Name: Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano Brucella Linfezione di cellule HeLa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: Scopri saggi di screening ad alto rendimento basati su microscopia per identificare fattori ospite coinvolti nell'infezione di cellule HeLa da parte di Brucella. Questo metodo semi-automatizzato utilizza siRNA per accelerare la scoperta di proteine chiave.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni 51RT 0_126008 e 51RTP0_151029 per il progetto di ricerca e sviluppo tecnologico (RTD) InfectX e TargetInfectX, rispettivamente, nell'ambito di SystemsX.ch, l'Iniziativa svizzera per la biologia dei sistemi. Prendiamo atto delle 310030B_149886 di sovvenzione del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica (FNS). Il lavoro di S.H.L e A.C. è stato sostenuto dal programma di dottorato internazionale "Fellowships for Excellence" del Biozentrum. Simone Muntwiler è riconosciuta per l'assistenza tecnica. Ringraziamo Dirk Bumann per aver fornito pNF106 e Jean Celli per pJC43 e pJC44.

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<li>Celli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brucella+evades+macrophage+killing+via+VirB-dependent+sustained+interactions+with+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum.</a> J Exp Med. 198, 545-556 (2003).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

I patogeni batterici hanno sviluppato numerose strategie per manipolare le cellule ospiti eucariotiche a loro vantaggio. Gli agenti patogeni che causano infezioni acute spesso mostrano una rapida proliferazione, che è accompagnata da un significativo allarme del sistema immunitario e dalla perdita di vitalità delle cellule infette. Al contrario, Brucella e altri agenti patogeni che causano infezioni croniche riescono a stabilire interazioni durature all'interno delle cellule ospiti. Pertanto, i batteri devono me...

Specie Brucella sono gram-negativi, patogeni intracellulari facoltativi appartenenti alla classe di α-Proteobacteria. Sono causa di aborti e sterilità nei loro ospiti naturali come bovini, capre, pecore o causando gravi perdite economiche in aree endemiche. La brucellosi è una delle più importanti malattie zoonotiche in tutto il mondo causando oltre mezzo milione di nuovi casi di infezione umana ogni anno 1. Trasmissione a umano è più comunemente causata dal contatto diretto con animali infetti o per ingestione di alimenti contaminati come il latte non pastorizzato. I sintomi della malattia febbrile sono aspecifici, che provoca difficoltà nella diagnosi di brucellosi. Se non trattata, i pazienti possono sviluppare una infezione cronica con i sintomi più gravi come l&#39;artrite, endocardite, e neuropatia 2. Al livello cellulare Brucella è in grado di invadere le cellule fagocitiche e non fagocitiche e replica all&#39;interno di un intracellulareVano conosciuta come la Brucella -aventi tenore vacuolo (BCV). L&#39;internalizzazione dei batteri richiede riarrangiamenti actina citoscheletro da Rac, Rho, e l&#39;attivazione diretta di Cdc42 3. All&#39;interno della cellula ospite eucariotica, la BCV traffici lungo il percorso endocytic e nonostante l&#39;interazione con i lisosomi, i batteri riescono a evitare il degrado 4. L&#39;acidificazione della BCV dal vescicolare ATPasi è necessario per indurre l&#39;espressione di tipo batterico sistema di secrezione IV (T4SS) 5. Si ritiene che effettori batterici secreti dal T4SS sono essenziali per Brucella stabilire la sua nicchia replicativa, poiché l&#39;eliminazione del T4SS 6 o inibizione del piombo ATPasi vescicolare difetti della costituzione della nicchia intracellulare 7. I batteri non replicano durante la fase di traffico fino a quando non raggiungere un comparto vacuolare ER-derivato 8. Una volta che si verifica la proliferazione intracellulare, la BCV si trova in classociazione ose con marcatori ER quali calnexin e glucosio-6-fosfatasi 6. I meccanismi molecolari con cui Brucella entra nelle cellule, evita la degradazione lisosomiale, e, infine, replica in un vano ER-come rimangono in gran parte sconosciuti. Fattori di accoglienza che partecipano diverse fasi di infezione sono stati principalmente identificata da approcci mirati o uno schermo di piccole dimensioni small interfering RNA (siRNA) eseguita in cellule di Drosophila 9. Questi hanno fatto luce sul contributo dei singoli fattori dell&#39;ospite durante l&#39;infezione da brucella, ma siamo ancora lontani da una comprensione globale di tutto il processo. Qui, i protocolli che permettono l&#39;identificazione dei fattori dell&#39;ospite umani utilizzano su larga scala RNA interference (RNAi) di screening, in combinazione con automatizzato grande campo microscopia a fluorescenza e l&#39;analisi automatica delle immagini sono presentati. Reverse siRNA trasfezione di cellule HeLa viene eseguita come describEd in precedenza 10,11 con piccole modifiche. Il test endpoint copre gran parte del ciclo di vita intracellulare Brucella tranne l&#39;uscita e l&#39;infezione di cellule vicine. Per caratterizzare ulteriormente i risultati individuati nel test endpoint, un protocollo modificato per identificare fattori coinvolti nelle prime fasi di infezione viene utilizzato. Un ceppo abortus Brucella che esprime costitutivamente GFP è usato per il saggio finale in cui i batteri possono infettare le cellule per due giorni. Durante questo tempo, i batteri entrano nelle cellule, il traffico alla nicchia replicativa ER-derivato, e replicare nello spazio peri-nucleare. Gli alti livelli di segnale GFP possono poi essere utilizzati per rilevare in modo affidabile singole celle che contengono i batteri replicare. Per studiare voce Brucella in un saggio ad elevata prestazione, è importante essere in grado di distinguere tra batteri intracellulari ed extracellulari. Il metodo presentato qui circumvEnt anticorpi differenziale colorazione di batteri intracellulari ed extracellulari. Si basa su un ceppo Brucella esprime un GFP tetraciclina-inducibile in combinazione con espressione costitutiva DsRed. La presenza di un marcatore costitutiva DsRed consente l&#39;identificazione di tutti i batteri che sono presenti nel campione. GFP è indotta dall&#39;aggiunta del anhydrotetracycline atossico tetraciclina analogico (ATC) simultaneamente con inattivazione dei batteri extracellulari da gentamicina (Gm). Mentre la cellula-impermeabile antibiotico Gm uccide i batteri extracellulari, Atc può entrare nella cellula ospite e indurre l&#39;espressione della GFP selettivamente nei batteri intracellulari. Questa doppia giornalista permette la separazione solido di batteri intracellulari singoli (GFP e di segnale DsRed) da batteri extracellulari (solo segnale DsRed) usando la microscopia a grande campo. Al fine di raggiungere l&#39;espressione della GFP rilevabile con intracellulare Brucella abbiamo trovato che 4 ore di induzione da ATC si traduce in un reliil segnale in grado. Sistemi di induzione simili per esprimere selettivamente GFP nei batteri intracellulari è stato utilizzato in precedenza per studiare intracellulare Shigella 12.

<table><tbody><tr><td>Tryptic Soy Agar (TSA)</td><td>BD</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>Fluka</td><td>22092</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina solfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Latte</td><td></td><td></td><td></td>scremato</tr><tr><td>250 ml bottiglia con tappo a vite</td><td>Corning</td><td>8396</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetale Siero di vitello (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10270</td> Tripsina-EDTA <td>inattivata termicamente</td></tr><tr><td>(0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>10x soluzione madre, diluita 1:10 in PBS</td></tr><tr><td>Scepte 2.0 Cell Counter</td><td>Merck Milipore</td><td>PHCC20060</td><td>È possibile utilizzare dispositivi alternativi per il conteggio delle cellule</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Piastra a 384 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2062</td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio pelabile</td><td>Costar</td><td>6570</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser di reagenti: "Multidrop 384 Reagent Dispenser"</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840150</td><td>È possibile utilizzare un dispenser di reagenti alternativo.</td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione: "Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>Lavapiastre automatizzato: "Plate washer ELx50-16"</td><td>BioTek</td><td>ELX5016</td><td>Questa lavapiastre contiene un collettore a 16 canali adatto per piastre da 384 pozzetti. Si inserisce in una cabina di biosicurezza e ha un coperchio che copre la piastra durante il lavaggio, riducendo il rischio di produzione di aerosol. Potrebbero essere utilizzate rondelle per piastre alternative con caratteristiche simili.</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Anidrotetraciclina cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>100 &#956; g/ml di soluzione in etanolo al 100% viene mantenuto a -20 &deg; C protetto dalla luce in foglio</td></tr><tr><td>di alluminio PBS</td><td>Gibco</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Sciogliere in tampone HEPES 0,2 M, pH 7,4. Conservare a -20 &deg; C e scongelare fresco il giorno prima dell'uso. Attenzione, il PFA è tossico per inalazione, a contatto con la pelle e se ingerito.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Roche</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Scrambled siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>D-001810-10</td><td></td></tr><tr><td>Kif11 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-003317-00</td><td></td></tr><tr><td>ARPC3 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-005284-00</td><td></td></tr><tr><td>Brucella abortus 2308</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pJC43 (apHT::GFP)</td><td></td><td></td><td>Celli et al.12</td></tr><tr><td>pAC042.08 (apht::d sRed, tetO::tetR-GFP)</td><td></td><td></td><td>Costruzione: pJC44 4 è stato digerito con EcoRI seguito dalla generazione di estremità smussate con l'enzima Klenov e successiva digestione con SalI. TetR-GFP è stato amplificato da pNF106 utilizzando i primer prAC090 e prAC092. Dopo la digestione con SalI, il prodotto TetR-GFP è stato legato al vettore pJC44 digerito.</td></tr><tr><td>Primer prAC090</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG AAT TCT GGC AAT TCC GAC GTC TAA GAA ACC</td></tr><tr><td>Primer prAC092</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>TTT TTG TCG ACT TTG TCC TAC TCA GGA GAG CGT</td></tr><tr><td>TC HeLa CCL-2</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>IXM IMAGING MSCOPE</td><td>Microscopio automatizzato per imaging cellulare dotato di uno stadio Z motorizzato di precisione. Possono essere utilizzati sistemi alternativi per la microscopia automatizzata e componenti alternativi per l'hardware e il software specificati di seguito.</td></tr><tr>Dispositivi molecolari <td>con messa a fuoco automatica laser ad alta velocità</td><td>&nbsp;</td><td>1-2300-1037</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo CFI Super Fluor 10X</td><td>Nikon</td><td>MRF00100</td><td>N.A 0,50, W.D 1,20 mm, prisma DIC: 10X, fotometrico caricato a molla</td></tr><tr><td>CoolSNAP HQ Telecamera CCD monocromatica</td><td>Dispositivi molecolari&nbsp;</td><td>1-2300-1060</td><td>1.392 x 1.040 pixel di imaging, 6,45 x 6,45 e micro; m pixel, digitalizzazione a 12 bit</td></tr><tr><td>Software MetaXpress</td><td>Molecular Devices&nbsp;</td><td>9500-0100</td><td></td></tr><tr><td>LUI-Spectra-X-7</td><td>Lumencor</td><td>SPECTRA X V-XXX-YZ</td><td>Motore luminoso. Vengono utilizzate le seguenti sorgenti luminose: viola (DAPI), ciano (GFP), verde/giallo (RFP)</td></tr><tr><td>Eccitatore a banda singola per DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF01-377/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Emettitore a banda singola per DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF02-447/60-25</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico a banda singola per DAPI</td><td>Semrock</td><td>FF409-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Eccitatore a banda singola per GFP</td><td>Semrock</td><td>FF02-472/30-25</td><td></td></tr><tr><td>Emettitore a banda singola per GFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-520/35-25</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico a banda singola per GFP</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Eccitatore a banda singola per RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-562/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Emettitore a banda singola per RFP</td><td>Semrock</td><td>FF01-624/40-25</td><td></td></tr><tr><td>Dicroico a banda singola per RFP</td><td>Semrock</td><td>FF593-Di03-25x36</td><td></td></tr></tbody></table>

saggi microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; brucella</em&gt; l&#39;infezione di cellule hela

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Specie Brucella sono facoltativi patogeni intracellulari che infettano gli animali come i loro ospiti naturali. Trasmissione all&#39;uomo è più comunemente causata dal contatto diretto con animali infetti o per ingestione di alimenti contaminati e può portare a infezioni croniche gravi. Brucella può invadere fagociti professionali e non professionali e replica nel reticolo endoplasmatico (ER) vacuoli -derived. I fattori dell&#39;ospite richiesti per Brucella entrata in cellule ospiti, evitare la degradazione lisosomiale, e la replica nel vano ER-come rimangono in gran parte sconosciuti. Qui si descrivono due metodi per identificare i fattori di accoglienza che partecipano ingresso Brucella e replicazione in cellule HeLa. I protocolli descrivono l&#39;uso di RNA interferenza, mentre potrebbero essere applicati metodi di screening alternative. I saggi si basano sulla rilevazione di batteri fluorescente in cellule ospiti fluorescente con modalità automatizzatea livello di microscopia in campo. Le immagini fluorescenti vengono analizzati utilizzando un standardizzato di analisi di immagine pipeline in CellProfiler che permette singola infezione punteggio cell-based. Nel saggio finale, replica intracellulare è misurato due giorni dopo l&#39;infezione. Questo permette ai batteri di traffico al loro nicchia replicativa in cui viene avviata la proliferazione circa 12 ore dopo l&#39;entrata batterica. Brucella, che hanno stabilito con successo una nicchia intracellulare avranno così fortemente proliferato all&#39;interno delle cellule ospiti. Dal momento che i batteri intracellulari notevolmente più numerosi singoli batteri non replicativi extracellulari o intracellulari, un ceppo che esprime costitutivamente GFP può essere utilizzato. Il segnale GFP forte viene poi utilizzato per identificare le cellule infette. Al contrario, per il saggio voce è essenziale distinguere tra intracellulare e batteri extracellulari. Qui, si usa una codifica ceppo per un GFP tetraciclina-inducibile. Induzionedi GFP con inattivazione simultanea di batteri extracellulari dalla gentamicina consente la differenziazione tra intracellulare e batteri extracellulari basati sul segnale GFP, con solo batteri intracellulari poter esprimere GFP. Questo consente il rilevamento affidabile di singoli batteri intracellulari prima dell&#39;avvio proliferazione intracellulare.

La figura 1A mostra un esempio di analisi di immagini utilizzato per identificare automaticamente le cellule infettate nella prova endpoint. Nuclei di cellule HeLa colorati con DAPI sono stati identificati, sono stati calcolati un peri-nucleo di larghezza 8 pixel che circonda il nucleo, e un corpo di celle Voronoi per estensione del nucleo di 25 pixel. Poiché i batteri proliferano principalmente nello spazio peri-nucleare, l&#39;intensità GFP in questa zona della cella è...

Sono descritti due test per lo screening ad alto rendimento basato sulla microscopia dei fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione da Brucella. Il test di ingresso rileva i fattori dell'ospite necessari per l'ingresso in Brucella e il test dell'endpoint quelli necessari per la replicazione intracellulare. Sebbene applicabile per approcci alternativi, lo screening dei siRNA nelle cellule HeLa viene utilizzato per illustrare i protocolli.

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

L'obiettivo generale di questo saggio ad alta capacità basato sulla microscopia è identificare i fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione da Brucella delle cellule HeLa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'interazione ospite-patogeno, ad esempio identificando le proteine dell'ospite che promuovono o impediscono la colonizzazione da parte del patogeno intracellulare Brucella. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il flusso di lavoro semi-automatico, dalla preparazione in laboratorio all'analisi delle immagini, consente l'uso di robot e la realizzazione efficiente di esperimenti ad alto rendimento.Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni tra Brucella e l'ospite mediante schermate con siRNA. La maggior parte del protocollo può essere applicata ad altre strategie di screening. Ad esempio, o a librerie di siRNA.Dopo aver coltivato le cellule HeLa e preparato le piastre per lo screening con siRNA secondo il protocollo descritto, scongelare una piastra nera da 384 pozzetti mediante centrifugazione a 300 ×g e a temperatura ambiente per 20 minuti. Preparare il mezzo di trasfezione utilizzando dmem a temperatura ambiente senza FCS. Diluire il reagente di trasfezione uno a 200 e mescolare accuratamente prima dell'uso.Utilizzando un distributore di reagenti, aggiungere 25 microlitri di mezzo di trasfezione in ogni pozzetto della piastra a 384 pozzetti e mescolare le soluzioni spostando la piastra avanti e indietro. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora per consentire la formazione dei complessi tra l'RNAi e il reagente di trasfezione. Nel frattempo, preparare le cellule HeLa aspirando il mezzo di coltura e aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina 0,05% EDTA in PBS per lavare una volta le cellule subconfluenti di un fiasco da 75 centimetri quadrati.Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tripsina fresca e trasferire la fiasca a 37 gradi Celsius per due o tre minuti, fino a quando le cellule non assumono una forma arrotondata. Utilizzare 10 millilitri di DMEM pre-riscaldato con FCS al 60% per risospendere le cellule. Successivamente, utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule prima di preparare una sospensione cellulare di 10.000 cellule per millilitro in DMEM con FCS al 16%.Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto del reagente per la trasfezione, ottenendo 500 cellule per pozzetto. Muovere la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule.Quindi, lasciare la piastra a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti per consentire alle cellule di depositarsi. Sigillare la piastra con della pellicola parafilm. E incubarla in un incubatore umidificato su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius con 5% CO2 per 72 ore.Il lavoro con il patogeno di classe tre B. abortus è pericoloso e devono essere seguite le normative locali di biosicurezza, che includono l'uso di una tuta protettiva, guanti protettivi, mascherina e occhiali di protezione. Un giorno prima dell'infezione, inoculare la quantità precedentemente determinata di coltura iniziale di B. abortus in 50 millilitri di mezzo TSB KM. In un flacone da 250 millilitri con tappo a vite.Usare parafilm per sigillare la bottiglia e coltivare i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius e 100 giri al minuto su un agitatore fino a un'ottica densità 600 compresa tra 0,8 e 1,1. Misurare l'ottica densità 600 della coltura batterica. Preparare quindi il mezzo di infezione diluendo la coltura batterica in dmem con 10%FCS per ottenere la molteplicità di infezione desiderata.In alternativa, MOI. Utilizzando un lavatore automatico di piastre, sostituire il mezzo di trasfezione con 50 microlitri di mezzo di infezione. All'interno della cappa, trasferire la piastra nella gabbia della centrifuga e centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 400 ×g e a 4 gradi Celsius per 20 minuti.Quindi, sigillare la piastra con della pellicola parafilm e incubarla su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per quattro ore. Dopo l'incubazione, utilizzare il lavatore automatico di piastre e lavare le cellule con DMEM contenente il 10% di FCS e 100 microgrammi per millilitro di dentrimisina o GM per inattivare i batteri extracellulari. Quindi, sigillare nuovamente la piastra con della pellicola parafilm e riposizionarla sulla piastra di alluminio preriscaldata all'interno dell'incubatore per ulteriori 40 ore per il saggio finale.Per fissare le cellule, lavare prima le pozzette con PBS. Quindi, sostituire il PBS con 50 microlitri di PFA al 3,7% in 2 a pH 7,4.E incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare 50 microlitri di PBS per sostituire il mezzo di fissazione. Per colorare i campioni con il lavatore automatico di piastre, iniziare utilizzando 50 microlitri di Triton X-100 al 1% in PBS per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, aggiungere 50 microlitri di PBS contenente un microgrammo per millilitro di DAPI e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare le cellule tre volte con PBS prima di proteggerle dalla luce. Trasferire la piastra sul microscopio automatico.Impostare i parametri del microscopio. Selezionare l'obiettivo 10-X. Quindi selezionare il formato della piastra corrispondente alla piastra a 384 pozzetti.Acquisire nove punti per pozzetta. Selezionare l'opzione per abilitare la messa a fuoco basata sul laser. E mettere a fuoco il fondo della piastra e della pozzetta.Quindi, impostare il primo pozzetto acquisito come pozzetto iniziale per la ricerca del campione e tutti i punti per l'autofocus del sito. Successivamente, regolare manualmente l'offset Z per il fuoco sul canale DAPI. Quindi, premere Trova campione per impostare il fuoco sul fondo del pozzetto.Utilizzando la funzione AutoEsposizione, ottenere una buona stima del tempo di esposizione. Correggere manualmente il tempo di esposizione per il canale DAPI per garantire un'ampia gamma dinamica con bassa sovraesposizione. Utilizzare questo tempo di esposizione per acquisire immagini di diversi punti in tutta la piastra.E regolare manualmente il tempo di esposizione finché i pixel più luminosi raggiungono circa l'80% della luminosità massima nei siti. Ripetere i passaggi per impostare la messa a fuoco e il tempo di esposizione, rispettivamente per tutti gli altri canali. Quindi, avviare l'acquisizione dell'intera piastra.Per il saggio endpoint, utilizzare i canali DAPI e GFP per acquisire immagini dell'intera piastra. Per eseguire un'analisi delle immagini sulle cellule colorate nel saggio endpoint, dopo aver calcolato un modello di shading, selezionare nelle impostazioni di output sotto Visualizza la cartella di input contenente le immagini e una cartella di output per i risultati. Quindi, definire il testo comune presente nelle immagini e caricare i modelli di shading.Fare clic su Avvia modalità test e assicurarsi che l'impostazione di pausa e visualizzazione per tutti i moduli sia disabilitata. Abilitare l'impostazione di pausa e visualizzazione per il modulo nove ImageMath. Il simbolo di pausa abilitato apparirà in giallo.La funzione di visualizzazione abilitata apparirà come un occhio aperto. Successivamente, fare clic su Esegui per avviare l'analisi fino al modulo nove. Nel modulo nove, regolare il parametro moltiplica la seconda immagine per un valore che sopprima il segnale DAPI in Brucella senza sopprimere i nuclei.Per testare i valori del modulo, premere Passo. Fare clic con il tasto destro sull'immagine appena aperta e impostare il contrasto dell'immagine su logaritmico normalizzato. Tornare ripetutamente al modulo nove.Regolare il parametro per cui viene moltiplicata la seconda immagine ed eseguire nuovamente il modulo fino a quando il segnale di Brucella non è completamente soppresso, minimizzando al contempo le aree nere che indicano una sottrazione eccessiva. Individuare parametri adeguati per determinati moduli richiede un'ottimizzazione graduale dei parametri. È certamente importante eseguire ripetutamente i moduli, provando diversi valori e osservando l'effetto sul risultato visualizzato.Abilitare la pausa e la visualizzazione per il modulo 10. Identificare gli oggetti primari. Impostare il limite inferiore del parametro di soglia sufficientemente alto in modo che i nuclei vengano segmentati e lo sfondo venga ignorato.Per identificare un valore appropriato, passare il cursore sul modulo, quindi fare clic con il tasto destro sull'immagine di ingresso e visualizzare l'istogramma, in cui il picco indica tipicamente lo sfondo. A partire dall'intensità dello sfondo, aumentare il parametro fino a ottenere una buona segmentazione dei nuclei, come mostrato nell'immagine in uscita. L'obiettivo della pipeline di analisi delle immagini è identificare le cellule che contengono batteri in replicazione.Questo si ottiene impostando soglie diverse per il segnale del patogeno nel nucleo, nel peri-nucleo e nel corpo cellulare di Voronoi. Abilitare la pausa e la visualizzazione per il modulo 15. Filtrare gli oggetti, come mostrato in precedenza, e premere Esegui.Impostare il valore minimo del parametro sufficientemente alto in modo che vengano mantenute solo le cellule con Brucella chiaramente visibili nel nucleo, mentre tutte le altre vengono eliminate. Per identificare un valore appropriato, esaminare il modulo e visualizzare l'immagine risultante. Aumentare il valore progressivamente finché vengono mantenute solo le cellule con Brucella chiaramente visibili nel nucleo.Dopo aver filtrato le cellule contenenti batteri nella zona perinucleare e nel corpo cellulare di Voronoi nei moduli 16 e 17 secondo il protocollo descritto nel testo, esci dalla modalità di prova e deseleziona tutti i simboli dell'occhio accanto ai moduli per assicurarti che nessun modulo mostri la propria visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa. Infine, premi Analizza immagini per avviare l'analisi. Al termine dell'analisi, esamina le immagini PNG risultanti e il foglio di calcolo CSV per verificare che l'analisi abbia funzionato in modo affidabile su tutta la piastra.Eseguire il saggio di entrata e la valutazione dell'infezione seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra un esempio di analisi dell'immagine utilizzata per identificare automaticamente le cellule infette nel saggio a tempo finale. Sono state identificate le cellule HeLa i cui nuclei sono stati colorati con DAPI.Un peri-nucleo di una larghezza di otto pixel intorno al nucleo e un corpo cellulare di Voronoi, ottenuto estendendo il nucleo di 25 pixel, sono stati calcolati. Una cellula è stata considerata infetta se il segnale del patogeno superava la soglia corrispondente in almeno un compartimento.Brucella richiede riorganizzazioni dell'actina per un efficace coinvolgimento delle cellule ospiti. Pertanto, l'esaurezione di ARP23 rappresenta un controllo positivo adatto per lo screening con siRNA. L'esaurezione di ARPC3 ha ridotto il numero di cellule con batteri in proliferazione due giorni dopo l'infezione.Rispetto alle cellule di controllo trattate con sequenza scramblata. L'analisi automatica delle immagini ha osservato in modo quantificabile una diminuzione dell'infezione nelle cellule HeLa prive di ARPC3 rispetto alle cellule di controllo in questo grafico. L'esaurimento di ARPC3 ha mostrato anche una riduzione dell'infezione da Brucella nel saggio di ingresso rispetto alle cellule di controllo.Come evidenziato dal ridotto numero di Brucella intracellulari mostrato in giallo. Infine, la quantificazione dell'infezione mediante analisi automatizzata delle immagini ha confermato che il numero di cellule infette, così come il numero di batteri intracellulari nelle cellule infette, era diminuito a seguito dell'abbattimento di ARPC3. Una volta acquisita padronanza, questo protocollo può fornire risultati dell'analisi delle immagini entro una settimana e mezza dall'inizio dell'esperimento.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante esaminare attentamente i risultati dell'analisi delle immagini per assicurarsi che i parametri scelti funzionino correttamente in tutta la piastra. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'immagine in tempo reale di cellule vive, al fine di rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, quando si studia il traffico intracellulare, un determinato fattore dell'ospite interagisce con Brucella.O in che modo l'abbassamento di un gene influisce sulla dinamica intracellulare dell'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle infezioni per esplorare i fattori dell'ospite necessari all'infezione da Brucella in un saggio su cellule HeLa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare i fattori dell'ospite che promuovono o impediscono il colonizzazione riuscita delle cellule HeLa da parte del patogeno intracellulare Brucella abortus.Ricordare che lavorare con Brucella abortus può essere estremamente pericoloso e che è necessario seguire rigorosamente le normative locali sulla biosicurezza.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Casanova, A., et al. Analisi basate su microscopia per lo screening ad alto rendimento dei fattori ospiti coinvolti nell'infezione da Brucella nelle cellule hela. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra l'imaging ad alto rendimento dell'infezione da Brucella abortus nelle cellule epiteliali con knockdown STING mediato da siRNA per indagare il ruolo del DNA citosolico nella replicazione batterica intracellulare e nella risposta immunitaria innata dell'ospite.

Imaging ad alto rendimento dell'infezione intracellulare da Brucella abortus nelle cellule epiteliali dell'ospite

Si descrive un metodo per l'inseguimento della rottura endomembrane suscitato dai batteri...

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Descriviamo un metodo di microscopia correlativa che combina 3D live-cell microscopia a luce fluorescente ad alta velocità e la tomografia crio-elettroni ad alta risoluzione. Dimostriamo la capacità del metodo correlativo di imaging dinamico, piccoli HIV-1 particelle interagiscono con le cellule HeLa ospitanti.

Microscopia correlativa per l&#39;analisi strutturale 3D di Interazioni Dinamiche

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Coxiella burnetii è un batterio Gram-negativi obbligato intracellulare responsabile della zoonotici malattia febbre Q. Qui si descrivono i metodi per la generazione di Coxiella mutanti di trasposoni fluorescente nonché l'identificazione automatizzata e l'analisi dei risultanti internalizzazione, replica e citotossici fenotipi.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Presentiamo in questo studio un test basato sulla fluorescenza romanzo utilizzando linfociti derivati ​​da un topo transgenico. Questo test è adatto per high-throughput screening (HTS) di piccole molecole dotate di capacità di una inibizione o la promozione di attivazione dei linfociti.

Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

Abbiamo sviluppato un test multi-pozzetto formato poliacrilammide per sondare l'effetto di rigidità di matrice extracellulare sull'infezione batterica delle cellule aderenti. Questo test è compatibile con citometria a flusso, immunostaining e microscopia di forza di trazione, permettendo per la misurazione quantitativa delle interazioni biomeccaniche tra cellule, loro matrice extracellulare e batteri patogeni.

Un'analisi di poliacrilammide-basata di formato multi-pozzetto per studiare l'effetto della matrice extracellulare rigidità sull'infezione batterica delle cellule aderenti

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Scopri saggi di screening ad alto rendimento basati su microscopia per identificare fattori ospite coinvolti nell'infezione di cellule HeLa da parte di Brucella. Questo metodo semi-automatizzato utilizza siRNA per accelerare la scoperta di proteine chiave.

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano Brucella Linfezione di cellule HeLa (Video) | JoVE Journal

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