Name: Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Scopri la misurazione cinetica e la visualizzazione in tempo reale della riprogrammazione somatica in cellule iPSC utilizzando citometria a flusso e marcatori di superficie. Questo metodo consente di monitorare efficacemente la transizione dei fibroblasti.

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Gli autori ringraziano Chad MacArthur per le discussioni utili.

<ol><li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: past, present, and future.</a> Cell Stem Cell. 10, 678-684 (2012).</li>
<li>Robinton, D. A., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+induced+pluripotent+stem+cells+in+research+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy.</a> Nature. 481, 295-305 (2012).</li>
<li>Kamata, M., Liang, M., Liu, S., Nagaoka, Y., Chen, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+monitoring+of+hiPSC+generation+and+differentiation+using+differential+expression+of+endogenous+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Live cell monitoring of hiPSC generation and differentiation using differential expression of endogenous microRNAs.</a> PLoS One. 5, e11834(2010).</li>
<li>Vendrell, M., Zhai, D., Er, J. C., Chang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+strategies+in+fluorescent+probe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Combinatorial strategies in fluorescent probe development.</a> Chem Rev. 112, 4391-4420 (2012).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26, 1276-1284 (2008).</li>
<li>Quintanilla, R. H. Jr, Asprer, J. S., Vaz, C., Tanavde, V., Lakshmipathy, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+is+a+negative+cell+surface+marker+for+pluripotent+stem+cell+identification+during+human+fibroblast+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">CD44 is a negative cell surface marker for pluripotent stem cell identification during human fibroblast reprogramming.</a> PLoS One. 9, e85419(2014).</li>
<li>Papp, B., Plath, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+to+pluripotency%3A+stepwise+resetting+of+the+epigenetic+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Reprogramming to pluripotency: stepwise resetting of the epigenetic landscape.</a> Cell Res. 21, 486-501 (2011).</li>
<li>Nefzger, C. M., Alaei, S., Knaupp, A. S., Holmes, M. L., Polo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+marker+mediated+purification+of+iPS+cell+intermediates+from+a+reprogrammable+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell surface marker mediated purification of iPS cell intermediates from a reprogrammable mouse model.</a> J Vis Exp. , e51728(2014).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalized+fibroblast-like+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells+support+undifferentiated+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Immortalized fibroblast-like cells derived from human embryonic stem cells support undifferentiated cell growth.</a> Stem Cells. 22, 972-980 (2004).</li>
<li>International Stem Cell Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat Biotechnol. 25, 803-816 (2007).</li>
<li>Singh, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+live+alkaline+phosphatase+substrate+for+identification+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Novel live alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rev. 8, 1021-1029 (2012).</li>
<li>Naujok, O., Lenzen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-evaluation+of+CD24-positivity+of+human+embryonic+stem+cells+differentiated+into+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">A critical re-evaluation of CD24-positivity of human embryonic stem cells differentiated into pancreatic progenitors.</a> Stem Cell Rev. 8, 779-791 (2012).</li>
<li>Ramirez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+report%3A+benchmarking+human+pluripotent+stem+cell+markers+during+differentiation+into+the+three+germ+layers+unveils+a+striking+heterogeneity%3A+all+markers+are+not+equal%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Brief report: benchmarking human pluripotent stem cell markers during differentiation into the three germ layers unveils a striking heterogeneity: all markers are not equal.</a> Stem Cells. 29, 1469-1474 (2011).</li>
<li>Huang, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+adhesion+molecule+%28EpCAM%29+complex+proteins+promote+transcription+factor-mediated+pluripotency+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) complex proteins promote transcription factor-mediated pluripotency reprogramming.</a> J Biol Chem. 286, 33520-33532 (2011).</li>
<li>Kolle, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+embryonic+stem+cell+surface+markers+by+combined+membrane-polysome+translation+state+array+analysis+and+immunotranscriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of human embryonic stem cell surface markers by combined membrane-polysome translation state array analysis and immunotranscriptional profiling.</a> Stem Cells. 27, 2446-2456 (2009).</li>
<li>Thyagarajan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+engineered+human+embryonic+stem+cell+lines+using+phiC31+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase.</a> Stem Cells. 26, 119-126 (2008).</li>
</ol>

Tutti gli autori [RHQ, JSTA, KS, e UL] sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific, che produce alcuni dei reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questo studio fornisce strategie per il monitoraggio e il tracciamento del processo di riprogrammazione utilizzando la citometria a flusso e l'analisi basata sull'imaging in tempo reale. Le fasi critiche del protocollo sono l'avvio della riprogrammazione, la misurazione della progressione della riprogrammazione in base all'espressione dei marcatori e il monitoraggio in tempo reale della riprogrammazione. È possibile utilizzare qualsiasi metodo di riprogrammazione a scelta, ma qui ci concentriamo sulla riprogrammazione ba...

Le cellule staminali pluripotenti indotte paziente-derivato (iPSCs) sono strumenti promettenti per la terapia cellulare e lo screening di stupefacenti. Essi forniscono una fonte autologa di cellule per la terapia. Inoltre, essi comprendono una vasta gamma di background genetico, che permette una dettagliata analisi in vitro di malattie genetiche di là di quanto attuali linee di cellule staminali embrionali (ESC) consentirebbe. I recenti progressi hanno portato allo sviluppo di diversi metodi per generare iPSCs, compresi riprogrammazione con virus Sendai, plasmidi episomale o mRNA 1,2. In particolare, diversi metodi di riprogrammazione sono associati a livelli di efficienza e sicurezza variabile, ed è probabile che differiscono in altri modi che influenzano la loro adeguatezza per varie applicazioni. Con la disponibilità di una varietà di tecnologie di riprogrammazione, è diventato importante sviluppare metodi per valutare il processo di riprogrammazione. La maggior parte dei metodi esistenti si basano su l&#39;ispezione qualitativa della morfologia o macchiecon coloranti e gli anticorpi specifici di cellule staminali. Un metodo recentemente sviluppato si avvale di giornalisti fluorescenza lentivirali che sono sensibili a specifici miRNA-PSC o mRNA specifico per cellulari differenziate 3. Tali metodi di monitoraggio facilitano la selezione e l&#39;ottimizzazione delle tecniche di riprogrammazione per situazioni diverse. Ad esempio, CDy1 è stato utilizzato come una sonda fluorescente per i primi iPSCs al fine di schermo per modulatori di riprogrammazione 4. La capacità di osservare e confrontare diversi esperimenti di riprogrammazione è anche fondamentale per ottenere una migliore comprensione del processo stesso. Ad esempio, è ormai noto che alcuni tipi di cellule somatiche sono più facili da riprogrammare di altri 5, e che le cellule passare attraverso stati intermedi durante riprogrammazione 6-8. Purtroppo, i meccanismi alla base del processo di riprogrammazione non sono ancora del tutto chiare e, di conseguenza, le differenze esatte tra i metodi di riprogrammazione rimangono anche essere defined. Così, i metodi per il monitoraggio, la valutazione e confronto eventi riprogrammazione continuano ad essere critica per il campo delle cellule staminali. I metodi descritti in questo protocollo consentono il controllo e la valutazione del processo di riprogrammazione e illustrano come queste tecniche possono essere utilizzati per confrontare diverse serie di reagenti di riprogrammazione. Il primo approccio prevede la citometria a flusso analizza utilizzando combinazioni di anticorpi contro cellule staminali pluripotenti positiva e negativa (PSC) marcatori. L&#39;immagine in tempo reale secondo coppie di avvicinamento e la misurazione di confluenza totale (la superficie cento coperta dalle cellule) e confluenza dei segnali marcatori (la superficie percentuale coperta dai segnali fluorescenti).

<table><tbody><tr><td>DMEM, glucosio alto, GlutaMAXSupplement, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato per cellule staminali embrionali, origine statunitense</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16141-061</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti embrionali inattivati nel topo (ICR)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A24903</td><td></td></tr><tr><td>Proteina del fattore di attacco (1x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S-006-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, integratore GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>Sostituzione del siero knockout</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10828010</tr><tr><td>2-mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi, tipo IV, polvere</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (1x), senza rosso fenolo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12563-011</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, senza calcio, senza magnesio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto senza LDEV, qualificata hESC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1413302</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td></td></tr><tr><td>FGF-Basic (AA 1-155) Proteina umana ricombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PHG0264</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina frazione V (soluzione al 7,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>EMD Millipore</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di riprogrammazione CytoTune-iPS 2.0 Sendai</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A16517</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Countess Vetrini per camera di conteggio cellulare</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti del prepuzio umano BJ ATCC,</td><td>ATCC</td> neonatale <td>CRL-2522</td><td></td></tr><tr><td>DF1 Fibroblasti dermici umani adulti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BG01V/hOG Cellule Variante hESC hOct4-GFP Cellule reporter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R7799-105</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SSEA-4 Anticorpo, Alexa Fluor 647 coniugato (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SSEA421</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SSEA-4, coniugato Alexa Fluor 488 (eBioMC-813-70 (MC-813-70))</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14810</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo SSEA-4 (MC813-70)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-4000</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Anticorpo (cl.A)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; 41-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Mab anti-umano/topo di ratto (clone IM7), coniugato PE-Cy5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A27094</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Alexa Fluor 488 Kit coniugato per imaging di cellule vive</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25528</td><td></td></tr><tr><td>CD44 mAb anti-umano/topo di ratto (clone IM7)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RM-5700 (non più disponibile)</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo IgG (H+L) di capra, Alexa Fluor 488 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11029</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-ratto di capra, Alexa Fluor 594 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; A-11007</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina colorante viva</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Kit coniugato per imaging di cellule vive</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A25618</td><td></td></tr><tr><td>CD24 MAb anti-umano di topo (clone SN3), coniugato FITC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD2401</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo beta-2 microglobulina, coniugato FITC (B2M-01)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15737</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo EpCAM / CD326, coniugato FITC (VU-1D9)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A15755</td><td></td></tr><tr><td>CD73 / NT5E Anticorpo (7G2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41-0200</td><td></td></tr><tr><td>VECTOR Kit substrato di fosfatasi alcalina rossa (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-5100</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.Z1 microscopio&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>491912-0003-000</td><td></td></tr><tr><td>Software di analisi dati FlowJo</td><td>FLOJO, LLC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a focalizzazione acustica Attune, laser blu/rosso</td><td>Thermo Fisher Uso scientifico</td><td>Attune NXT&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>S3e\ Selezionatore di celle (488/561 nm)</td><td>BIO-RAD</td><td>1451006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tubo 12 x 75 mm con tappo del filtro delle celle Corning</td><td>352235</td><td></td><td>Falcon</td></tr><tr><td>15 ml, ad alta trasparenza, tappo a vite con chiusura a cupola</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-75 Flask</td><td>Corning</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Falcon T-175 Flask</td><td>Corning</td><td>353112</td><td></td></tr><tr><td>Piatto Falcon a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Heracell CO2 Incubatore rotante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51013669</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microfuge antiaderenti e prive di RNasi, 1,5 ml</td><td></td><td>AM12450</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer Sample Mixer</td><td></td><td>15920D</td><td></td></tr></tbody></table>

cinetica misurazione e tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

La riprogrammazione somatica ha permesso la conversione di cellule adulte in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) provenienti da diversi background genetici e fenotipi di malattia. I recenti progressi hanno identificato metodi più efficienti e sicuri per l'introduzione di fattori di riprogrammazione. Tuttavia, ci sono pochi strumenti per monitorare e tracciare la progressione della riprogrammazione. Gli attuali metodi per il monitoraggio della riprogrammazione si basano sull'ispezione qualitativa della morfologia o sulla colorazione con coloranti e anticorpi specifici per le cellule staminali. Gli strumenti per analizzare la progressione della generazione di iPSC possono aiutare a comprendere meglio il processo in diverse condizioni da diverse fonti cellulari. 
Questo studio presenta approcci chiave per la misurazione cinetica della progressione della riprogrammazione utilizzando la citometria a flusso e il monitoraggio in tempo reale tramite imaging. Per misurare la cinetica della riprogrammazione, l'analisi del flusso è stata eseguita in punti temporali discreti utilizzando anticorpi contro marcatori di cellule staminali pluripotenti positive e negative. La combinazione di visualizzazione in tempo reale e analisi del flusso consente lo studio quantitativo della riprogrammazione in diverse fasi e fornisce un confronto più accurato di diversi sistemi e metodi. L'analisi in tempo reale basata su immagini è stata utilizzata per il monitoraggio continuo dei fibroblasti mentre vengono riprogrammati in un sistema di terreno privo di alimentatore. La cinetica di formazione delle colonie è stata misurata in base alla confluenza nei canali di contrasto di fase o di fluorescenza dopo la colorazione con colorante fosfatasi alcalina viva o anticorpi contro SSEA4 o TRA-1-60. I risultati hanno indicato che la misurazione della confluenza fornisce metriche semiquantitative per monitorare la progressione della riprogrammazione.

Monitoraggio Cinetica Riprogrammazione citometria a flusso CD44 è un marker fibroblasti mentre SSEA4 è un marker PSC 6,10. Come previsto da questo modello di espressione, citofluorimetria di fibroblasti BJ mostra un SSEA4 - CD44 + popolazione che facilita la creazione di cancelli quadranti in combinazione con il campione non colorato. Durante la riprogrammazione di fibroblasti DF1 con ...

Il protocollo presentato in questo studio descrive metodi per il monitoraggio in tempo reale di progressione riprogrammazione tramite la misurazione cinetica dei marcatori di cellule staminali pluripotenti positivi e negativi usando analisi citofluorimetrica. Il protocollo include anche la valutazione di imaging basata su morfologia, e pennarello o espressione giornalista durante la generazione IPSC.

Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

L'obiettivo generale di queste procedure è visualizzare e seguire il processo di riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo delle iPSC, come ad esempio in che modo la cinetica di riprogrammazione e l'efficienza di riprogrammazione vengono modificate dai tessuti somatici utilizzati, dalle tecnologie di riprogrammazione applicate e dalle combinazioni di matrice e mezzi di coltura impiegate. Il principale vantaggio di questo metodo è che utilizza marcatori di superficie cellulare per osservare le transizioni delle cellule somatiche verso le iPSC, consentendo di monitorare in tempo reale gli eventi di riprogrammazione.Al settimo giorno dopo la trasduzione, lavare i fibroblasti con due millilitri di DPBS per pozzetto e aggiungere 0,5 millilitri di EDTA 0,05% a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto, lasciando incubare per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono arrotondate, interrompere la reazione aggiungendo due millilitri di mezzo per fibroblasti a 37 gradi Celsius per pozzetto e pipettare delicatamente il mezzo lungo il fondo di ogni

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