Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano Brucella L'infezione di cellule HeLa

L'obiettivo generale di questo test basato sulla microscopia ad alto rendimento è identificare i fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione da Brucella delle cellule HeLa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione ospite-patogeno, come l'identificazione delle proteine dell'ospite che promuovono o impediscono la colonizzazione da parte del patogeno intracellulare Brucella. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il flusso di lavoro semi-automatizzato dal laboratorio veterinario all'analisi delle immagini consente ai robot di creare esperimenti ad alta produttività in modo efficiente.

Quindi questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni dell'ospite di Brucella utilizzando gli schermi siRNA. La maggior parte del protocollo può essere applicata ad altre strategie di screening. Ad esempio, o librerie di siRNA.

Dopo aver coltivato le cellule HeLa e preparato le piastre di screening con siRNA secondo il protocollo di testo, scongelare una piastra nera a 384 pozzetti mediante centrifugazione a 300 volte G e temperatura ambiente per 20 minuti. Preparare il terreno di trasfezione utilizzando dmem a temperatura ambiente senza FCS. Per diluire il reagente di trasfezione uno a 200 e mescolare accuratamente prima dell'uso.

Utilizzando un dispenser di reagenti, aggiungere 25 microlitri di terreno di trasfezione a ciascun pozzetto della piastra da 384 pozzetti e mescolare le soluzioni muovendo la piastra avanti e indietro. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora per consentire la formazione del complesso di reagenti di trasfezione siRNA. Nel frattempo, preparare le cellule HeLa aspirando il terreno di coltura e aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina EDTA allo 0,05% in PBS per lavare una volta le cellule subconfluenti di un pallone da 75 centimetri quadrati.

Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tripsina fresca e trasferire il pallone a 37 gradi Celsius per due o tre minuti fino a quando le cellule non si arrotondano. Utilizzare 10 millilitri di dmem 60%FCS preriscaldato per risospendere le cellule. Quindi, utilizzare un contatore di cellule automatizzato per contare le cellule prima di preparare una sospensione cellulare di 10.000 cellule per millilitro in dmem con 16% di FCS.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di reagente di trasfezione. Il risultato è di 500 celle per pozzetto. Muovi la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente le celle.

Quindi, lasciare la piastra a temperatura ambiente per cinque-10 minuti per consentire alle celle di stabilizzarsi. Utilizzare il parafilm per sigillare la piastra. E incubarlo in un'incubatrice umida su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius con il 5% di C02 per 72 ore.

Lavorare con l'agente patogeno di terza classe B.abortus è pericoloso e devono essere seguite le norme locali di biosicurezza che includono l'uso di una tuta protettiva, guanti protettivi, maschera e occhiali. Un giorno, prima dell'infezione, inoculare la quantità precedentemente determinata di coltura starter di B. abortus in 50 millilitri di TSB KM medium. In un flacone da 250 millilitri con tappo a vite.

Usa il parafilm per sigillare la bottiglia e far crescere i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius e 100 giri/min su uno shaker a una densità ottica da 600,8 a 1,1. Misurare la densità ottica 600 della coltura batterica. E preparare il mezzo di infezione diluendo la coltura batterica in dmem 10%FCS per ottenere la molteplicità di infezione desiderata.

Oppure, MOI. Utilizzando una lavapiastre automatizzata, sostituire il terreno di trasfezione con 50 microlitri di terreno di infezione. All'interno della cappa trasferire la piastra nella gabbia della centrifuga e centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 400 volte G e quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, utilizzare il parafilm per sigillare la piastra e incubarla su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius e 5% C02 per quattro ore. Dopo l'incubazione con la lavatrice automatica per piastre, utilizzare dmem con 10% FCS contenente 100 microgrammi per millilitro di dentrimysen o GM per lavare le cellule per inattivare i batteri extracellulari. Quindi, utilizzare il parafilm per sigillare la piastra e riposizionarla sulla piastra di alluminio preriscaldata nell'incubatore per altre 40 ore per il saggio del punto finale.

Per riparare le celle, utilizzare prima il PBS per lavare i pozzetti. Quindi, sostituire il PBS con 50 microlitri di PFA al 3,7%. In 2 a pH 7,4.

E incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare 50 microlitri di PBS per sostituire il terreno di fissaggio. Per colorare i campioni con la lavacliché automatizzata, iniziare utilizzando 50 microlitri di Triton X-100 all'1% in PBS per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.

Dopo aver utilizzato il PBS per lavare le cellule tre volte, aggiungere 50 microlitri di PBS con un microgrammo per millilitro di DAPI e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, usa il PBS per lavare le celle tre volte prima di proteggerle dalla luce. Trasferire la lastra al microscopio automatico.

Impostare i parametri del microscopio. Seleziona il soggettivo 10-X. Quindi selezionare il formato della piastra corrispondente alla piastra a 384 pozzetti.

Acquisire nove siti per pozzo. Selezionare Abilita messa a fuoco laser. E concentrati sulla piastra e sul fondo del pozzo.

Quindi, impostare il primo pozzo acquisito come pozzo iniziale per trovare il campione e tutti i siti per l'autofocus del sito. Successivamente, per il canale DAPI, regolare manualmente l'offset Z per la messa a fuoco. Quindi, premere Trova campione per impostare la messa a fuoco sul fondo del pozzo.

Utilizzando la funzione AutoExposure si ottiene una buona stima del tempo di esposizione. Correggere manualmente il tempo di esposizione per il canale DAPI per garantire un'ampia gamma dinamica con bassa sovraesposizione. Utilizzare questo tempo di esposizione per acquisire immagini in diversi siti della lastra.

E regola manualmente il tempo di esposizione fino a quando i pixel più luminosi raggiungono circa l'80% della luminosità massima sui siti. Ripetere i passaggi per impostare la messa a fuoco e il tempo di esposizione, di conseguenza per tutti gli altri canali. Quindi, iniziare l'acquisizione della piastra completa.

Per il saggio del punto finale, utilizzare i canali DAPI e GFP per visualizzare l'intera piastra. Per eseguire un'analisi delle immagini su cellule colorate nel saggio del punto finale, dopo aver calcolato un modello di ombreggiatura, in base al protocollo di testo, in Visualizza impostazioni di output selezionare la cartella di input con le immagini e una cartella di output con i risultati. Quindi, definisci il testo che le immagini hanno in comune e carica i modelli di ombreggiatura.

Fare clic su Avvia modalità test e assicurarsi che le impostazioni di pausa e visualizzazione per tutti i moduli siano disabilitate. Abilita l'impostazione di pausa e visualizzazione per il modulo nove ImageMath. Il simbolo di pausa abilitato apparirà in giallo.

La funzione di visualizzazione abilitata apparirà come un occhio aperto. Quindi, fai clic su Esegui per eseguire l'analisi fino al modulo nove. Nel modulo nove regolare il parametro moltiplicare la seconda immagine per un valore che sopprimerà il segnale DAPI in Brucella senza sopprimere i nuclei.

Per testare i valori del modulo, premere Step. Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine appena aperta e impostare il contrasto dell'immagine su log normalizzato. Ripetutamente, torna al modulo nove.

Regolare il parametro, moltiplicare la seconda immagine per e passare nuovamente sul modulo fino a quando il segnale Brucella non è completamente soppresso, mentre allo stesso tempo le aree nere che indicano una sovrasottrazione sono ridotte al minimo. Per trovare parametri validi per determinati moduli è necessario ottimizzare gradualmente i parametri. È sicuramente importante passare ripetutamente da un modulo all'altro, provando valori diversi e osservando l'effetto sul risultato visualizzato.

Abilita la pausa e la visualizzazione per il modulo 10. Identificare gli oggetti primari. Imposta il parametro limite inferiore sulla soglia, abbastanza alto in modo che i nuclei vengano segmentati e lo sfondo venga ignorato.

Per identificare un buon valore sul modulo, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine di input e visualizzare l'istogramma in cui il picco indica tipicamente lo sfondo. Partendo dall'intensità di fondo, aumentare il parametro fino a raggiungere la buona segmentazione dei nuclei, come mostrato nell'immagine di output. L'obiettivo della pipeline di analisi delle immagini è identificare le cellule che contengono batteri replicanti.

Ciò si ottiene impostando diverse soglie per il segnale del patogeno nel nucleo, nel perinucleo e nel corpo cellulare di Voronoi. Abilitare la pausa e la visualizzazione per il modulo 15. Filtra gli oggetti, come mostrato in precedenza, e premi Esegui.

Impostare il valore minimo del parametro su un valore sufficientemente alto in modo che vengano mantenute solo le cellule con Brucella chiaramente visibile nel nucleo e tutte le altre vengano filtrate. Per identificare un buon valore, eseguire un passo avanti sul modulo e visualizzare l'immagine di output. Aumentare gradualmente il valore fino a mantenere solo le cellule con Brucella chiaramente visibile al nucleo.

Dopo aver filtrato le cellule con batteri nel perinucleo e il corpo cellulare Voronoi nei moduli 16 e 17 secondo il protocollo di testo, uscire dalla modalità di test e deselezionare tutti i simboli dell'occhio accanto ai moduli per assicurarsi che nessuno dei moduli mostri il proprio display prima di eseguire l'analisi completa. Infine, premere Analizza immagini per avviare l'analisi. Al termine dell'analisi, ispeziona le immagini PNG risultanti e il foglio di calcolo CSV per assicurarti che l'analisi abbia funzionato in modo affidabile in tutta la lastra.

Eseguire il test di ingresso e il punteggio dell'infezione secondo il protocollo di testo. Questa figura mostra un esempio di analisi delle immagini utilizzata per identificare automaticamente le cellule infette nel saggio dell'endpoint. Sono stati identificati nuclei di cellule HeLa colorate con DAPI.

Un perinucleo di otto pixel di larghezza che circonda il nucleo. E un corpo cellulare Voronoi per estensione del nucleo, di 25 pixel, sono stati calcolati. Una cellula era considerata infetta se il segnale del patogeno superava la soglia corrispondente in almeno un compartimento.

Brucella richiede riarrangiamenti dell'azione per il successo dell'impegno delle cellule ospiti. Pertanto, la deplezione di ARP23 è un controllo positivo adatto per lo screening dei siRNA. La deplezione di ARPC3 ha ridotto il numero di cellule con batteri proliferanti due giorni dopo l'infezione.

Rispetto alle celle controllate trattate strapazzate. In questo grafico, è stato osservato che l'analisi automatizzata delle immagini riduce in modo quantificabile l'infezione delle cellule HeLa deplete di ARPC3 rispetto alle cellule controllate. La deplezione di ARPC3 ha anche mostrato una riduzione dell'infezione da Brucella nel test di ingresso rispetto alle cellule controllate.

Come si vede dal numero ridotto di Brucella intracellulare raffigurata in giallo. Infine, la quantificazione dell'infezione mediante analisi automatizzata delle immagini ha confermato che il numero di cellule infette e il numero di batteri intracellulari nelle cellule infette sono stati ridotti dalla deplezione di ARPC3. Una volta padroneggiato, questo protocollo può fornire risultati di analisi delle immagini entro una settimana e mezza dall'inizio dell'esperimento.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante esaminare attentamente i risultati dell'analisi delle immagini per assicurarsi che i parametri scelti funzionino bene in tutta la lastra. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'imaging delle cellule vitali, per rispondere a ulteriori domande. Come quando si tratta di trafficare, un certo fattore ospite interagisce con Brucella.

O come l'esaurimento di un gene influisce sulla dinamica intracellulare dell'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle infezioni per esplorare i fattori dell'ospite necessari per l'infezione da Brucella in un test delle cellule HeLa. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come identificare i fattori dell'ospite che promuovono, o prevengono, la colonizzazione di successo delle cellule HeLa da parte del patogeno intracellulare Brucella abortus.

Non dimenticare che lavorare con Brucella abortus può essere estremamente pericoloso e le normative locali sulla biosicurezza devono essere seguite rigorosamente.