Rilevamento di RNA-binding proteins by

L'obiettivo generale di questo esperimento è recuperare le proteine leganti l'RNA di un trascritto di RNA dal tessuto adiposo bruno. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in questo campo, come ad esempio quali sono i meccanismi regolatori degli RNA codificanti a lunga vita e delle proteine RNA associate. Il vantaggio principale di questa strategia è che è facile da eseguire.

L'RNA utilizzato per dimostrare questa procedura è un frammento della Regione non tradotta 3'-terminale del Recettore dell'Antigene, indicata in seguito come UTR 3'-terminale dell'AR. Iniziare amplificando l'oligonucleotide T7 AR e la sequenza parziale del DNA della luciferasi della lucciola dal plasmide psiCHECK-2. I primer e i parametri utilizzati sono descritti nel documento allegato.

Dopo l'amplificazione, utilizzare i prodotti PCR come stampi per sintetizzare RNA biotinilati mediante un kit di trascrizione in vitro, seguendo le istruzioni del produttore. Incubare quindi la miscela a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo la trascrizione in vitro, aggiungere un microlitro di Dnasi alla reazione e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti per degradare il DNA stampo.

Quindi, portare il volume finale a 60 microlitri aggiungendo acqua. Applicare gli RNA biotinilati su colonne di purificazione per rimuovere il sale e i nucleotidi non incorporati. Successivamente, dopo aver misurato la concentrazione di RNA, conservare l'RNase a -80 gradi Celsius per successivi saggi di pull-down.

Nel giorno del saggio, scongelare l'RNA biotinilato congelato sul ghiaccio. Successivamente, per assicurare che l'RNA di interesse abbia la corretta struttura secondaria, riscaldare 50 microlitri di esso a 90 gradi Celsius per due minuti. Raffreddare sul ghiaccio per due minuti.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri di buffer 2X per la struttura dell'RNA e lasciare ripiegare l'RNA a temperatura ambiente per 30 minuti. Poi, risospendere le microsferette magnetiche ricoperte di streptavidina nel loro flacone originale agitandole brevemente mediante vortex. Quindi, trasferire 150 microlitri delle microsferette risospese in una provetta da 1,5 millilitri.

Posizionare il tubo su un supporto magnetico per un minuto per separare le perle magnetiche dal soprannadante. Utilizzare una pipetta per rimuovere e scartare il soprannadante. Conservare il pellet di perle.

Lavare le perle una volta risospendendo il pellet di perle in un millilitro del tampone di legame e lavaggio 1X raccomandato dal produttore, quindi posizionare il tubo su un rotatore per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare con il tampone A e il tampone B due volte. Al termine dell'incubazione, eliminare il soprannatante e conservare il pellet di perle.

Successivamente, risospendere il pellet di perle in 300 microlitri di tampone di lavaggio e legame 2X. Suddividere le perle equamente in tre provette da 1,5 millilitri, con 100 microlitri di perle per provetta. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di RNasi, 100 microlitri di RNA di luciferasi di lucciola biotinilata e 100 microlitri di RNA del 3'-UTR di AR biotinilato.

Incubare ogni miscela di perle per un'ora a temperatura ambiente con rotazione. Successivamente, posizionare i tubi sul magnete per un minuto. Rimuovere e scartare il soprannatante.

Mantenere i pellet di perle. Successivamente, lavare le perle due volte, risospendendo ogni volta i pellet di perle con 400 microlitri di tampone di lavaggio e legame 1X, quindi posizionarli sul rotatore per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare le provette su un magnete per un minuto.

Quindi, rimuovere e scartare tutto il soprannatante. Risospendere ogni pellet di perline in 50 microlitri di buffer per l'isolamento nucleare. In previsione della fase successiva del protocollo, assicurarsi che tutti i buffer, così come gli omogeneizzatori in vetro dounce, siano raffreddati sul ghiaccio.

La preparazione del lisato cellulare deve essere eseguita sul ghiaccio. Per ogni saggio di pull-down dell'RNA da eseguire, preparare una piastra da 15 centimetri di preadipociti differenziati provenienti da topi selvatici C57 Black Six di tre settimane. Quattro o cinque giorni dopo, per raccogliere le cellule, aggiungere da 10 a 15 millilitri di PBF e quindi utilizzare un raschietto per cellule per rimuovere le cellule dalla piastra.

Trasferirli in un tubo da 50 millilitri e quindi formare il pellet mediante centrifugazione a 200 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare e scartare il soprannatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone ipotonico e incubare le cellule sul ghiaccio per quindici minuti.

Trasferire le cellule in un omogeneizzatore di Dounce da 15 millilitri e frammentare le cellule meccanicamente in ghiaccio con 20 passaggi. Pellettare i nuclei cellulari mediante centrifugazione a 3300 × g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, trasferire il soprannatante in provette da 1,5 millilitri e mantenere il pellet in ghiaccio per un uso successivo.

Al soprannatante, aggiungere cloruro di potassio 3-molare per ottenere una concentrazione finale di 150 millimolare. Centrifugare a 20.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, si formerà uno strato lipidico in superficie.

Usare una pipetta da un millilitro per rimuoverlo con attenzione. Quindi, raccogliere il sopranatante del lisato cellulare citoplasmatico. Successivamente, utilizzando una pipetta da un millilitro, risospendere il pellet di nuclei in un millilitro di buffer per l'isolamento nucleare e trasferire in un omogeneizzatore in vetro Dounce da 15 millilitri.

Sottoporre meccanicamente i nuclei a taglio sul ghiaccio con 100 passaggi. Pellettizzare i detriti nucleari mediante centrifugazione a 20.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il soprannatante come lisato cellulare nucleare.

Questi possono essere combinati con il lisato citoplasmatico raccolto in precedenza o mantenuti separati per applicazioni successive. In questo caso, i campioni vengono combinati in un rapporto uno a uno. Aggiungere l'inibitore della RNasi al lisato cellulare non frazionato per ottenere una concentrazione finale di 0,5 unità per microlitro.

Successivamente, mettere da parte 100 microlitri del lisato cellulare su ghiaccio come controllo di input per il western blot. Suddividere il lisato cellulare in tre aliquote uguali, con un millilitro di lisato cellulare in ciascun tubo da 1,5 millilitri, e incubare rispettivamente con perle coniugate a RNA di luciferasi di fuoco vuote e perle coniugate alla regione UTR 3'-terminale di AR, per tre ore a quattro gradi Celsius con rotazione. Al termine dell'incubazione, posizionare i tubi sul magnete per un minuto.

Utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere il sopranatante, quindi isolare l'RNA e valutarne l'integrità come descritto nel documento allegato. Mantenere i pellet di perline sul ghiaccio. Lavare le perline magnetiche sei volte.

Ogni volta, risospendere i pellet di perle in un millilitro di buffer di isolamento nucleare contenente 40 unità di inibitore della RNasi e igepal allo 0,25 percento. Ruotare i tubi per due minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in un supporto magnetico per separare le perle magnetiche dal soprannatante.

Dopo un minuto, aspirare e scartare il soprannatante, quindi posizionare i pellet di perline sul ghiaccio. Per eluire i complessi RNA-proteina dalle perline per il western blot, risospendere innanzitutto ogni pellet di perline in 75 microlitri di buffer per l'isolamento nucleare. Successivamente, aggiungere 25 microlitri di buffer di caricamento per western blot 4X.

contenente SDS, per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Infine, far bollire le perle in questa soluzione di 100 microlitri a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire la western blot per la verifica dell'RBP come descritto nel documento allegato.

In questo esperimento, un frammento di RNA recettore dell'antigene è stato utilizzato come esca per catturare la sua proteina legante, HuR. Sono stati utilizzati come controlli negativi sia un'esca di RNA della luciferasi della lucciola non correlata alla proteina HuR sia un'aliquote di perle di streptavidina vuote e non coniugate. Le interazioni tra RNA e proteine possono avvenire nel nucleo o nel citoplasma, e questo protocollo di pull-down può essere applicato a lisati cellulari totali o frazionati, nucleari o citoplasmatici.

L'analisi mediante western blotting ha mostrato la proteina HuR nel lisato cellulare non frazionato, o input, utilizzando l'anticorpo monoclonale. Anche la frazione di eluizione dell'RNA del recettore dell'antigene ha dato un risultato positivo, indicando la presenza della proteina HuR nel lisato di adipociti mediante l'utilizzo di microsferette coniugate con RNA del recettore dell'antigene per il saggio di pull-down dell'RNA. Sia la frazione di eluizione dell'RNA della luciferasi della lucciola sia il campione di microsferette vuote hanno dato risultati negativi, indicando che interazioni non specifiche non erano rilevabili con questo approccio.

Nel complesso, questi risultati indicano che l'interazione tra il frammento di RNA del recettore per l'antigene e la proteina HuR era specifica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione del metodo per recuperare le proteine leganti l'RNA da un trascritto di RNA del tessuto adiposo bruno. Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in 24 ore, se eseguita correttamente.