Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano

L'obiettivo generale di questo saggio ad alta capacità basato sulla microscopia è identificare i fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione da Brucella delle cellule HeLa. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'interazione ospite-patogeno, ad esempio identificando le proteine dell'ospite che promuovono o impediscono la colonizzazione da parte del patogeno intracellulare Brucella. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il flusso di lavoro semi-automatico, dalla preparazione in laboratorio all'analisi delle immagini, consente l'uso di robot e la realizzazione efficiente di esperimenti ad alto rendimento.

Pertanto, questo metodo può fornire informazioni sulle interazioni tra Brucella e l'ospite mediante schermate con siRNA. La maggior parte del protocollo può essere applicata ad altre strategie di screening. Ad esempio, o a librerie di siRNA.

Dopo aver coltivato le cellule HeLa e preparato le piastre per lo screening con siRNA secondo il protocollo descritto, scongelare una piastra nera da 384 pozzetti mediante centrifugazione a 300 ×g e a temperatura ambiente per 20 minuti. Preparare il mezzo di trasfezione utilizzando dmem a temperatura ambiente senza FCS. Diluire il reagente di trasfezione uno a 200 e mescolare accuratamente prima dell'uso.

Utilizzando un distributore di reagenti, aggiungere 25 microlitri di mezzo di trasfezione in ogni pozzetto della piastra a 384 pozzetti e mescolare le soluzioni spostando la piastra avanti e indietro. Incubare la piastra a temperatura ambiente per un'ora per consentire la formazione dei complessi tra l'RNAi e il reagente di trasfezione. Nel frattempo, preparare le cellule HeLa aspirando il mezzo di coltura e aggiungendo 2,5 millilitri di tripsina 0,05% EDTA in PBS per lavare una volta le cellule subconfluenti di un fiasco da 75 centimetri quadrati.

Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tripsina fresca e trasferire la fiasca a 37 gradi Celsius per due o tre minuti, fino a quando le cellule non assumono una forma arrotondata. Utilizzare 10 millilitri di DMEM pre-riscaldato con FCS al 60% per risospendere le cellule. Successivamente, utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule prima di preparare una sospensione cellulare di 10.000 cellule per millilitro in DMEM con FCS al 16%.

Aggiungere 50 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto del reagente per la trasfezione, ottenendo 500 cellule per pozzetto. Muovere la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente le cellule.

Quindi, lasciare la piastra a temperatura ambiente per cinque-dieci minuti per consentire alle cellule di depositarsi. Sigillare la piastra con della pellicola parafilm. E incubarla in un incubatore umidificato su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius con 5% CO2 per 72 ore.

Il lavoro con il patogeno di classe tre B. abortus è pericoloso e devono essere seguite le normative locali di biosicurezza, che includono l'uso di una tuta protettiva, guanti protettivi, mascherina e occhiali di protezione. Un giorno prima dell'infezione, inoculare la quantità precedentemente determinata di coltura iniziale di B. abortus in 50 millilitri di mezzo TSB KM. In un flacone da 250 millilitri con tappo a vite.

Usare parafilm per sigillare la bottiglia e coltivare i batteri durante la notte a 37 gradi Celsius e 100 giri al minuto su un agitatore fino a un'ottica densità 600 compresa tra 0,8 e 1,1. Misurare l'ottica densità 600 della coltura batterica. Preparare quindi il mezzo di infezione diluendo la coltura batterica in dmem con 10%FCS per ottenere la molteplicità di infezione desiderata.

In alternativa, MOI. Utilizzando un lavatore automatico di piastre, sostituire il mezzo di trasfezione con 50 microlitri di mezzo di infezione. All'interno della cappa, trasferire la piastra nella gabbia della centrifuga e centrifugare la piastra a 384 pozzetti a 400 ×g e a 4 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, sigillare la piastra con della pellicola parafilm e incubarla su una piastra di alluminio preriscaldata a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 per quattro ore. Dopo l'incubazione, utilizzare il lavatore automatico di piastre e lavare le cellule con DMEM contenente il 10% di FCS e 100 microgrammi per millilitro di dentrimisina o GM per inattivare i batteri extracellulari. Quindi, sigillare nuovamente la piastra con della pellicola parafilm e riposizionarla sulla piastra di alluminio preriscaldata all'interno dell'incubatore per ulteriori 40 ore per il saggio finale.

Per fissare le cellule, lavare prima le pozzette con PBS. Quindi, sostituire il PBS con 50 microlitri di PFA al 3,7% in 2 a pH 7,4.

E incubare le cellule a temperatura ambiente per 20 minuti. Dopo l'incubazione, utilizzare 50 microlitri di PBS per sostituire il mezzo di fissazione. Per colorare i campioni con il lavatore automatico di piastre, iniziare utilizzando 50 microlitri di Triton X-100 al 1% in PBS per 10 minuti per permeabilizzare le cellule.

Dopo aver lavato le cellule tre volte con PBS, aggiungere 50 microlitri di PBS contenente un microgrammo per millilitro di DAPI e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare le cellule tre volte con PBS prima di proteggerle dalla luce. Trasferire la piastra sul microscopio automatico.

Impostare i parametri del microscopio. Selezionare l'obiettivo 10-X. Quindi selezionare il formato della piastra corrispondente alla piastra a 384 pozzetti.

Acquisire nove punti per pozzetta. Selezionare l'opzione per abilitare la messa a fuoco basata sul laser. E mettere a fuoco il fondo della piastra e della pozzetta.

Quindi, impostare il primo pozzetto acquisito come pozzetto iniziale per la ricerca del campione e tutti i punti per l'autofocus del sito. Successivamente, regolare manualmente l'offset Z per il fuoco sul canale DAPI. Quindi, premere Trova campione per impostare il fuoco sul fondo del pozzetto.

Utilizzando la funzione AutoEsposizione, ottenere una buona stima del tempo di esposizione. Correggere manualmente il tempo di esposizione per il canale DAPI per garantire un'ampia gamma dinamica con bassa sovraesposizione. Utilizzare questo tempo di esposizione per acquisire immagini di diversi punti in tutta la piastra.

E regolare manualmente il tempo di esposizione finché i pixel più luminosi raggiungono circa l'80% della luminosità massima nei siti. Ripetere i passaggi per impostare la messa a fuoco e il tempo di esposizione, rispettivamente per tutti gli altri canali. Quindi, avviare l'acquisizione dell'intera piastra.

Per il saggio endpoint, utilizzare i canali DAPI e GFP per acquisire immagini dell'intera piastra. Per eseguire un'analisi delle immagini sulle cellule colorate nel saggio endpoint, dopo aver calcolato un modello di shading, selezionare nelle impostazioni di output sotto Visualizza la cartella di input contenente le immagini e una cartella di output per i risultati. Quindi, definire il testo comune presente nelle immagini e caricare i modelli di shading.

Fare clic su Avvia modalità test e assicurarsi che l'impostazione di pausa e visualizzazione per tutti i moduli sia disabilitata. Abilitare l'impostazione di pausa e visualizzazione per il modulo nove ImageMath. Il simbolo di pausa abilitato apparirà in giallo.

La funzione di visualizzazione abilitata apparirà come un occhio aperto. Successivamente, fare clic su Esegui per avviare l'analisi fino al modulo nove. Nel modulo nove, regolare il parametro moltiplica la seconda immagine per un valore che sopprima il segnale DAPI in Brucella senza sopprimere i nuclei.

Per testare i valori del modulo, premere Passo. Fare clic con il tasto destro sull'immagine appena aperta e impostare il contrasto dell'immagine su logaritmico normalizzato. Tornare ripetutamente al modulo nove.

Regolare il parametro per cui viene moltiplicata la seconda immagine ed eseguire nuovamente il modulo fino a quando il segnale di Brucella non è completamente soppresso, minimizzando al contempo le aree nere che indicano una sottrazione eccessiva. Individuare parametri adeguati per determinati moduli richiede un'ottimizzazione graduale dei parametri. È certamente importante eseguire ripetutamente i moduli, provando diversi valori e osservando l'effetto sul risultato visualizzato.

Abilitare la pausa e la visualizzazione per il modulo 10. Identificare gli oggetti primari. Impostare il limite inferiore del parametro di soglia sufficientemente alto in modo che i nuclei vengano segmentati e lo sfondo venga ignorato.

Per identificare un valore appropriato, passare il cursore sul modulo, quindi fare clic con il tasto destro sull'immagine di ingresso e visualizzare l'istogramma, in cui il picco indica tipicamente lo sfondo. A partire dall'intensità dello sfondo, aumentare il parametro fino a ottenere una buona segmentazione dei nuclei, come mostrato nell'immagine in uscita. L'obiettivo della pipeline di analisi delle immagini è identificare le cellule che contengono batteri in replicazione.

Questo si ottiene impostando soglie diverse per il segnale del patogeno nel nucleo, nel peri-nucleo e nel corpo cellulare di Voronoi. Abilitare la pausa e la visualizzazione per il modulo 15. Filtrare gli oggetti, come mostrato in precedenza, e premere Esegui.

Impostare il valore minimo del parametro sufficientemente alto in modo che vengano mantenute solo le cellule con Brucella chiaramente visibili nel nucleo, mentre tutte le altre vengono eliminate. Per identificare un valore appropriato, esaminare il modulo e visualizzare l'immagine risultante. Aumentare il valore progressivamente finché vengono mantenute solo le cellule con Brucella chiaramente visibili nel nucleo.

Dopo aver filtrato le cellule contenenti batteri nella zona perinucleare e nel corpo cellulare di Voronoi nei moduli 16 e 17 secondo il protocollo descritto nel testo, esci dalla modalità di prova e deseleziona tutti i simboli dell'occhio accanto ai moduli per assicurarti che nessun modulo mostri la propria visualizzazione prima di eseguire l'analisi completa. Infine, premi Analizza immagini per avviare l'analisi. Al termine dell'analisi, esamina le immagini PNG risultanti e il foglio di calcolo CSV per verificare che l'analisi abbia funzionato in modo affidabile su tutta la piastra.

Eseguire il saggio di entrata e la valutazione dell'infezione seguendo il protocollo descritto nel testo. Questa figura mostra un esempio di analisi dell'immagine utilizzata per identificare automaticamente le cellule infette nel saggio a tempo finale. Sono state identificate le cellule HeLa i cui nuclei sono stati colorati con DAPI.

Un peri-nucleo di una larghezza di otto pixel intorno al nucleo e un corpo cellulare di Voronoi, ottenuto estendendo il nucleo di 25 pixel, sono stati calcolati. Una cellula è stata considerata infetta se il segnale del patogeno superava la soglia corrispondente in almeno un compartimento.

Brucella richiede riorganizzazioni dell'actina per un efficace coinvolgimento delle cellule ospiti. Pertanto, l'esaurezione di ARP23 rappresenta un controllo positivo adatto per lo screening con siRNA. L'esaurezione di ARPC3 ha ridotto il numero di cellule con batteri in proliferazione due giorni dopo l'infezione.

Rispetto alle cellule di controllo trattate con sequenza scramblata. L'analisi automatica delle immagini ha osservato in modo quantificabile una diminuzione dell'infezione nelle cellule HeLa prive di ARPC3 rispetto alle cellule di controllo in questo grafico. L'esaurimento di ARPC3 ha mostrato anche una riduzione dell'infezione da Brucella nel saggio di ingresso rispetto alle cellule di controllo.

Come evidenziato dal ridotto numero di Brucella intracellulari mostrato in giallo. Infine, la quantificazione dell'infezione mediante analisi automatizzata delle immagini ha confermato che il numero di cellule infette, così come il numero di batteri intracellulari nelle cellule infette, era diminuito a seguito dell'abbattimento di ARPC3. Una volta acquisita padronanza, questo protocollo può fornire risultati dell'analisi delle immagini entro una settimana e mezza dall'inizio dell'esperimento.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante esaminare attentamente i risultati dell'analisi delle immagini per assicurarsi che i parametri scelti funzionino correttamente in tutta la piastra. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come l'immagine in tempo reale di cellule vive, al fine di rispondere a ulteriori domande. Ad esempio, quando si studia il traffico intracellulare, un determinato fattore dell'ospite interagisce con Brucella.

O in che modo l'abbassamento di un gene influisce sulla dinamica intracellulare dell'infezione. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle infezioni per esplorare i fattori dell'ospite necessari all'infezione da Brucella in un saggio su cellule HeLa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare i fattori dell'ospite che promuovono o impediscono il colonizzazione riuscita delle cellule HeLa da parte del patogeno intracellulare Brucella abortus.

Ricordare che lavorare con Brucella abortus può essere estremamente pericoloso e che è necessario seguire rigorosamente le normative locali sulla biosicurezza.