventi molecolari che portano al loro sviluppo in questo modello animale dovrebbero facilitare ricerca di tecnologie in vitro per la generazione di cellule endoteliali hemogenic da cellule staminali pluripotenti umane. A sua volta, l&#39;eventuale sviluppo di un approccio per la generazione su larga scala di tipi di cellule del sangue differenziate da multi-lignaggio HSPC - si derived da cellule staminali pluripotenti umane attraverso un fisiologicamente rilevanti di cellule endoteliali hemogenic intermedio - avrebbe potenziale terapeutico incredibile per ematologiche, oncologiche e la medicina rigenerativa. Verso questo obiettivo, abbiamo definito il fenotipo delle cellule endoteliali hemogenic, a livello clonale, entro il tuorlo murino sac 11 e 12 AGM, due principali siti di produzione HSPC definitiva durante l&#39;embriogenesi. Come HSPC all&#39;interno del midollo osseo adulto 17, embrionali e cellule endoteliali hemogenic HSPC mostra Hoechst proprietà colorante di efflusso e quindi apparire all&#39;interno della &quot;popolazione lato&quot; (SP) di cellule su un terreno FACS 5,11,12 (come mostrato in Figura 3). Inoltre, abbiamo anche dimostrato che le cellule endoteliali hemogenic esprimono i marcatori di entrambi endoteliali e cellule staminali (rispettivamente Flk1 e CKIT,), ma non esprimono il marcatore lignaggio ematopoietico, CD45 5,11,12. Così, le cellule endoteliali hemogenic possono essere identified e isolati da FACS come cellule Flk1 + / CKIT + / CD45- SP, e ci hanno mostrato che queste cellule danno origine a HSPC contenuta all&#39;interno della / CKIT + / CD45 + SP frazione Flk1- del sacco vitellino e cellule AGM 5,11,12. Cellule endoteliali Hemogenic e HSPC possono essere identificati e isolati dal sacco vitellino o tessuti AGM raccolte sia da embrioni appena eutanasia, o da embrioni in coltura per un massimo di 48 ore in ex vivo della cultura dell&#39;embrione (come illustrato nella Figura 1). Ex vivo cultura permette selettivo pre-trattamento dei singoli embrioni con agenti farmacologici, e consente anche per l&#39;espressione transiente dei transgeni desiderati (cioè, di trasduzione lentivirale). individuazione FACS di cellule endoteliali hemogenic e HSPC con il metodo qui descritto può essere usato come una misura quantitativa di sviluppo ematopoietiche definitiva in modelli murini geneticamente manipolati; le cellule possono anche essere recuperati per le successive applicazioni sperimentali, compreso il sangue-FOsaggi rming, analisi di espressione, e il trapianto. Soggetti ANIMAL: Usi e considerazioni etiche Un corpo crescente di letteratura ha stabilito l&#39;importante contributo delle cellule endoteliali hemogenic alla formazione HSPC durante la fase di ematopoiesi definitivo dello sviluppo embrionale. Tuttavia, le condizioni fisiologiche e segnali che promuovono specifica di una sottopopolazione di cellule endoteliali verso un destino hemogenic ancora non completamente chiaro, e quindi non possono ancora essere simulati in un ambiente in vitro. Infatti, le tecniche descritte in questo documento sono attualmente in uso dal nostro laboratorio e altri gruppi per migliorare la comprensione del campo dello sviluppo hematovascular, tale che possa essere sviluppato un metodo per ex vivo specifica delle cellule endoteliali hemogenic e produzione HSPC un giorno. Fino al momento, tuttavia, il campo dipende di tessuti primari da wild-type (e genecamente modificati) embrioni di topo per ottenere specificati cellule endoteliali hemogenic e HSPC per ulteriori studi. Cellule endoteliali Hemogenic e HSPC possono essere identificate in modo attendibile isolati sia da E8.5 (10 - 12 paia somite) sacco vitellino o E10.5 (35 - 40 coppie di somite) AGM 11,12. A causa della relativa scarsità di cellule endoteliali hemogenic (in genere pari all&#39;1 - 3% del totale delle cellule endoteliali 11,12 all&#39;interno di questi tessuti) la messa in comune dei tessuti da multipla (~ 8 - 10) fratellini in un singolo campione è fortemente raccomandato al fine di ottenere cellule sufficienti per la successiva sperimentazione. Verifica che le cellule endoteliali hemogenic e HSPC sono stati identificati e isolati successo può essere realizzato da colture di cellule recuperate in condizioni che inducono la differenziazione ematopoietiche. In queste condizioni, le cellule endoteliali hemogenic e HSPC esporranno multi-lignaggio differenziazione ematopoietiche, con conseguente comparsa di colonie contenenti Eryprogenitori throid (BFU-E), granulociti e macrofagi progenitori (CFU-GM) e granulociti, eritrociti, macrofagi, le colonie dei megacariociti progenitrici (CFU-GEMM).

<table><tbody><tr><td>DAPT (N-[N-(3,5-Difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenilglicina t-butil estere)</td><td>Sigma</td><td>D5942</td><td>TOSSICO irritante: indossare protezione per gli occhi, maschera e guanti durante la manipolazione.</td></tr><tr><td>Sottopanca assorbente</td><td>Covidien</td><td>7134</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinze dritte Strumenti per</td><td>la scienza</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte da 8,5 cm Strumenti per</td><td>la scienza fine 14090-09</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano (isotesia)</td><td>Henry Schein&nbsp;</td><td>50033</td><td>Inalante TOSSICO: Utilizzare in cappa aspirante.</td></tr><tr><td>100x Penicillina Streptomicina Glutammina (10.000 U/ml Penicillina, 10.000 mg/ml Streptomicina, 29,2 mg/ml L-glutammina)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Tipo II Collagenasi</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 70 &#956; Filtro cellulare in nylon M</td><td>Corning</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD31 - PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Flk-1 PE-Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>561259</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (bisBenzimide H 33342 tricloridrato)</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td>TOSSICO: irritante. Indossare protezioni per gli occhi e guanti durante la manipolazione. Preparare una soluzione madre da 25 mg/ml in H2O distillato, conservare le aliquote a -20 &#176; C fino al momento dell'uso.</td></tr><tr><td>Verapamil cloridrato</td><td>Sigma</td><td>1711202&nbsp;</td><td>TOSSICO: irritante. Indossare protezioni per gli occhi, maschera e guanti durante la manipolazione. &nbsp; Preparare una soluzione madre di 5 mM (100x) in etanolo al 95%. Negozio a -20 &#176; C fino al momento dell'uso&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 5 ml in polistirene a fondo tondo, con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>3434</td><td>Disgelo e aliquota secondo le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>GS500</td><td>TOSSICO modificato: Contiene metanolo - utilizzare nella cappa aspirante e indossare guanti durante la manipolazione. Diluire in acqua distillata fino a 0,02% di soluzione.</td></tr><tr><td>Cytospin Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td></td></tr><tr><td>Starter Kit per imbuto clippato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3120110</td><td>Include citoimbuti, carta da filtro, citovetrini e citoclip per l'uso con la centrifuga Cytospin</td></tr><tr><td>Anti-Mouse B-220 - FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Gr-1-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5931-85</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Ter-119-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-5921-85</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Siero fetale bovino</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437-077</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (4,5 g/L)</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Buffered Salt Solution</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale a 24 pozzetti rivestita di fibronectina</td><td>EMD Millipore</td><td>PIFB24P05</td><td></td></tr><tr><td>IgG2A-PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>553930</td><td></td></tr><tr><td>IgG2B-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>556923</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule murine embrionali hemogenic endoteliali

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

La specifica delle cellule endoteliali hemogenic da endotelio vascolare embrionale si verifica durante brevi periodi di sviluppo all&#39;interno dei tessuti distinti, ed è necessario per la comparsa di definitiva HSPC dal murino sac in più embrionale vitellino, placenta, vasi ombelicali, e le embrionali aorta-gonade-mesonefro ( AGM) regione. La natura transitoria e piccola dimensione di questa popolazione cellulare rende il suo isolamento riproducibile per un&#39;attenta quantificazione e applicazioni sperimentali tecnicamente difficile. Abbiamo stabilito una cella a fluorescenza-attivato (FACS), il protocollo per l&#39;isolamento basata su simultanea di cellule endoteliali hemogenic e HSPC durante le loro ore di punta generazione nel sacco vitellino e AGM. Dimostriamo metodi per la dissezione del sacco vitellino e AGM tessuti da embrioni di topo, e vi presentiamo le condizioni di digestione dei tessuti e degli anticorpi Coniugazione ottimizzate per la sopravvivenza delle cellule massima prima di identificazione e il recupero tramite FACS. Rappresentante FACS anatrame di lisi sono mostrati che identificano il cellule endoteliali hemogenic e fenotipi HSPC, e descrivono un test a base di metilcellulosa per valutare il loro sangue potenziale formando a livello clonale.

Etichettatura di successo delle cellule endoteliali hemogenic e HSPC da YS embrionali o AGM consentiranno di ottenere FACS grafici a dispersione simili alle trame rappresentativi presentati nella figura 3. A seguito di cellule vive di serie e la discriminazione doppietto da in avanti e scatter laterale (non mostrato), la popolazione lato (SP) eventi vengono visualizzati in una Hoechst Red vs. Hoechst blu trama differenziale lineare in assenza di Verapamil come &quot;spalla&quot; sinistro spostato dalla maggior parte degli eventi (non SP) (Figura 3A). Quando il cancello SP è redatto correttamente, le cellule SP rappresenteranno circa il 1-3% delle cellule totali vitali YS e 3-5% del totale eventi AGM vitali. Trattamento Verapamil dovrebbe comportare&gt; 50% di inibizione di eventi SP prescindere dalla fonte tissutale (Figura 3A, pannelli superiori). Abbiamo già stabilito che altre popolazioni che appaiono al di fuori della spalla SP, ma sono anche bloccati da verapamil sono erythr Ter119-positivioblast, e sono quindi esclusi dalla nostra popolazione SP 5. Rispetto alla SP, cellule non-SP sono identificati come denso gruppo di celle adiacenti sulla SP &quot;spalla&quot; (Figura 3A). Questa popolazione contiene non Hemogenic CE che può essere distinto con un CD31-PE contro CD45-FITC figlia plot (Figura 3B), come CD31 + / CD45- eventi. Non Hemogenic CE sono tipicamente 2 - 5% di cellule non-SP da AGM (Figura 3B) o sacco vitellino (non mostrato), e un numero elevato di queste cellule possono essere filtrate indietro con relativa facilità. Per l&#39;identificazione di HSPC e Hemogenic CE, porte figlia sono tratte dalla frazione SP, individuando le cellule CD45 + e CD45-, dove le cellule CD45 + sono in genere &lt;20% degli eventi totali in entrambi AGM (Figura 3C) o YS (non mostrato). Hemogenic CE sono successivamente identificato dalle cellule CD45- in un differenziale di CKIT-APC vs Flk1-PECy7 figlia plot come eventi doppio positive, e tipicamente rappresentano 1 - 3% di eventi CD45- quando isolato da entrambi AGM (Figura 3 D) o YS (non mostrato). HSPC sono identificati dalla frazione CD45 + in un separato CKIT-APC vs Flk1-PECy7 trama figlia / CKIT cellule Flk1- +, e inoltre in genere rappresentano circa il 25 - 30% della piccola popolazione di cellule CD45 +, quando ottenuti da entrambi YS (non mostrato) oppure AGM (Figura 3 e). Così, sia Hemogenic CE e HSPC sono eccezionalmente rari (~ 0,01% degli eventi cellulari totali), ed è tipico per questo protocollo per tornare a poche centinaia di ogni tipo di cellula, anche quando il tessuto da più embrioni vengono mantenuti. Gates in trame figlia dovrebbero essere stabiliti con riferimento ai gruppi di controllo negativo. Al fine di distinguere tra specifica e non specifica colorazione anticorpale, porte fossero inizialmente disegnate in riferimento ad entrambi i controlli non colorati (Figura 3C), così come campioni che sono stati trattati con anticorpi di controllo fluorescenza coniugati isotipo-abbinato (IgG2a o IgG2b) (non mostrato). Quest&#39;ultimo controllo ha dimostrato che la colorazione non specifica è minima da questo protocollo, quindi, mentre si consiglia di anticorpi di controllo isotipo-abbinato (ad es., IgG2a-PE o IgG2b-FITC) essere inizialmente utilizzato per ottimizzare le impostazioni di smistamento FACS e determinare i confini del cancello , troviamo anche che i controlli non colorati sono sufficienti per verificare i confini del cancello e la qualità sperimentale durante FACS di routine di smistamento. Se cancelli sono correttamente disegnate, minima dispersione positiva dovrebbe essere osservata in porte singolo o doppio positivo quando si registra da controlli non colorati o isotipo-abbinato. Cellule endoteliali Hemogenic dal AGM e HSPC subiscono differenziazione ematopoietiche oltre 14 giorni di coltura in metilcellulosa (Figura 4A). La proporzione relativa dei tipi colonie tipicamente osservata in questiculture dipende da fonte tissutale. Cellule endoteliali Hemogenic isolate da tessuti sacco vitellino a E8.5-E9.5 portano ad un BFU-E, CFU-GM, e pochi CFU-GEMM 5, mentre le cellule endoteliali hemogenic isolate dal E10.5 AGM danno origine alle prevalentemente CFU -GEMM 12, anche se si osservano ancora altre linee, come mostrato nella Figura 4B (pannello superiore sinistro). HSPC isolato da E10.5 AGM anche dar luogo prevalentemente a CFU-GEMM sulla cultura in metilcellulosa (Figura 4B, alto pannello centrale), anche se queste cellule potranno anche differenziarsi in altri tipi ematopoietiche colonie pure. Cellule endoteliali non hemogenic (CD31 + / CD45- non-SP) sono stati placcati (Figura 4B, pannello in alto a destra). Queste cellule mostrano alcuna crescita in coltura ematopoietiche dopo 14 giorni. I dosaggi di capacità ematopoietiche del marcatore di superficie individuale che esprimono i tipi di cellule, comprese le cellule con e senza espressione di un ematopoieticheND marcatori endoteliali CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41, CD45 e all&#39;interno della frazione SP del AGM in E10.5 sono stati eseguiti e dimostrare che l&#39;attività multi-lignaggio formanti colonia nel E10.5 AGM è limitato a CD31 +, VE-caderina cellule CD41 + e CD45 + SP 12 +, c-Kit +,. È interessante notare che l&#39;attività delle colonie formando stato osservato in entrambe le cellule FLK-1 + e FLK-1-SP, ma solo le cellule Flk1 + c-Kit + CD45- SP ha dato luogo a colonie multi-lignaggio attraverso un monostrato endoteliale intermedia caratterizzata da entrambi &quot;ciottoli &quot;endoteliali morfologia cellulare (Figura 4B, pannello in basso a sinistra) e Dil-AcLDL captazione 12. Inoltre, l&#39;espressione del c-kit è necessario per l&#39;attività delle cellule ematopoietiche AGM SP 12. Mentre è stato dimostrato che alcuni progenitori mieloidi presentano caratteristiche morfologiche simili rispetto alle cellule endoteliali hemogenic, cellule progenitrici mieloidi esprimono CD45 e non possono generare colonie multi-lineage <em&gt; in vitro. HSPC anche generare colonie multi-lignaggio, ma anche se queste cellule CD45, mancano FLK-1 espressione 12,23 e danno origine a gruppi di cellule arrotondate senza un monostrato endoteliale sottostante (Figura 4B, pannello in basso a destra). Pertanto, la popolazione definiamo endotelio come hemogenic (o, cellule Flk-1 + / c-kit + / CD45-SP) rappresentano le cellule endoteliali con sangue formando espressione potenziale e robusta gene hematoendothelial, tra GATA-1/2, LMO2, SCL / Tal-1, Runx-1, c-Kit, CD34, CD41, CD45 e 11 che sono distinti dalle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, così come le loro controparti delle cellule endoteliali non hemogenic. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig1.jpg" /> Figura 1. Nel complesso flusso di lavoro. In breve, gli embrioni vengono rimossi da dighe in stato di gravidanza, e YS o tessuti AGM vengono raccolte. Gli embrioni possono facoltativamente essere coltivate per 2<html> 4 - 48 ore ex vivo prima del raccolto dei tessuti. YS raccolte o tessuti AGM vengono digeriti a una sospensione di cellule singole, frazionato in provette di controllo e di campione, e incubate in presenza di Hoechst colorante e / o anticorpi fluorescente-coniugati. Verapamil, un inibitore dei canali del calcio, è anche usato per generare un controllo negativo essenziale per la verifica della precisione di suoni della frazione SP. cellule endoteliali Hemogenic sono identificati da FACS come Flk1 + / CKIT + / CD45- SP cellule, mentre HSPC sono contenuti all&#39;interno della frazione Flk1- / CKIT + / CD45 + SP delle cellule; entrambi i tipi di cellule sono ordinati su metilcellulosa per la conferma del potenziale hemogenic. Inoltre, le cellule endoteliali non hemogenic possono essere discriminati (e recuperati, se lo si desidera) come cellule non-SP CD31 + / CD45-. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> IGURA 2 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54150 / 54150fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Dissezione di YS e AGM tessuti. A) La YS è sezionato da embrioni E8.5, e messo tutto in sterile HBSS + per la successiva digestione. B) Il tronco degli embrioni E10.5 è isolato facendo tagli orizzontali al di sotto sia dell&#39;arto anteriore e arti posteriori gemme. L&#39;Assemblea è quindi separato dalle gemme degli arti e pinze dei tessuti utilizzando ventrali. C) immagini in campo chiaro mostrano la dissezione dei due YS e AGM da un embrione E10.5 (scale = 1 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig3.jpg" /> Figura 3. Parcelle rappresentativi Dimostrazione Porta Gerarchia per discriminazionedi Hemogenic cellule endoteliali s (Flk1 + / CKIT + / cellule CD45- SP), HSPC (Flk1- / CKIT + / cellule CD45 + SP), e le cellule endoteliali non hemogenic (CD31 + / CD45- non-SP) da FACS da E8.5 YS o E10.5 AGM. in seguito in diretta la discriminazione delle cellule e farsetto di cellule sia da YS (pannelli a sinistra) oppure AGM (pannelli di destra) di avanti e scatter laterale (non mostrato), A) la popolazione lato (SP) porta viene disegnato e verificato da una riduzione significativa della frazione SP nel controllo negativo Verapamil trattati. La popolazione non-SP è identificato come denso gruppo di celle adiacenti sulla SP. In ciascuna delle piazzole presentati sono visualizzati 20000 eventi B) non hemogenic cellule endoteliali vengono identificate come cellule CD31 + / CD45- all&#39;interno della frazione non SP, e rappresentano 2 -. 5% di cellule non-SP sia ottenuta da AGM (mostrati ) o YS (non mostrato). per discriminate Hemogenic CE o HSPC, C) porte figlia sono tratte dalla frazione SP per identificare le cellule CD45 + e CD45-. D) Per l&#39;identificazione delle cellule endoteliali hemogenic sia da AGM (in figura) o YS (non mostrato), ulteriori porte figlia sono disegnati dalla frazione CD45- di distinguere le cellule CKIT + (vs. cKit-) e Flk1 + (vs. Flk1-). Hemogenic CE sia da YS o AGM sono tipicamente ~ 1 - 3% degli eventi CD45- E) HSPC sono identificate dal CD45 + frazione come CKIT + e Flk1-, e in genere rappresentano il 20 -. 30% di CD45 + cellule se ordinata da AGM (mostrato ) o YS (non mostrato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig3large.jpg" target="_blank">clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54150/54150fig4.jpg" /> Figura 4. Visualizzazione di emopoietiche Differenziazione seguito Cultura di Hemogenic cellule endoteliali e HSPC su metilcellulosa. A) formano colonie da cellule singole ordinati entro 7 giorni di placcatura su metilcellulosa. Multi-lignaggio potenziale ematopoietiche può essere confermata con l&#39;osservazione di diversi tipi di colonie ematopoietiche, identificato dalla valutazione delle morfologie distinta colonia 11. B) Fase di imaging microscopico di ordinato hemogenic CE e HSPC da AGM (o YS, non mostrato) il multi-lignaggio ematopoietiche formazione di colonie dopo 7 giorni di coltura in terreno di coltura metilcellulosa. Non hemogenic CE, dal AGM (o YS, non mostrato) non dimostrano la crescita in queste condizioni. A maggiore ingrandimento, cellule aderenti con morfologia delle cellule endoteliali &quot;ciottoli&quot; classica (freccia bianca) possono essere visti dando origine a gruppi di cellule ematopoietiche in culture di hemogenic CE; tali cellule endoteliali sono osservati in colture di ordinato HSPC (scala = 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54150/54150fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) derivano da (hemogenic) cellule endoteliali specializzate durante lo sviluppo, ma poco si sa circa il processo attraverso il quale alcune cellule endoteliali specificano a diventare la formazione del sangue. Dimostriamo un metodo basato citometria a flusso che permette l&#39;isolamento simultaneo di cellule endoteliali hemogenic e HSPC da tessuti embrionali murine.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare cellule endoteliali ematopoietiche primarie da tessuti embrionali murini mediante il sorting cellulare attivato da fluorescenza. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'isolamento affidabile e specifico di cellule endoteliali ematopoietiche vitali da tessuti ematopoietici embrionali. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per analisi e colture successive.Le cellule endoteliali ematopoietiche, nonché le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici che possono essere isolate mediante questo metodo, verranno quindi utilizzate per contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla regolazione del loro sviluppo e della loro funzione. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà nell'identificare la popolazione laterale di cellule, che comprende le cellule endoteliali ematopoietiche e le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici. Le procedure di dissezione del tessuto embrionale e di scansione saranno dimostrate da Kat Marcelo, un'ex studentessa laureata del mio laboratorio.Oltre a Emily Grits, attuale borsista per la ricerca clinica, e Jen Fang, attuale ricercatrice post-dottorato. Iniziare pulendo tutte le superfici di lavoro con etanolo al 70% e posizionando un tappetino assorbente sulla superficie del bancone del laboratorio.Successivamente, posizionare un topo eutanizzato in posizione supina sul tappetino sottostante e spruzzare abbondantemente la regione addominale inferiore con etanolo al 70%. Praticare un'ampia incisione orizzontale perpendicolare alla linea mediana della parete addominale inferiore. A seguire, effettuare altre due incisioni orizzontali di un pollice ciascuna, estendendole verso l'alto e verso il basso dal punto medio dell'incisione orizzontale.Quindi dissezionare la parete addominale per esporre completamente i due corni uterini destro e sinistro contenenti i numerosi embrioni in gestazione. Utilizzando una pinzetta, afferrare uno dei due corni uterini e, con forbici e pinzetta, staccare l'utero dal miometrio circostante. Trasferire quindi entrambi i corni in una piastra sterile per colture cellulari in polistirene da 60 millimetri posta sul ghiaccio.Posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico standard e utilizzare la pinzetta per separare ogni unità placentaria fetale. Per ogni unità, asportare delicatamente lo strato muscolare di ciascuna sacca uterina, esponendo la sacca gestazionale sottostante e la decidua. Per isolare il sacco vitellino, rimuovere con delicatezza la maggior parte della sacca dall'embrione racchiuso.Rimozione del resto del tessuto del sacco vitellino dall'embrione propriamente detto all'origine embrionale dei vasi vitellini, se necessario. Per isolare l'aorta-gonade-mesonefroso (AGM), effettuare una sezione trasversale dell'embrione al di sotto del cuore e degli arti anteriori e scartare la regione toracica e quella cefalica. Successivamente, effettuare una sezione trasversale dell'embrione appena al di sotto degli arti posteriori, rimuovere e scartare il tessuto della coda.Quindi rimuovere gli arti posteriori e i tessuti ventrali in eccesso dalla sezione rimanente contenente la regione AGM. Man mano che ogni sacco vitellino o AGM viene isolato, raccogliere i tessuti embrionali in tubi da 1,5 millilitri di HPSS+ posti sul ghiaccio. Per ottenere una sospensione monocellulare, centrifugare il tessuto embrionale e risospendere il pellet in un millilitro di Collagenasi di tipo due diluita in HPSS+. Incubare il tubo per 30 minuti in un bagnomaria a 37 gradi Celsius.Mescolare mediante inversione ogni cinque minuti. Al termine dell'incubazione, passare il campione 10 volte attraverso una pipetta P1000 per dissociare delicatamente il tessuto mediante azione meccanica. Quindi centrifugare nuovamente il campione, risospendendo il pellet in un millilitro di HPSS+ freddo su ghiaccio. Filtrare quindi il campione attraverso un filtro cellulare da 70 micron e contare le cellule.Dopo il conteggio, raccogliere nuovamente le cellule mediante centrifugazione. Sospendere nuovamente il pellet in DMN+ a 37 gradi Celsius a una concentrazione di un milione di cellule per millilitro. Per etichettare le cellule per la selezione tramite FACS, aliquotare almeno 100 microlitri di cellule in provette da 1,5 millilitri e aggiungere verapamil diluito in etanolo al 95% nel tubo di controllo solo hoechst più verapamil fino a una concentrazione finale di 50 micromolari.Posizionare tutti i tubi a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi aggiungere l’Hoechst ai soli tubi di controllo con Hoechst e con Hoechst più verapamil, e al tubo del campione, fino a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro, e rimettere i tubi a 37 gradi Celsius per un’ora, protetti dalla luce, mescolando delicatamente i tubi ogni 15 minuti mediante inversione. Al termine dell'incubazione, centrifugare tutti i campioni e diluire i pellet a una concentrazione di 1 × 10⁵ cellule per millilitro in HPSS+ freddo. Aggiungere ora gli anticorpi marcati con fluorocromo ai rispettivi tubi di controllo con anticorpo soltanto e al tubo del campione, fino a una concentrazione finale di due microgrammi per millilitro, e incubare per 30 minuti sul ghiaccio, protetti dalla luce.Al termine dell'incubazione, centrifugare i campioni e risospendere i pellet in 500 microlitri di HPSS freddo su ghiaccio. Filtrare i campioni attraverso i tappi con filtro a maglia di provette FACS in polistirene rotonde da cinque millilitri e posizionare le provette sul ghiaccio al riparo dalla luce. Analizzare quindi immediatamente le cellule mediante citometria a flusso.Dopo la discriminazione standard delle cellule vitali e dei doppietti mediante diffusione anterograda e laterale, gli eventi della popolazione laterale vengono visualizzati nel grafico a dispersione lineare tra hoechst rosso e hoechst blu come un'estensione spostata a sinistra rispetto agli eventi della popolazione non laterale. Questa popolazione laterale è significativamente ridotta con il trattamento con verapamil. Le cellule della popolazione non laterale sono identificate come l'agglomerato denso di cellule adiacente alla popolazione laterale.La frazione cellulare non side population contiene cellule endoteliali non ematogeniche che vengono ulteriormente distinte come eventi CD31+CD45-. Per identificare le cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici ematopoietiche nonché le cellule endoteliali ematogeniche, si tracciano sotto-gate a partire dalla frazione side population, evidenziando le cellule CD45+ e CD45-. Le cellule endoteliali ematogeniche vengono successivamente identificate tra le cellule CD45- in un grafico figlio differenziale di cKit rispetto a Flk1 come eventi doppiamente positivi.I cellule staminali ematopoietiche e le cellule progenitrici vengono identificate dalla frazione CD45+ in un grafico figlio separato come cellule Flk1-cKit+. Seguendo questa procedura, è possibile allestire colture basate su metilcellulosa per valutare in modo funzionale la capacità ematopoietica delle cellule isolate oppure le cellule possono essere immediatamente processate per analisi dell'espressione genica e proteica. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa quattro-cinque ore se eseguita correttamente.Nel corso di questa procedura, è importante ricordare di mantenere i campioni protetti dalla luce e sul ghiaccio, salvo diversa indicazione, per massimizzare la vitalità cellulare. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo della Biologia Emato-Vascolare di esplorare la specificazione ematogena delle cellule endoteliali e la loro produzione di cellule staminali ematopoietiche e cellule progenitrici durante lo sviluppo embrionale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare le cellule endoteliali ematogene da tessuti embrionali murini mediante citometria a flusso.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video mostra come micro-sezionare il sacco vitellino e aorta-gonadi-mesonefro regione da embrioni e l'uso di citometria a flusso per ordinare le cellule staminali ematopoietiche.

Isolamento delle prime cellule staminali emopoietiche da murini sacco vitellino e AGM

Qui, descriviamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di cellule murine endoteliali polmonari. Questo metodo comprende meccanico e dissociazione enzimatica tessuto polmonare e una 2-step processo di purificazione con anti-PECAM-1 e anti-ICAM-2 anticorpi coniugati a sfere magnetiche, che produce una popolazione pura di cellule endoteliali di origine per lo più microvascolare.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Coltura cellulare primaria è una tecnica utile per analizzare specifiche popolazioni di cellule, particolarmente da embrioni di topo transgenico a stadi specifici dello sviluppo. Qui, ventricoli embrionali vengono sezionati e dissociato, e perle di anticorpi coniugati riconoscere e separare le cellule endoteliali per ulteriori analisi.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

La capacità di isolare le cellule endoteliali delle valvole cardiache (VEC) è fondamentale per comprendere i meccanismi di sviluppo, mantenimento e malattia delle valvole.  Qui descriviamo l'isolamento di VEC da topi Tie2-GFP embrionali e adulti utilizzando FACS che consentiranno studi che determineranno il contributo dei VEC nei processi di sviluppo e malattia.

Isolamento di cellule murine endoteliali Valve

La manipolazione dell'espressione genica temporale nelle cellule staminali embrionali (ESC) differenzianti può essere ottenuta utilizzando sistemi genici inducibili. Tuttavia, la generazione di queste linee cellulari è costosa e richiede tempo. Questo protocollo consente di ottenere una rapida espressione di un transgene in cellule derivate da ES in differenziazione e la successiva analisi della differenziazione ematopoietica a valle.

L&#39;infezione retrovirale di Murine staminali embrionali cellulari derivate Cellule embrionali di corpo per l&#39;analisi di differenziazione emopoietiche

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Cellule endoteliali microvascolari dei muscoli scheletrici (MMEC) forma la parete interna dei vasi capillari del muscolo e regolano entrambi, scambio di fluidi/molecole e migrazione delle cellule (immuni) tra sangue e tessuto muscolare. Isolamento di MMEC murino primario, come descritto qui, consente indagini complete in vitro del "unità myovascular".

Isolamento di cellule endoteliali microvascolari murino primario del muscolo scheletrico

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento di cellule endoteliali retiniche postnatali murine ottimizzate per la resa, la purezza e la vitalità delle cellule. Queste cellule sono adatte per approcci di sequenziamento di prossima generazione.

Isolamento di cellule endoteliali retiniche murine per il sequenziamento di nuova generazione

Questo articolo descrive un metodo per l'isolamento basato su biglie magnetiche di cellule endoteliali murine dai capillari linfatici dermici. Le cellule endoteliali linfatiche isolate possono essere utilizzate per esperimenti in vitro a valle e per l'analisi dell'espressione proteica.

Isolamento di cellule endoteliali linfatiche dermiche murine

Questo studio ha stabilito un metodo stabile ed efficiente per l'isolamento, la coltura e la determinazione funzionale delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare (CD34+ VW-SC). Questo metodo di isolamento, facile da seguire ed efficace in termini di tempo, può essere utilizzato da altri ricercatori per studiare i potenziali meccanismi coinvolti nelle malattie cardiovascolari.

Isolamento immunomagnetico delle cellule staminali CD34+ residenti nella parete vascolare dai topi

Scopri un metodo di citometria a flusso per isolare cellule endoteliali emogeniche e progenitori ematopoietici da tessuti embrionali murini. Questa tecnica consente l'isolamento affidabile di cellule vitali per analisi e coltura.

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

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