Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica

L'obiettivo generale di queste procedure è quello di visualizzare e tracciare la progressione della riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel campo delle iPSC, come ad esempio il modo in cui la cinetica di riprogrammazione e l'efficienza di riprogrammazione sono alterate dai tessuti somatici utilizzati, dalle tecnologie di riprogrammazione applicate e dalle combinazioni di matrice e mezzi utilizzati con esso. Il vantaggio principale di questo metodo è che utilizza marcatori di superficie cellulare per osservare le transizioni delle cellule somatiche in iPSC in modo da poter utilizzare questa tecnologia per essere in grado di monitorare in tempo reale gli eventi di riprogrammazione.

Il settimo giorno dopo la trasduzione, lavare i fibroblasti con due millilitri di DPBS per pozzetto e aggiungere 0,5 millilitri di EDTA a 37 gradi Celsius 05% a ciascun pozzetto per un'incubazione da tre a cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono arrotondate, interrompere la reazione con due millilitri di terreno di coltura per fibroblasti a 37 gradi Celsius per pozzetto e pipettare delicatamente il terreno sul fondo di ciascun pozzetto per rimuovere le cellule. Trasferire i fibroblasti da ciascun pozzetto in singole provette coniche da 15 millilitri e raccoglierli mediante centrifugazione.

Risospendere i pellet in due millilitri di terreno fresco per fibroblasti a 37 gradi Celsius e contare le cellule di ciascuna condizione di coltura. Successivamente, seminare una volta da 10 a 5 cellule in pozzetti condizionati pre-preparati e indipendenti dall'alimentatore in una piastra di coltura tissutale a sei pozzetti e incubare le cellule trasdotte nell'incubatore di coltura cellulare durante la notte. Il giorno successivo, sostituire il terreno in ciascun pozzetto con il terreno appropriato per l'applicazione in cella.

Quindi posizionare la piastra nell'imager e impostare il software per acquisire immagini continue a contrasto di fase a pozzetto intero e fluorescenti per ciascun pozzetto ogni sei-otto ore per i successivi 14 giorni. Al termine dell'esperimento di riprogrammazione, lavare i pozzetti una volta con due millilitri di terreno DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Scartare il lavaggio ed etichettare le cellule con un millilitro per pozzetto degli anticorpi primari appropriati in terreno DMEM/F12 fresco per 45 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con terreno DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Quindi scartare il lavaggio ed etichettare le cellule con un millilitro di anticorpi secondari appropriati in terreno DMEM/F12 a 37 gradi Celsius per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule altre due volte con terreno DMEM/F12.

Quindi sostituire il lavaggio in ogni pozzetto con due millilitri di terreno fresco DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Posizionare la parabola nella termocamera e aprire il software di imaging. Per impostare le scansioni sul software del sistema di imaging, selezionare prima la posizione del vassoio da utilizzare e selezionare il tipo di piatto da scansionare.

Quindi, selezionare Whole Well Imaging, il modello per la scansione dei pozzetti desiderati e i canali fluorescenti appropriati per l'identificazione in tempo reale dei marcatori di superficie di interesse. Quindi etichettare l'esperimento da scansionare e impostare i punti temporali e gli intervalli per i campioni da scansionare ogni giorno. Per analizzare un set di esperimenti analizzati, selezionare l'esperimento di interesse e selezionare Avvia nuovo processo di analisi.

Quindi selezionare la definizione di elaborazione appropriata per il tipo di analisi in base ai canali utilizzati per l'imaging, ad esempio PSC Phase Colony Count. Assegna un nome al processo di analisi. E selezionare l'intervallo di tempo per l'analisi e i pozzetti da analizzare.

Avviare quindi il processo di analisi. Per misurare i punti temporali di riprogrammazione desiderati dai singoli pozzetti, lavare una volta il pozzetto di interesse con due millilitri di DPBS. Quindi sostituire il lavaggio con un millilitro di soluzione preriscaldata a 37 gradi Celsius 05%tripsina-EDTA.

Dopo cinque minuti di 37 gradi Celsius, sciacquare la tripsina contro il fondo del pozzetto per dissociare le cellule in una sospensione a cellula singola e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Usando tre millilitri di DPBS, lavare le cellule rimanenti dal pozzetto e immergerle nella provetta da 15 millilitri. Aggiungere altri 10 millilitri di DPBS alle cellule e centrifugarle.

Risospendere il pellet in un millilitro di terreno DMEM/F12 per il conteggio. Quindi diluire la sospensione cellulare a una volta il decimo delle sei cellule per millilitro di concentrazione e aliquotare un millilitro di cellule per provetta per il numero appropriato di campioni. Successivamente, etichettare le cellule con gli anticorpi primari di interesse in un millilitro di terreno DMEM/F12 per 30-45 minuti a temperatura ambiente mescolando.

Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in terreno DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Risospendere i pellet in un millilitro di DPBS e trasferire i campioni in singole provette FACS. Acquisire i profili di citometria a flusso delle piastre riprogrammate.

Quindi trasferisci i file FCS su un computer e importa i file nel software di analisi appropriato. Aprire il primo file di controllo in un grafico a dispersione forward by side e impostare l'asse y su una scala logaritmica. Quindi crea un cancello poligonale attorno alla popolazione viva.

Quindi, crea un grafico dell'area di dispersione laterale per altezza di dispersione con le celle attive e imposta un cancello rettangolare per escludere i doppietti. Quindi utilizzare questi cancelli per analizzare i file di campioni sperimentali sotto i canali fluorescenti appropriati per identificare le popolazioni di interesse nei rispettivi quadranti. La riprogrammazione dei fibroblasti BJ con i virus di riprogrammazione Sendai genera cellule SSEA4+CD44 a una velocità diversa rispetto alla riprogrammazione dei fibroblasti DF1, dimostrando che un confronto precoce della percentuale di cellule SSEA4+CD44 pluripotenti simili alle cellule staminali può essere utilizzato per tracciare la progressione della riprogrammazione.

In un decorso temporale della citometria a flusso, i fibroblasti CD24-CD44+ ed EpCAM negativi CD44+ formano popolazioni doppie negative che successivamente passano rispettivamente a cellule staminali pluripotenti CD24+CD44 ed EpCAM positive CD44, delineando ulteriormente la progressione della riprogrammazione. L'imaging in tempo reale delle colture di riprogrammazione dopo la risemina dimostra una graduale formazione di colonie corrispondente a un aumento logaritmico della loro confluenza e dimostra l'espressione finale del marcatore pluripotente positivo e del marcatore negativo dei fibroblasti al completamento della riprogrammazione. Inoltre, l'utilizzo di un gene reporter consente di misurare la confluenza in contrasto di fase con un aumento più graduale della confluenza GFP osservata rispetto alla confluenza totale.

Infatti, in questo esperimento rappresentativo, la confluenza GFP al giorno 19 era meno della metà della confluenza totale corrispondente alla riprogrammazione completa. Una volta padroneggiata, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per chiarire le informazioni sugli eventi di riprogrammazione e tracciare la cinetica della riprogrammazione dei fibroblasti umani. Questa tecnica potrebbe anche essere utilizzata per esaminare diversi tessuti di cellule somatiche iniziali, le tecnologie di riprogrammazione utilizzate e le combinazioni di matrici medie per chiarire gli eventi di riprogrammazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il monitoraggio in tempo reale e l'espressione dei marcatori della superficie cellulare, per essere in grado di tracciare la riprogrammazione dei fibroblasti umani in iPSC.