Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare due popolazioni distinte di cellule precursori perivascolari multipotenti dal tessuto cardiaco umano. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della rigenerazione cardiaca, come il contributo dato a questo processo da sottogruppi della popolazione cellulare perivascolare. I principali vantaggi di questa tecnica sono che si traduce in popolazioni di cellule progenitrici di ridotta eterogeneità e migliore vitalità di una selezione delle principali tecniche di ex-adesione.

Questa tecnica può avere implicazioni nella terapia della cardiopatia ischemica perché è stato dimostrato che i sottotipi di cellule staminali perivascolari hanno un potenziale cardiomiogenico. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul ruolo delle cellule perivascolari nella rigenerazione cardiaca, può anche essere applicato all'indagine di altri aspetti delle malattie cardiache, come la fibrosi miocardica. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dell'uso vitale delle cellule a causa della freschezza dei tessuti.

Per iniziare questa procedura, dopo aver rimosso il pericardio, i vasi principali e gli atri, porre il campione in un mezzo di lavaggio in una capsula di Petri. Successivamente, tagliare il miocardio ventricolare in piccoli pezzi di circa un millimetro cubo e lavorarli immediatamente per ottenere la massima resa cellulare. Quindi, prepara una soluzione di digestione fresca e scaldala a 37 gradi Celsius a bagnomaria.

Successivamente, filtrare i pezzi di tessuto sospesi attraverso un colino da 100 micron e lavarli due volte con PBS. Trasferire i pezzi di tessuto in un contenitore sterile da 30 millilitri con un coperchio ermeticamente chiuso. Aggiungere la soluzione digestiva e posizionare il contenitore all'interno di un sacchetto di plastica sigillato in un bagnomaria con agitazione a 37 gradi Celsius impostato a 120 giri/min.

Dopo 15 minuti, capovolgere il contenitore tre volte. Quindi, rimettilo a bagnomaria per altri 15 minuti. Successivamente, rimuovere e spegnere le collagenasi con cinque millilitri di DMEM integrati con il 20% di FBS.

Successivamente, triturare il tessuto digerito pipettandolo delicatamente da 10 a 20 volte con una pipetta sierologica da 10 millilitri per abbattere eventuali grumi di tessuto. Quindi, filtrare la sospensione in sequenza attraverso filtri cellulari da 100 micron, 70 micron e, infine, 40 micron per ottenere una sospensione a cella singola. Successivamente, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per quattro minuti.

Decantare accuratamente il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone lisanti dei globuli rossi per due minuti a temperatura ambiente prima di diluirlo con quattro millilitri di terreno di lavaggio. Ripetere la fase di centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di terreno di lavaggio. Diluire 10 microlitri di sospensione cellulare con 90 microlitri di terreno di lavaggio per ottenere una diluizione da uno a 10 della sospensione cellulare.

Mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare diluita con 10 microlitri di colorante blu di tripano e posizionare 10 microlitri della miscela su un emocitometro standard per il conteggio delle cellule. In questa procedura, aggiungere 50 microlitri di siero di topo alla sospensione cellulare e incubarla a quattro gradi Celsius per 20 minuti per bloccare il legame degli anticorpi non specifici. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 200 x g per quattro minuti.

Rimuovere il surnatante e rimetterlo in un mezzo di lavaggio. Successivamente, aliquotare 50 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna delle due provette rotonde di citometria a flusso inferiore in polistirene per l'isotipo e i controlli non colorati e posizionare il volume rimanente in una terza provetta per la colorazione multicolore. Aggiungere cinque anticorpi alla sospensione a cellula singola per la colorazione multicolore.

Pipettare delicatamente per mescolare gli anticorpi con le cellule e incubare tutte le provette a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio. Preparare le perle di controllo della compensazione aggiungendo una goccia di perle positive a 100 microlitri di terreno di lavaggio in cinque provette per citometria a flusso. Aggiungere gli anticorpi singolarmente a ciascuna delle cinque provette.

Quindi, incubare tutte le provette a quattro gradi Celsius per 20 minuti al buio. Nel frattempo, preparare le provette per la raccolta delle cellule, ciascuna con 500 microlitri di terreno di coltura EGM-2, e posizionarle a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione degli anticorpi, aggiungere cinque millilitri di terreno di lavaggio per lavare le cellule e le perle al fine di rimuovere eventuali anticorpi non legati.

Centrifugare tutte le provette a 200 x g per quattro minuti. Ripetere le fasi di lavaggio e centrifugazione e decantare accuratamente il surnatante. Quindi, risospendere le cellule nel terreno di lavaggio a una concentrazione di una volta per 10 alla 6a cellula per 250 microlitri.

Successivamente, risospendere le perle in 100 microlitri di terreno di lavaggio. Trasferire le sospensioni cellulari e perline al selezionatore di cellule con ghiaccio al buio. Aggiungere una goccia di perline negative ai tubi di controllo della compensazione positiva delle microsfere e utilizzarle per impostare la compensazione della fluorescenza.

Quindi, eseguire le celle di controllo non colorate per stabilire la fluorescenza di fondo e impostare le tensioni. Successivamente, eseguire gli isotipi di controllo per stabilire le soglie di fluorescenza di fondo relative al legame aspecifico. Eseguire il campione colorato con più colori e raccogliere le popolazioni di periciti e cellule avventiziali nelle provette di raccolta.

In questa procedura, aggiungere 100 microlitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,2% per centimetro quadrato di area di crescita e agitare manualmente per rivestire l'intero pozzetto. Successivamente, incubare le piastre a quattro gradi Celsisu per 10 minuti. Quindi, rimuovere completamente la soluzione di gelatina.

Mantenere le cellule raccolte sul ghiaccio durante la preparazione delle piastre di coltura. Quindi, centrifugare le cellule appena raccolte a 200 x g per quattro minuti e risospendere delicatamente il pellet di cellule in una quantità appropriata di EGM-2. Successivamente, semina le cellule sulle piastre ricoperte di gelatina.

In questa figura, le cellule vive sono state gated per escludere prima le cellule CD45-positive seguite dalle cellule CD56-positive. Le cellule endoteliali CD144-positive sono state quindi rimosse dalla frazione CD56-negativa. Da questa popolazione finale, sono stati selezionati e successivamente raccolti periciti CD146-positivi, periciti CD34-negativi e cellule avventiziali CD146-negative, CD34-positive.

Entrambe le colture di periciti miocardici purificati con FACS e cellule avventiziali mostrano una morfologia cellulare da fuso a stellare. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiederà circa cinque ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni più freschi forniranno la migliore resa di cellule vitali.

Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come la cardiomioplastica cellulare, per rispondere a ulteriori domande, come l'idoneità di queste cellule nel trattamento della cardiopatia ischemica.