Rilevamento di RNA-binding proteins by In Vitro RNA a tendina nella cultura degli adipociti

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di recuperare proteine leganti l'RNA di un trascritto di RNA dal tessuto adiposo bruno. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in questo campo, come ad esempio, quali sono i meccanismi regolatori dell'RNA codificante a lunga vita e delle proteine RNA associate. Il vantaggio principale di questa tattica è che è facile da eseguire.

L'RNA utilizzato per dimostrare questa procedura è un frammento della regione non tradotta del recettore dell'antigene 3-Prime, di seguito indicato come UTR AR 3-Prime. Inizia amplificando l'oligo AR T7 e la sequenza parziale del DNA della luciferasi della lucciola dal plasmide psiCHECK-2. Gli inneschi e i parametri utilizzati sono descritti in dettaglio nel documento di accompagnamento.

Dopo l'amplificazione, utilizzare i prodotti PCR come modelli per sintetizzare RNA biotinilati utilizzando un kit di trascrizione in vitro, seguendo le istruzioni del produttore. Quindi, incubare la miscela a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo la trascrizione in vitro, aggiungere un microlitro di Dnase alla reazione e incubarlo a 37 gradi Celsius per 15 minuti per degradare il DNA stampo.

Quindi, portare il volume totale fino a 60 microlitri con acqua. Applicare gli RNA biotinilati alle colonne di purificazione per rimuovere il sale e i nucleotidi non incorporati. Quindi, dopo aver misurato la concentrazione di RNA, conservare l'RNasi a meno 80 gradi Celsius per i successivi saggi di pull-down.

Il giorno del test, scongelare l'RNA biotinilato congelato su ghiaccio. Quindi, per garantire che l'RNA di interesse abbia la struttura secondaria corretta, riscaldarne 50 microlitri a 90 gradi Celsius per due minuti. Raffreddare con ghiaccio per due minuti.

Quindi, aggiungi 50 microlitri di tampone per la struttura dell'RNA 2X e lascia che l'RNA si pieghi a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, risospendere le perle magnetiche rivestite di streptavidina nella loro fiala originale facendole roteare brevemente. Quindi, trasferire 150 microlitri di perle risospese in un tubo da 1,5 millilitri.

Posizionare il tubo in un supporto magnetico per un minuto per separare le perle magnetiche e il surnatante. Utilizzare una pipetta per rimuovere ed eliminare il surnatante. Conservare il pellet di perline.

Lavare le perle una volta rimettendo in sospensione il pellet di perline in un millilitro del tampone di legatura e lavaggio 1X raccomandato dal produttore, quindi posizionare il tubo su un rotatore per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare due volte con il tampone A e il tampone B. Dopo l'incubazione, scartare il surnatante e conservare il pellet di perline.

Quindi, risospendere il pellet di perline in 300 microlitri di tampone di lavaggio e legatura 2X. Dividi le perle in modo uniforme in tre tubi da 1,5 millilitri con 100 microlitri di perline per tubo. Aggiungere 100 microlitri di acqua priva di RNasi, 100 microlitri di RNA luciferasi biotinilato della lucciola e 100 microlitri di RNA biotinilato AR 3-Prime UTR.

Incubare ogni miscela di perle per un'ora a temperatura ambiente con rotazione. Quindi, posiziona i tubi sul magnete per un minuto. Rimuovere ed eliminare il surnatante.

Conserva i pellet di perline. Successivamente, lavare le perline due volte, ogni volta rimettendo in sospensione i pellet di perline con 400 microlitri di tampone di lavaggio e legatura 1X, quindi posizionandoli sul rotatore per cinque minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi su un magnete per un minuto.

Quindi, rimuovere ed eliminare tutto il surnatante. Risospendere ogni pellet di perlina in 50 microlitri di tampone di isolamento nucleare. In preparazione per la parte successiva del protocollo, assicurarsi che tutti i tamponi, così come gli omogeneizzatori in vetro dounce, siano raffreddati con ghiaccio.

La preparazione del lisato cellulare deve procedere con ghiaccio. Per ogni test di pull-down dell'RNA da eseguire, preparare una piastra di 15 centimetri di preadipociti differenziati da topi wild type C57 Black Six di tre settimane. Quattro o cinque giorni dopo, per raccogliere le cellule, aggiungere da 10 a 15 millilitri di PBF e quindi utilizzare un raschietto cellulare per rimuovere le cellule dal piatto.

Trasferitele in una provetta da 50 millilitri e poi pellettatele per centrifugazione a 200 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo la centrifuga, utilizzare una pipetta da un millilitro per aspirare e scartare il surnatante. Quindi, risospendere il pellet cellulare in due millilitri di tampone ipotonico e incubare le cellule su ghiaccio per quindici minuti.

Trasferire le cellule in un omogeneizzatore di vetro da 15 millilitri e tagliare meccanicamente le cellule sul ghiaccio con 20 colpi. Pellettare i nuclei cellulari mediante centrifugazione a 3300 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, trasferire il surnatante in tubi da 1,5 millilitri e conservare il pellet sul ghiaccio per un uso successivo.

Al surnatante, aggiungere cloruro di potassio a 3 molari per ottenere una concentrazione finale di 150 millimolari. Centrifugare a 20.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, ci sarà uno strato lipidico sulla parte superiore.

Utilizzare una pipetta da un millilitro per rimuoverlo con cura. Quindi, raccogliere il surnatante del lisato cellulare citoplasmatico. Successivamente, utilizzando una pipetta da un millilitro, risospendere il pellet di nuclei in un millilitro di tampone di isolamento nucleare e trasferirlo in un omogeneizzatore di vetro da 15 millilitri.

Tranciare meccanicamente i nuclei sul ghiaccio con 100 colpi. Pellettare i detriti nucleari mediante centrifugazione a 20.000 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogli il surnatante come lisato cellulare nucleare.

Questi possono essere combinati con il lisato citoplasmatico raccolto in precedenza o tenuti separati per applicazioni successive. In questo caso, i campioni vengono combinati con un rapporto di uno a uno. Aggiungere l'inibitore della RNasi al lisato cellulare non frazionato per ottenere una concentrazione finale di 0,5 unità per microlitro.

Quindi, mettere da parte 100 microlitri di lisato cellulare su ghiaccio come controllo di input per il western blotting. Dividere il lisato cellulare in tre aliquote uguali con un millilitro di lisato cellulare in ciascuna provetta da 1,5 millilitri e incubare con perle coniugate con RNA luciferasi di lucciola bianca e AR 3-Prime UTR coniugate, rispettivamente, per tre ore a quattro gradi Celsius con rotazione. Dopo l'incubazione, posizionare le provette sul magnete per un minuto.

Utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere il surnatante, quindi isolare l'RNA e valutare l'integrità dell'RNA come descritto nel documento di accompagnamento. Mantieni i pellet di perline sul ghiaccio. Lavare le perline magnetiche sei volte.

Ogni volta, risospendere i pellet di perline in un millilitro di tampone di isolamento nucleare contenente 40 unità di inibitore della RNasi e lo 0,25% di igepal. Ruotare i tubi per due minuti a temperatura ambiente. Posizionare i tubi in un supporto magnetico per separare le perle magnetiche e il surnatante.

Dopo un minuto, aspirare e scartare il surnatante, quindi posizionare i pellet di perline sul ghiaccio. Per eluire i complessi proteici dell'RNA dalle perle per il western blotting, in primo luogo, risospendere ogni pellet di perlina in 75 microlitri di tampone di isolamento nucleare. Quindi, aggiungere 25 microlitri di tampone di caricamento western blot 4X.

contenente SDS, per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Infine, fai bollire le perle in questa soluzione da 100 microlitri a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Eseguire il western blotting per la verifica dell'RBP come descritto nel documento di accompagnamento.

In questo esperimento, un frammento di RNA del recettore dell'antigene è stato utilizzato come esca per catturare la sua proteina legante, HuR. Sia un'esca per RNA luciferasi lucciola non correlata alla proteina HuR che un'aliquota di perle di streptavidina bianche non coniugate sono servite come controlli negativi. Le interazioni tra le proteine dell'RNA possono verificarsi sia nel nucleo che nel citoplasma e questo protocollo di pull-down può essere applicato a lisati cellulari nucleari o citoplasmatici totali o frazionati.

L'analisi mediante western blotting ha mostrato la proteina HuR nel lisato cellulare non frazionato, o input, utilizzando l'anticorpo monoclonale. Anche la frazione di elusione dell'RNA del recettore dell'antigene ha dato un risultato positivo, indicando la presenza della proteina HuR nel lisato degli adipociti utilizzando le perle coniugate con RNA del recettore dell'antigene per il saggio di pull-down dell'RNA. Sia la frazione di eluizione dell'RNA della luciferasi della lucciola che il campione di perle bianche hanno dato risultati negativi, indicando che le interazioni non specifiche non erano rilevabili utilizzando questo approccio.

Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che l'interazione tra il frammento di RNA antigene-recettore e la proteina HuR era specifica. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come recuperare le proteine leganti l'RNA da un trascritto di RNA dal tessuto adiposo bruno. Una volta padroneggiato, questo può essere fatto in 24 ore, se viene eseguito correttamente.