Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare due popolazioni distinte di precursori cellulari perivascolari multipotenti da tessuto cardiaco umano. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della rigenerazione cardiaca, come il contributo fornito a tale processo da sottogruppi della popolazione cellulare perivascolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono la riduzione dell'eterogeneità delle popolazioni cellulari progenitrici ottenute e il miglioramento della vitalità rispetto a una selezione delle principali tecniche di adesione precedenti.

Questa tecnica potrebbe avere implicazioni nella terapia delle malattie cardiache ischemiche poiché è stato dimostrato che alcuni sottotipi di cellule staminali perivascolari possiedono potenziale cardiomiogenico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ruolo delle cellule perivascolari nella rigenerazione cardiaca, può essere applicato anche allo studio di altri aspetti delle malattie cardiache, come la fibrosi miocardica. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo incontreranno difficoltà a causa dell'uso di cellule vitali, che dipende dalla freschezza del tessuto.

Per iniziare questa procedura, dopo aver rimosso il pericardio, i vasi principali e le atria, posizionare il campione in un mezzo di lavaggio all'interno di una piastra di Petri. Successivamente, tagliare il miocardio ventricolare in piccoli pezzi di circa un millimetro cubo ed elaborarli immediatamente per ottenere la massima resa cellulare. Poi, preparare una soluzione di digestione fresca e riscaldarla a 37 gradi Celsius in un bagno termico.

Successivamente, filtrare i pezzi di tessuto sospesi attraverso un setaccio da 100 micron e lavarli due volte con PBS. Trasferire i pezzi di tessuto in un contenitore sterile da 30 millilitri con coperchio ermetico. Aggiungere la soluzione di digestione e posizionare il contenitore all'interno di un sacchetto di plastica sigillato in un bagno d'acqua agitato a 37 gradi Celsius impostato a 120 giri al minuto.

Dopo 15 minuti, capovolgere il contenitore tre volte. Successivamente, riporlo nel bagnomaria per altri 15 minuti. Alla fine, rimuoverlo e bloccare l'azione delle collagenasi con cinque millilitri di DMEM integrato con FBS al 20%.

Successivamente, triturare il tessuto digerito pipettando delicatamente da 10 a 20 volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri per disgregare eventuali aggregati di tessuto. Successivamente, filtrare la sospensione in sequenza attraverso filtri cellulari da 100 micron, da 70 micron e, infine, da 40 micron per ottenere una sospensione di singole cellule. Dopo di ciò, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per quattro minuti.

Versare con attenzione il soprannatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone lisante per le cellule rosse per due minuti a temperatura ambiente, prima di diluirlo con quattro millilitri di mezzo di lavaggio. Ripetere il passaggio di centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo di lavaggio. Diluire 10 microlitri di sospensione cellulare con 90 microlitri di mezzo di lavaggio per ottenere una diluizione 1:10 della sospensione cellulare.

Mescolare 10 microlitri della sospensione cellulare diluita con 10 microlitri di colorante blu di tripano e posizionare 10 microlitri della miscela su un emocitometro standard per il conteggio cellulare. In questo procedimento, aggiungere 50 microlitri di siero di topo alla sospensione cellulare e incubare a quattro gradi Celsius per 20 minuti per bloccare il legame aspecifico degli anticorpi. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per quattro minuti.

Rimuovere il soprannatante e risospendere nel mezzo di lavaggio. Successivamente, aliquotare 50 microlitri della sospensione cellulare in ciascuna delle due provette in polistirene rotonde per citometria a flusso destinate ai controlli isotipo e non colorato, e trasferire il volume rimanente in una terza provetta per la colorazione multicolore. Aggiungere cinque anticorpi alla singola sospensione cellulare per la colorazione multicolore.

Pipettare delicatamente per mescolare gli anticorpi con le cellule e incubare tutti i tubi a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio. Preparare le perle di controllo per la compensazione aggiungendo una goccia di perle positive a 100 microlitri di mezzo di lavaggio in cinque tubi per citometria a flusso. Aggiungere gli anticorpi singolarmente a ciascuno dei cinque tubi.

Quindi, incubare tutti i tubi a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio. Nel frattempo, preparare i tubi per la raccolta delle cellule, ciascuno contenente 500 microlitri di mezzo di coltura EGM-2, e posizionarli a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione con l'anticorpo, aggiungere cinque millilitri di mezzo di lavaggio per lavare le cellule e le microsfere, al fine di rimuovere eventuali anticorpi non legati.

Centrifugare tutti i tubi a 200 x g per quattro minuti. Ripetere i passaggi di lavaggio e centrifugazione e decantare con attenzione il sopranatante. Quindi, risospendere le cellule nel mezzo di lavaggio a una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per 250 microlitri.

In seguito, risospendere le perle in 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Trasferire le sospensioni cellulari e delle perle al citofluorimetro su ghiaccio e al buio. Aggiungere una goccia di perle negative ai tubi di controllo per la compensazione delle perle positive e utilizzarli per impostare la compensazione della fluorescenza.

Quindi, eseguire le cellule di controllo non colorate per stabilire la fluorescenza di fondo e impostare le tensioni. Successivamente, eseguire gli isotipi di controllo per stabilire le soglie di fluorescenza di fondo relative al legame non specifico. Eseguire il campione colorato con multicolorazione e raccogliere le popolazioni di cellule pericitarie e avventiziali nei tubi di raccolta.

In questa procedura, aggiungere 100 microlitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,2% per centimetro quadrato di area di crescita e agitare manualmente per ricoprire completamente i pozzetti. Successivamente, incubare le piastre a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Poi, rimuovere completamente la soluzione di gelatina.

Mantenere le cellule raccolte sul ghiaccio durante la preparazione delle piastre di coltura. Successivamente, centrifugare le cellule appena raccolte a 200 x g per quattro minuti e risospendere delicatamente il pellet cellulare in un'adeguata quantità di EGM-2. Successivamente, seminare le cellule sulle piastre rivestite con gelatina.

In questa figura, le cellule vive sono state selezionate escludendo prima le cellule positive per CD45, seguite dalle cellule positive per CD56. Le cellule endoteliali positive per CD144 sono state quindi rimosse dalla frazione negativa per CD56. Da questa popolazione finale, sono stati selezionati e successivamente raccolti i periciti positivi per CD146 e negativi per CD34, nonché le cellule avventiziali negative per CD146 e positive per CD34.

Entrambe le colture di periciti miocardici e cellule avventiziali purificate mediante FACS mostrano una morfologia cellulare da fusiforme a stellata. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà circa cinque ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni più freschi forniranno il miglior rendimento di cellule vitali.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cardiomioplastica cellulare, al fine di rispondere ad ulteriori domande, ad esempio sull'idoneità di queste cellule nel trattamento delle malattie cardiache ischemiche.