Cinetica Misurazione e Tempo reale visualizzazione della riprogrammazione somatica
30 luglio 2016
Il protocollo presentato in questo studio descrive metodi per il monitoraggio in tempo reale di progressione riprogrammazione tramite la misurazione cinetica dei marcatori di cellule staminali pluripotenti positivi e negativi usando analisi citofluorimetrica. Il protocollo include anche la valutazione di imaging basata su morfologia, e pennarello o espressione giornalista durante la generazione IPSC.
L'obiettivo generale di queste procedure è visualizzare e seguire il processo di riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande fondamentali nel campo delle iPSC, come ad esempio in che modo la cinetica di riprogrammazione e l'efficienza di riprogrammazione vengono modificate dai tessuti somatici utilizzati, dalle tecnologie di riprogrammazione applicate e dalle combinazioni di matrice e mezzi di coltura impiegate. Il principale vantaggio di questo metodo è che utilizza marcatori di superficie cellulare per osservare le transizioni delle cellule somatiche verso le iPSC, consentendo di monitorare in tempo reale gli eventi di riprogrammazione.
Al settimo giorno dopo la trasduzione, lavare i fibroblasti con due millilitri di DPBS per pozzetto e aggiungere 0,5 millilitri di EDTA 0,05% a 37 gradi Celsius in ogni pozzetto, lasciando incubare per tre-cinque minuti a 37 gradi Celsius. Quando le cellule si sono arrotondate, interrompere la reazione aggiungendo due millilitri di mezzo per fibroblasti a 37 gradi Celsius per pozzetto e pipettare delicatamente il mezzo lungo il fondo di ogni pozzetto per staccare le cellule. Trasferire i fibroblasti da ogni pozzetto in provette coniche individuali da 15 millilitri e raccoglierli mediante centrifugazione.
Risospendere i pellet in due millilitri di mezzo per fibroblasti fresco a 37 gradi Celsius ed eseguire il conteggio delle cellule per ciascuna condizione di coltura. Successivamente, seminare 1 × 10⁵ cellule in pozzetti condizionati, pronti all'uso e indipendenti da cellule nutrici, all'interno di una piastra per colture cellulari a sei pozzetti e incubare le cellule transdotte nell'incubatore per colture cellulari durante la notte. Il giorno seguente, sostituire il mezzo in ciascun pozzetto con il mezzo appropriato per l'applicazione cellulare.
Quindi posizionare la piastra nell'imager e impostare il software per acquisire immagini in contrasto di fase e immagini fluorescenti a tutto pozzo in modo continuo, ogni sei-otto ore per ciascun pozzo, per i successivi 14 giorni. Al termine dell'esperimento di riprogrammazione, lavare i pozzi una volta con due millilitri di mezzo DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Rimuovere il lavaggio ed etichettare le cellule con un millilitro per pozzo degli opportuni anticorpi primari in mezzo DMEM/F12 fresco per 45 minuti a 37 gradi Celsius nell'incubatore.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte con mezzo DMEM/F12 a 37 gradi celsius. Quindi eliminare il liquido di lavaggio e incubare le cellule con un millilitro degli opportuni anticorpi secondari in mezzo DMEM/F12 a 37 gradi celsius per 30 minuti a 37 gradi celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule altre due volte con mezzo DMEM/F12.
Quindi sostituire la soluzione di lavaggio in ciascun pozzetto con due millilitri di mezzo DMEM/F12 fresco a 37 gradi celsius. Posizionare la piastra nell'apparecchio di imaging e aprire il software di acquisizione immagini. Per configurare le scansioni nel software del sistema di imaging, selezionare innanzitutto la posizione del vassoio da utilizzare e quindi il tipo di piastra da scansionare.
Successivamente, selezionare l'acquisizione dell'intero pozzetto, il modello per la scansione dei pozzetti desiderati e i canali fluorescenti appropriati per l'identificazione in tempo reale dei marcatori di superficie di interesse. Quindi etichettare l'esperimento da scansionare e impostare i punti temporali e gli intervalli per cui i campioni devono essere scansionati ogni giorno. Per analizzare un insieme di esperimenti scansionati, selezionare l'esperimento di interesse e scegliere Avvia nuovo processo di analisi.
Quindi selezionare la definizione di elaborazione appropriata per il tipo di analisi in base ai canali utilizzati per l'acquisizione delle immagini, ad esempio PSC Phase Colony Count. Assegnare un nome al processo di analisi. Selezionare quindi l'intervallo temporale per l'analisi e le pozzette da analizzare.
Quindi avviare il lavoro di analisi. Per misurare i punti temporali desiderati di riprogrammazione da singole pozzette, lavare la pozzetta di interesse una volta con due millilitri di DPBS. Sostituire quindi il lavaggio con un millilitro di soluzione di tripsina-EDTA 0,5% pre-riscaldata a 37 gradi Celsius.
Dopo cinque minuti a 37 gradi Celsius, lavare la tripsina contro il fondo della pozzetta per dissociare le cellule in una sospensione di singole cellule e trasferire le cellule in un tubo conico da 15 millilitri. Utilizzando tre millilitri di DPBS, lavare le eventuali cellule rimanenti dalla pozzetta e raccoglierle nel tubo da 15 millilitri. Aggiungere ulteriori 10 millilitri di DPBS alle cellule e centrifugare per raccoglierle sul fondo.
Risospendere il pellet in un millilitro di mezzo DMEM/F12 per il conteggio. Successivamente, diluire la sospensione cellulare a una concentrazione di sei cellule per millilitro pari a un decimo e aliquotare un millilitro di cellule per tubo, per il numero appropriato di campioni. Quindi, etichettare le cellule con gli anticorpi primari di interesse in un millilitro di mezzo DMEM/F12 per 30-45 minuti a temperatura ambiente, con mescolamento.
Al termine dell'incubazione, lavare le cellule due volte in mezzo DMEM/F12 a 37 gradi Celsius. Risospendere i pellet in un millilitro di DPBS e trasferire i campioni in provette FACS singole. Acquisire i profili di citometria a flusso delle piastre riprogrammate.
Quindi trasferire i file FCS su un computer e importarli nel software di analisi appropriato. Aprire il primo file di controllo in un grafico di dispersione anteriore rispetto alla dispersione laterale e impostare l'asse y su scala logaritmica. Creare quindi una finestra poligonale intorno alla popolazione vitale.
Successivamente, creare un grafico dell'area della scatterizzazione laterale in funzione dell'altezza della scatterizzazione con le cellule vitali e impostare una finestra rettangolare per escludere i doppietti. Utilizzare quindi queste finestre per analizzare i file dei campioni sperimentali nei rispettivi canali fluorescenti al fine di identificare le popolazioni di interesse nei quadranti corrispondenti. La riprogrammazione dei fibroblasti BJ mediante virus di riprogrammazione Sendai genera cellule SSEA4+CD44- a un tasso diverso rispetto alla riprogrammazione dei fibroblasti DF1, dimostrando che un confronto precoce della percentuale di cellule staminali pluripotenti di tipo SSEA4+CD44- può essere utilizzato per monitorare il progresso della riprogrammazione.
In un'analisi cinetica mediante citometria a flusso, i fibroblasti CD24-CD44+ e negativi per EpCAM CD44+ formano popolazioni doppio negative che successivamente si trasformano rispettivamente in cellule simili a cellule staminali pluripotenti CD24+CD44- e positive per EpCAM CD44-, delineando ulteriormente il processo di riprogrammazione. L'analisi in tempo reale delle colture riprogrammate dopo il reseeding dimostra una formazione graduale di colonie corrispondente a un aumento logaritmico della loro confluenza e mostra l'espressione finale dei marcatori positivi per la pluripotenza e negativi per i fibroblasti al termine della riprogrammazione. Inoltre, l'uso di un gene reporter consente di misurare la confluenza in contrasto di fase, osservando un aumento più graduale della confluenza GFP rispetto alla confluenza totale.
In effetti, in questo esperimento rappresentativo, la confluenza di GFP al giorno 19 era inferiore alla metà della confluenza totale corrispondente al completo riprogrammamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica potrebbe essere utilizzata per chiarire informazioni sugli eventi di riprogrammazione e per tracciare la cinetica del riprogrammamento dei fibroblasti umani. Questa tecnica potrebbe inoltre essere impiegata per analizzare diversi tessuti somatici di partenza, le tecnologie di riprogrammazione utilizzate e le combinazioni di matrici di mezzo al fine di chiarire gli eventi di riprogrammazione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il monitoraggio in tempo reale e l'espressione dei marcatori della superficie cellulare per seguire la riprogrammazione di fibroblasti umani in iPSC.
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per il monitoraggio in tempo reale della riprogrammazione delle cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) mediante citometria a flusso. Si concentra sulla misurazione cinetica dei marcatori delle cellule staminali pluripotenti e sulle valutazioni basate sull'imaging durante la generazione di iPSC.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Riprogrammazione cellulare
- Citometria a flusso
Sfondo
- Comprendere la generazione di iPSC è fondamentale per la medicina rigenerativa.
- La cinetica del riprogrammamento può variare in base ai tessuti somatici e alle tecnologie utilizzate.
- Il monitoraggio dei marcatori di superficie cellulare aiuta a seguire le transizioni del riprogrammamento.
- L'analisi in tempo reale migliora la comprensione dell'efficienza del riprogrammamento.
Scopo dello studio
- Visualizzare e seguire l'evoluzione della riprogrammazione delle cellule somatiche.
- Valutare come diversi fattori influenzino la cinetica della riprogrammazione.
- Fornire un metodo affidabile per monitorare in tempo reale la generazione di iPSC.
Metodi Utilizzati
- Citometria a flusso per la misurazione cinetica dei marcatori pluripotenti.
- Valutazione basata sull'imaging della morfologia cellulare e dell'espressione dei marcatori.
- Analisi dei marcatori della superficie cellulare per monitorare le transizioni durante il riprogrammazione.
- Protocolli dettagliati per la manipolazione e l'analisi dei fibroblasti.
Risultati principali
- È stato raggiunto un monitoraggio in tempo reale riuscito della generazione di iPSC.
- Sono state osservate variazioni nelle efficienze di riprogrammazione in base ai tessuti somatici.
- La citometria a flusso ha permesso di tracciare efficacemente l'espressione dei marcatori di pluripotenza.
- L'analisi mediante imaging ha fornito informazioni sui cambiamenti morfologici durante il processo di riprogrammazione.
Conclusioni
- Il protocollo offre un metodo robusto per lo studio della riprogrammazione delle iPSC.
- Il monitoraggio in tempo reale può migliorare significativamente la ricerca in biologia delle cellule staminali.
- Comprendere la cinetica della riprogrammazione è fondamentale per migliorare le tecnologie basate sulle iPSC.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione cinetica in tempo reale della riprogrammazione somatica consente alla ricerca e sviluppo biofarmaceutica di valutare quantitativamente l'efficienza di generazione di iPSC provenienti da diverse fonti cellulari e tecnologie di riprogrammazione. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico fornendo un livello predittivo di confidenza sui risultati della riprogrammazione, orientando le decisioni strategiche nello sviluppo di terapie cellulari. Il metodo migliora la continuità traslazionale collegando parametri quantitativi dell'individuazione precoce alla validazione preclinica attraverso letture standardizzate e riproducibili.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche monitorando le popolazioni SSEA4+CD44- e CD24+CD44- come indicatori quantitativi di transizioni simili a quelle delle cellule staminali pluripotenti.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante l'isolamento, tramite citometria a flusso, di variabili indipendenti quali il tipo di cellula somatica e la tecnologia di riprogrammazione.
- Valore predittivo: Facilita l'identificazione di candidati promettenti confrontando la cinetica di riprogrammazione tra diverse matrici e combinazioni di mezzi, al fine di selezionare i sistemi ad alta efficienza.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi, stabilendo metriche semi-quantitative basate sulla confluenza nei canali a contrasto di fase o in fluorescenza.
- Riproducibilità: Affronta la standardizzazione dei saggi mediante imaging in tempo reale della formazione di colonie e analisi cinetiche in citometria a flusso che escludono i doppietti e selezionano le popolazioni vitali.
- Scalabilità dello screening: Evidenzia il riutilizzo della piattaforma consentendo un imaging continuo dell'intero pozzetto ogni sei-otto ore per un periodo di 14 giorni, finalizzato all'analisi cinetica longitudinale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Discute la rilevanza per le malattie permettendo il confronto del progresso del riprogrammamento attraverso diversi background genetici e fenotipi patologici.
- Allineamento preclinico: Descrive la continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica misurando l'espressione finale dei marcatori positivi per le cellule pluripotenti e negativi per i fibroblasti al termine del riprogrammamento.
- Decisioni basate sul rischio: Affronta le decisioni di avanzamento utilizzando le correlazioni tra espressione del gene reporter e confluenza per distinguere un riprogrammamento parziale da uno completo, come osservato quando la confluenza di GFP era inferiore alla metà della confluenza totale al giorno 19.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi all'identificazione del composto attivo fino al lavoro preclinico, fornendo dati quantitativi e risolti nel tempo sull'evoluzione del riprogrammamento.
- Biologia della scoperta: Spiega come il metodo supporti la verifica delle ipotesi, la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici consentendo un confronto precoce delle percentuali di SSEA4+CD44- tra diversi tipi cellulari, come i fibroblasti BJ e DF1.
- Screening: Descrive la prontezza del saggio, la riproducibilità e gli output quantitativi mediante analisi di citometria a flusso di sospensioni cellulari singole e vitali e misurazioni dell'impendenza basate sull'immagine.
- Analisi: Evidenzia le misurazioni, i risultati e gli output statistici, inclusa la percentuale di cellule positive ai marcatori di pluripotenza, la cinetica dell'impendenza e l'esclusione dei doppietti tramite grafici dell'area della diffusione laterale rispetto all'altezza della diffusione.
- Ricerca traslazionale: Collega il metodo alla continuità preclinica monitorando i cambiamenti morfologici e l'espressione dei marcatori durante la transizione dai fibroblasti agli iPSC, favorendo l'allineamento dei biomarcatori mediante colorazione per SSEA4 e TRA-1-60.
- Riutilizzo aziendale: Presenta il metodo come una capacità riutilizzabile piuttosto che una tecnica monouso, applicabile a diversi tessuti cellulari somatici di partenza, tecnologie di riprogrammazione e combinazioni di matrici di mezzo.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva, validazione degli obiettivi, riduzione dell'ambiguità meccanicistica nelle traiettorie di riprogrammazione.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità delle misurazioni cinetiche tra diversi laboratori e linee cellulari.
- Valore strategico: Decisioni più accurate su prosegui/non prosegui, efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fase avanzata nello sviluppo di terapie basate su iPSC.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate sull'efficienza quantitativa di riprogrammazione e sui profili cinetici.
Considerazioni sull'implementazione
- Competenze scientifiche richieste in citometria a flusso, immunofluorescenza e imaging su cellule vive.
- Necessità di strumentazione e infrastrutture analitiche, inclusi incubatori, sistemi di imaging con scansione dell'intera pozzetta e citometri a flusso compatibili con FACS.
- Requisiti di standardizzazione tra gruppi di lavoro per pannelli anticorpali, strategie di gating e protocolli di analisi delle immagini.
- Considerazioni sull'adattamento tra diversi sistemi modello, come fonti variabili di fibroblasti e vettori di riprogrammazione.
- Limitazioni pratiche, tra cui la necessità di una titolazione accurata della tripsina-EDTA per evitare danni cellulari durante la dissociazione e la natura semi-quantitativa delle metriche basate sulla confluenza.
