Name: Rilevamento di RNA-binding proteins by In Vitro RNA a tendina nella cultura degli adipociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Scopri il protocollo RNA pull-down ottimizzato per rilevare le interazioni tra proteine leganti RNA e trascritti nell'adiposo bruno. Questo metodo facilita lo studio dei meccanismi regolatori del RNA e delle proteine associate.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla Singapore NRF borsa di studio (NRF-2011NRF-NRFF001-025), così come CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).

NOTA: L&#39;RNA di interesse nel contesto di questo studio è un frammento di AR 3&#39;UTR. 1. Preparazione di RNA marcato con biotina <ol><li> Per ottenere l&#39;RNA, amplificare T7-AR-oligo mediante PCR, seguita da trascrizione in vitro utilizzando un kit commerciale e seguendo le istruzioni del produttore 11. NOTA: Primer per PCR sono elencate nella Tabella 4: T7-AR-F e T7-AR-R. </li><li> Per non specifico di controllo vincolante, amplificare una sequenza parziale di DNA luciferasi di lucciola (FL) mediante PCR da psiCHECK-2 plasmide, seguita da in vitro trascrizione. NOTA: Primer per PCR sono elencate nella Tabella 4: hluc (+) - T7-probe-F e hluc (+) - Sonda-R Tabella 4 Sequenze di modello e primer per l&#39;amplificazione PCR... </li><li> Per un 50 microlitri reazione PCR, mescolare 50 ng del DNA (oligo o plasmide), 4 dNTP microlitri (2,5 mm di ogni singolo dNTP), 5 ml 10x tampone di reazione, 1 ml 2,5 U / &amp; #181; l DNA polimerasi, 2 microlitri 10 micron di primer in avanti, 2 microlitri 10 micron di primer inverso, e acqua priva di nucleasi. <ol><li> Eseguire l&#39;amplificazione PCR in un termociclatore utilizzando il seguente programma. STEP1: un ciclo di 95 ° C per 2 min; STEP2: 35 cicli di 95 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec (AR) o 60 sec (FL); Passo 3: un ciclo di 72 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> Sintetizzare RNA biotinilati utilizzando un kit di trascrizione in vitro seguendo le istruzioni del produttore 11. In questo esperimento, utilizzare prodotti di PCR come modelli per la sintesi di RNA. Per un microlitri in vitro reazione 20 trascrizione, mescolare 200 ng PCR DNA amplificato, 2 ml di ogni singolo NTP, 1 ml 10mM biotina-CTP, 2 ml 10x tampone di reazione, e 2 microlitri T7 RNA polimerasi. Incubare la miscela a 37 ° C per 4 ore. </li><li> In seguito la trascrizione in vitro, miscela di reazione trattamento con 1 ml 2 U / ml DNasi a 37 &amp; #176; C per 15 minuti per degradare DNA stampo. Infine, diluire l&#39;RNA biotinilato ad un volume totale di 60 microlitri per successiva purificazione. </li><li> Purificare RNA biotinilati per eliminare i sali e nucleotidi non incorporati utilizzando le colonne di purificazione seguendo le istruzioni del produttore 12. Misurare la concentrazione di RNA e conservare a -80 ° C per le successive analisi di pull-down. </li><li> Per garantire la corretta struttura secondaria per l&#39;RNA di interesse a interagire RNA-proteina, calore 50 microlitri di RNA biotinilato (50 pM) a 90 ° C per 2 min, raffreddamento su ghiaccio per 2 minuti, quindi fornire con 50 tampone RNA struttura microlitri 2x (Tabella 3), e permettere l&#39;RNA pieghevole a temperatura ambiente per 30 min 13,14. </li></ol> 2. Preparazione di perline RNA-coniugato NOTA: utilizzare un supporto magnetico per la separazione delle sfere magnetiche e surnatante. <ol><li> Risospendere le sfere magnetiche rivestite di streptavidina nel flacone originale per breve vortexing seguendo le istruzioni del produttore. Trasferire 150 ml microsfere in sospensione in una provetta da 1,5 ml. Posizionare il tubo su magnete per 1 min. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. NOTA: In RNA saggi di pull-down, quando si dispensa microsfere in sospensione dal flacone originale, utilizzare 50 perle microlitri per un test seguito da western blotting, e 200 perline microlitri per un test seguito da MS. </li><li> Lavare perline volta da ri-sospensione tallone pellet con 1 ml di consigliata dal costruttore 1x W &amp; B (vincolanti e lavaggio) tampone (Tabella 3), seguita ruotando la provetta per 5 min a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li><li> Per inattivare RNase su perline, lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione tallone pellet con 400 microlitri tampone A. tampone A è una soluzione alcalina contenente 0,1 M NaOH e 0,05 M NaCl (Tabella 3). Ruotare la provetta per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li> &lt;li&gt; Per rimuovere NaOH da perline, lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione tallone pellet con 400 microlitri tampone B (Tabella 3), seguita ruotando la provetta per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. surnatante degli scarti. Mantenere tallone pellet. </li><li> Risospendere tallone pellet con 300 microlitri 2x W &amp; B tampone, perline divisa in parti uguali e trasferire in tre provette da 1,5 ml (100 perle microlitri per tubo). Fornire i tubi tallone contenenti 100 microlitri RNasi acqua libera, 100 ml biotinilati FL RNA e 100 ml biotinilati AR 3&#39;UTR RNA, rispettivamente. </li><li> Incubare ogni miscela sferette per 1 ora a temperatura ambiente con rotazione. Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Eliminare tutto il surnatante. Mantenere pellet tallone. </li><li> Lavare perline due volte, ogni volta per ri-sospensione ogni pellet tallone con 400 microlitri 1x W &amp; B tampone, seguito da tubi rotante per 5 min a temperatura ambiente in un rotatore. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Eliminare tutto il surnatante. Risospendere ogni pelle tallonet con 50 buffer di isolamento nucleare microlitri (Tabella 3). </li></ol> 3. Preadipocyte Isolamento e adipogenesis induzione <ol><li> Come descritto in precedenti pubblicazioni 5, sezionare preadipociti del cuscinetto adiposo bruno interscapolare (topi wild type C57BL6, 3 settimane). </li><li> Crescere e in vitro differenziare le preadipocytes 5. Le cellule sono pronte per l&#39;applicazione a valle 4-5 giorni dopo l&#39;inizio della differenziazione. </li></ol> 4. Preparazione di Cellular lisato da adipociti primari NOTA: Assicurarsi che tutte le procedure di preparazione lisato cellulare sono realizzati su ghiaccio, e tutti i buffer sono raffreddati su ghiaccio. omogeneizzatori vetro Dounce pre-raffreddamento su ghiaccio. <ol><li> Crescere e differenziarsi preadipocytes in 15 cm piatti 5 (vedere paragrafo 3.2). Ogni piatto fornisce cellule sufficienti per una RNA test di pull-down. Il giorno 4 o 5 giorni di differenziazione, mezzo di coltura cellulare di scarto, e lavare ceLLS una volta con PBS 1x. </li><li> Per raccogliere le cellule, aggiungere 10-15 ml PBS 1x per le cellule, raschiare per raccogliere le cellule in una provetta da 50 ml, e le cellule pellet per centrifugazione a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante utilizzando 1 ml pipetta. </li><li> Pellet Risospendere cellule in 2 ml di tampone ipotonico (Tabella 3), e incubare le cellule in ghiaccio per 15 min. Trasferire le cellule in un omogeneizzatore di vetro da 15 ml Dounce e cellule taglio meccanicamente su ghiaccio con 20 colpi. </li><li> Pellet nuclei delle cellule per centrifugazione a 3.300 xg per 15 min a 4 ° C. Mantenere pellet nuclei in ghiaccio per un ulteriore uso (vedere paragrafo 4.6). Trasferire il surnatante in provette da 1,5 ml, aggiungere 3M KCl al supernatante ad ottenere una concentrazione finale di 150 mM, e centrifuga a 20.000 xg per 15 min a 4 ° C. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione lipidlayeron alto utilizzando 1 ml pipetta, e raccogliere il surnatante come il lisato cellulare citoplasmatica. </li><li> Risospendere pellet nuclei (vedere paragrafo 4.4) a 1 ml di tampone di isolamento nucleare. Tnuclei RASFERIMENTO ad un omogeneizzatore di vetro da 15 ml Dounce usando 1 ml pipetta, e nuclei di taglio meccanico sul ghiaccio con 100 colpi. Pellet detriti nucleare per centrifugazione a 20.000 xg per 15 min a 4 ° C, e raccogliere il surnatante come il lisato cellulare nucleare. </li><li> O combinare i lisati cellulari nucleari e citoplasmatici, o utilizzare ogni frazione a parte, per l&#39;applicazione di pull-down a valle. In questo esperimento demo, queste due frazioni di lisato cellulare sono stati combinati in un rapporto in volume di 1: 1. </li><li> Aggiungere inibitore RNase a questo lisato cellulare non frazionata per ottenere una concentrazione finale di 0,5 U / ml. Mettere da parte 100 ml di lisato cellulare come controllo di input per Western Blotting 15. </li></ol> 5. rilegatura e eluizione di RBP <ol><li> lisato Split cella in tre aliquote uguali (lisato cellulare 1ml in una provetta da 1,5 ml), e incubare con vuoto, FL RNA-coniugato e perline AR 3&#39;UTR RNA-coniugati (vedi paragrafo 2.8), rispettivamente, per 3 ore a 4 ° Ccon rotazione. </li><li> Posizionare i tubi sul magnete per 1 min. Raccogliere il surnatante con una pipetta 1 ml, seguito da isolamento di RNA da surnatante per confermare l&#39;RNA integralità. Isolamento dell&#39;RNA utilizzando una soluzione di tiocianato di guanidinio-fenolo acido seguendo le istruzioni del produttore (Tabella 2). Valutare l&#39;integrità RNA analizzando 28S e 18S subunità di RNA ribosomiale. Mantenere pellet tallone sul ghiaccio. </li><li> Lavare le perline magnetiche sei volte, ogni volta per risospendere ogni pellet perlina di 1 ml di tampone di isolamento nucleare contenente 40 U RNasi inibitore e 0,25% IGEPAL, seguita da tubi rotante per 2 minuti a temperatura ambiente in un rotatore. Utilizzare un supporto magnetico per la separazione delle sfere magnetiche e surnatante. Eliminare tutto il surnatante. Mantenere pellet tallone sul ghiaccio. </li><li> Utilizzare seguente procedura per eluire complessi RNA-proteina da perline per western blotting. In primo luogo, risospendere ogni pellet tallone in 75 microlitri di buffer di isolamento nucleare; poi, aggiungere 25 ml 4x Western Blot carico buffer (contenente SDS) per ottenere un volume totale di 100 microlitri. Infine, bollire perline in questa soluzione 100 ml a 95 ° C per 5 min. NOTA: Utilizzare i seguenti passi per eluire complessi RNA-proteina da perline per la SM. STEP1: risospendere ogni pellet tallone in 100 microlitri tampone di eluizione (Tabella 3); STEP2: incubare campioni di perline per 2-3 ore a temperatura ambiente con rotazione; Fase 3: centrifuga e raccogliere il surnatante proteici; Fase 4: concentrato soluzioni di proteine ​​di 20-30 ml prima della presentazione per la SM. </li><li> Centrifugare ogni 100 ml di campione perline a 12.000 xg per 30 sec a 4 ° C, e raccogliere il surnatante. Aliquota 15 microlitri surnatante per l&#39;analisi Western Blot (vedere paragrafo 6.1 e 6.2). Sondare la membrana risultante con l&#39;anticorpo monoclonale HuR topo diluito (1: 1000 diluizione), durante la notte. </li></ol> 6. Western Blotting per la verifica di RBP <ol><li> RBPs separate mediante SDS-PAGE utilizzando tecniche standard. </li><li> condurre noipoppa assorbente utilizzando tecniche standard sondando per le RBPs connessi con l&#39;RNA di interesse. NOTA: In questo esperimento demo, HuR anticorpo monoclonale murino è stato utilizzato per la immunolocalizzazione di proteine ​​HuR. </li><li> Incubare la membrana risultante con l&#39;anticorpo HuR diluito (1: 1000 diluizione) in 5% w / v senza grassi latte in polvere, 1x TBS, 0,1% Tween - 20 a 4 ° C con dolce agitazione, durante la notte. Lavare membrana tre volte con 1x TBST. Incubare la membrana con l&#39;anticorpo secondario (capra anti-topo IgG-HRP) a temperatura ambiente per 1 ora. membrana di lavaggio. Sviluppare e segnale di registrazione. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

lncRNAs e RBPs hanno un ruolo vitale nella salute e la malattia, tuttavia i meccanismi molecolari di queste molecole sono poco conosciuti. Identificazione di proteine ​​che interagiscono con le molecole lncRNA è un passo fondamentale verso la comprensione dei meccanismi di regolazione. Arricchimento del RBPs da parte del sistema di analisi a tendina RNA si basa sulla cattura in-soluzione di interagire complesso in modo che le proteine ​​da un lisato cellulare possono essere selettivamente estratti utilizzando esche RNA ...

A correction to the author list was made to: <a href="http://www.jove.com/video/54207/detection-rna-binding-proteins-vitro-rna-pull-down-adipocyte">Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture</a>.
The author list has been updated from:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
*These authors contributed equally
to:
Qianfan Bai1*, Zhiqiang Bai1*, Shaohai Xu3, Lei Sun1,2
1Cardiovascular and Metabolic Disorders Program, Duke-NUS Medical School
2Institute of Molecular and Cell Biology, Singapore
3Division of Bioengineering, School of Chemical &#38; Biomedical Engineering, Nanyang Technological University
*These authors contributed equally

A correction to the author list was made to: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture.

Erratum: Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RBPs sono proteine ​​che si legano all&#39;RNA doppia o singola bloccati in cellule e partecipano a formare complessi RNA-proteina. RBPs possono vincolare una varietà di specie di RNA, inclusi mRNA e RNA non codificanti lunghi (lncRNAs), e di esercitare la loro influenza a livello post-trascrizionale. Entrambi RBPs e lncRNAs stanno emergendo come nuovi regolatori nello sviluppo adiposo e funzionano 1,2,3. Per comprendere il meccanismo di RBP- e regolazione lncRNA-mediata vie cellulari, è spesso necessario rilevare l&#39;interazione tra una molecola di RNA specifico e uno o più RBPs, e, a volte, per identificare l&#39;intero spettro di partner proteici di un RNA trascrizione. Tuttavia, l&#39;esperimento può essere difficile a causa dell&#39;elevato contenuto di lipidi in adipociti. L&#39;RNA protocollo tendina qui descritto può essere impiegato per recuperare i partner proteici di un RNA specifico dai lisati adipociti di colture primarie di 4,5. Motivazioni per questo protoCol è riassunta come segue. Un esca RNA è trascritto in vitro da un modello di DNA, biotina-etichettati e coniugato con biglie magnetiche rivestite di streptavidina 4. L&#39;esca RNA viene incubato con lisati cellulari per permettere la formazione di complessi RNA-proteina, che vengono successivamente abbassate su un supporto magnetico. Più specificamente, il protocollo di pull-down RNA descritto di seguito utilizzare un frammento di RNA da AR 3&#39;UTR come esca per recuperare HuR proteina, un RBP universalmente espressa vincolato al 3&#39;UTR del mRNA 6,7, da theadipocytelysate di coltura primaria. Per testare la specificità di legame di questo saggio, un RNAas non rilevanti e perline streptavidina vuote è incluso come controllo. Questo protocollo è compatibile con western blotting o spettrometria di massa (MS) per confermare la cattura di un RBP specifica o per identificare la piena repertorio di RBPs catturati, rispettivamente 8. Diverse tecniche sono a disposizione per studiare l&#39;interazione RNA-proteinaS. Per rivelare RNA legati da un dato RBP, RIP (RNA immunoprecipitazione) e CLIP (reticolazione UV e immunoprecipitazione) può essere applicata. Al contrario, per identificare i partner proteici di un dato RNA, RNA pull-down, Chirp (isolamento cromatina da purificazione RNA), CHART (cattura analisi ibridazione degli obiettivi di RNA) e RAP (purificazione RNA antisenso) può essere applicata. In confronto con quelle successive, RNA tecnica discesa richiede meno sforzo di creare. Può essere impiegato per catturare proteine ​​in vitro e in vivo. L&#39;approccio in vivo di RNA pull-down, che è tecnicamente più impegnativo rispetto al suo omologo in vitro, conserva le interazioni RNA-proteina da reticolazione nelle cellule, cattura RNA aptamer-tag di interesse da cellule, e rileva in seguito RBPs rilegati. RNA pull-down può essere utilizzato per arricchire bassi RBPs abbondanti, e per isolare e identificare i complessi RNA-proteina che hanno diversi ruoli funzionali nel controllo della regolazione cellulare 9,10 </sup&gt;.

<table><tbody><tr><td>Principali materiali utilizzati in questo studio.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit MEGAscript</td><td>&nbsp; Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-CTP&nbsp;</td>Colonne di rotazione <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucAway&nbsp;</td><td>Ambion</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 Streptavidina&nbsp;</td>Anticorpo monoclonale di topo <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HuR (3A2) (sc-5261)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capra anti-topo IgG-HRP(sc-2005)&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hypure Molecular Biology Grade Acqua (senza nucleasi)&nbsp;</td><td>Soluzione salina tampone fosfato HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(1&volte; PBS)</td><td>&nbsp; Inibitore</td> della RNasi HyClone<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della proteasi&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pfu Turbo DNA polimerasi&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRIsure</td><td>&nbsp; Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Principali attrezzature utilizzate in questo studio.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall Legend Micro 21R&nbsp;</td><td>Centrifuga Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend X1R&nbsp;</td><td>Termociclatore Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad T100</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOECO rotatore Multi Bio RS-24&nbsp;</td><td>BOECO, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettroforesi su gel proteico e apparecchio blotting</td><td>Magnete Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Tecnologie per</td><td></td><td></td> la vita</tr></tbody></table>

rilevamento di rna-binding proteins by<em&gt; in vitro</em&gt; rna a tendina nella cultura degli adipociti

Detection of RNA-binding Proteins by In Vitro RNA Pull-down in Adipocyte Culture

RNA-binding proteins (RBPs) stanno emergendo come uno strato di regolamentazione per lo sviluppo e la funzione del tessuto adiposo. RBPs svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell&#39;espressione genica a livello post-trascrizionale che interessano l&#39;efficienza stabilità e traslazionale di mRNA bersaglio. RNA tecnica di pull-down è stato ampiamente utilizzato per studiare l&#39;interazione RNA-proteina, che è necessario per chiarire il meccanismo sottostante funzione di RBPs &#39;così come lungo RNA non codificanti&#39; (lncRNAs). Tuttavia, la grande abbondanza di lipidi negli adipociti rappresenta una sfida tecnica nella conduzione di questo esperimento. Ecco una dettagliata protocollo di pull-down RNA è ottimizzato per la cultura adipociti primaria. Un frammento di RNA da (AR) 3 &#39;regione non tradotta del recettore degli androgeni (3&#39;UTR) contenente un elementwas ricco adenilato-uridylate-usato come esempio per dimostrare come recuperare il suo partner RBP, proteine ​​HuR, da adipociti lystate. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare le interazioni traRBPs e RNA non codificanti, così come tra i RBPs e RNA codificanti.

In questo esperimento demo, un frammento di AR RNA è stato utilizzato come esca per catturare la sua proteina legante HuR. Sia un RNA esca FL che non è rilevante per la proteina HuR, ed una aliquota di coniugati perline streptavidina vuote serviti come controlli negativi. interazioni RNA-proteina possono avvenire sia in nucleo o nel citoplasma, e questo protocollo pull-down può essere applicato a totale o frazionato (nucleare o citoplasmatica) lisati cellulari. Analisi di proteine ​​medi...

Un protocollo di pull-down RNA è ottimizzato qui per il rilevamento delle interazioni tra RNA-binding proteins (RBPs) e non codificante e RNA codificanti. Un frammento di RNA da recettore degli androgeni (AR) è stato usato come esempio per dimostrare come recuperare la sua RBP da lystate degli adipociti bruni primarie.

Rilevamento di RNA-binding proteins by<em&gt; In Vitro</em&gt; RNA a tendina nella cultura degli adipociti

RNA-binding proteins (RBPs) are emerging as a regulatory layer in the development and function of adipose. RBPs play a key role in the gene expression ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è recuperare le proteine leganti l'RNA di un trascritto di RNA dal tessuto adiposo bruno. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali in questo campo, come ad esempio quali sono i meccanismi regolatori degli RNA codificanti a lunga vita e delle proteine RNA associate. Il vantaggio principale di questa strategia è che è facile da eseguire.L'RNA utilizzato per dimostrare questa procedura è un frammento della Regione non tradotta 3'-terminale del Recettore dell'Antigene, indicata in seguito come UTR 3'-terminale dell'AR. Iniziare amplificando l'oligonucleotide T7 AR e la sequenza parziale del DNA della luciferasi della lucciola dal plasmide psiCHECK-2. I primer e i parametri utilizzati sono descritti nel documento allegato.Dopo l'amplificazione, utilizzare i prodotti PCR come stampi per sintetizzare RNA biotinilati mediante un kit di trascrizione in vitro, seguendo le istruzioni del produttore. Incubare quindi la miscela a 37 gradi Celsius per quattro ore. Dopo la trascrizione in vitro, aggiungere un microlitro di Dnasi alla reazione e incubare a 37 gradi Celsius per 15 minuti per degradare il DNA stampo.Quindi, portare

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Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Questo video mostra un test di pull-down dell'RNA in vitro per identificare le proteine leganti l'RNA (RBP), che interagiscono con le sequenze di elementi ricchi di adenilato-uridilato (ARE) nell'mRNA. Le RBP bersaglio di un lisato cellulare vengono mescolate con una sonda di RNA per formare complessi RNA-proteina. I complessi vengono isolati mediante purificazione per affinità utilizzando l'affinità dell'etichetta della destiobiotina della sonda a RNA per una microsfera magnetica marcata con...

Saggio pull-down RNA-proteina per isolare le proteine leganti l'RNA tramite estrazione per affinità

Qui vi presentiamo un protocollo per analizzare le interazioni RNA / proteine. Il saggio spostamento mobilità elettroforetica (EMSA) si basa sulla migrazione differenziale di complessi RNA / proteine ​​e RNA libero durante elettroforesi su gel nativo. Utilizzando una sonda RNA radioattivo, RNA complessi / proteici possono essere visualizzati mediante autoradiografia.

Electrophoretic Maiusc Mobility Assay (EMSA) per lo studio delle interazioni RNA-proteina: La IRE / IRP Esempio

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Descriviamo un protocollo per identificare le proteine RNA-leganti e mappare loro regioni di RNA-binding in cellule vive utilizzando photocrosslinking UV-mediati e spettrometria di massa.

Preparazione dei campioni per l'identificazione basati sulla spettrometria di massa di RNA-binding Regions

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Desthiobiotin etichettatura di un sintetico oligo RNA 25 nucleotidi, che contiene un motivo di elemento ricco di adenina (ARE), permette di grippaggio specifico di proteina citosolica sono vincolanti.

Desthiobiotin-streptavidina-affinità mediata purificazione delle proteine che interagiscono con RNA nelle cellule di mesotelioma

Questo rapporto descrive un metodo veloce e affidabile per la convalida di mRNA bersaglio di Mirna cellulari. Il metodo utilizza biotinilati sintetici basati su Locked Nucleic Acid LNA miRNA imita per catturare destinazione mRNA. Successivamente, biglie magnetiche rivestite con streptavidina sono impiegati per pulldown il bersaglio mRNA per quantificazione da reazione a catena della polimerasi qPCR.

Biotina-based Pulldown Assay Validate mRNA Mirna obiettivi del cellulare

In questo metodo, quantifichiamo l'affinità legante delle proteine leganti l'RNA (RBP) per cognare e siti di legame non-cognati utilizzando un semplice, dal vivo, saggio reporter nelle cellule batteriche. Il saggio si basa sulla repressione di un gene reporter.

Un saggio per quantificare il legame proteino-RNA nei batteri

Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.

Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti

Qui, presentiamo un metodo in vitro ottimizzato per scoprire, quantificare e convalidare gli interattori proteici di specifiche sequenze di RNA, utilizzando estratto proteico totale da cellule umane, perle di streptavidina rivestite con RNA biotinilato e analisi di spettrometria di massa.

Un'analisi pull-down quantitativa ottimizzata delle proteine leganti l'RNA utilizzando RNA biotinilato corto

Scopri il protocollo RNA pull-down ottimizzato per rilevare le interazioni tra proteine leganti RNA e trascritti nell'adiposo bruno. Questo metodo facilita lo studio dei meccanismi regolatori del RNA e delle proteine associate.

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