Wet Chimica e Peptide immobilizzazione su politetrafluoroetilene per Miglioramento di adesione cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un trattamento superficiale basato sulla chimica umida per il polimero floreale di carbonio politetrafluoroetilene, o PTFE. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei biomateriali come migliorare la biocompatibilità dei polimeri medici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è richiesta solo un'attrezzatura minima e che il metodo è più generalmente applicabile rispetto ad altri metodi.

La preparazione della soluzione di naftalenide di sodio necessita di condizioni strettamente anirde. Tagliare 0,25 grammi di sodio metallico in piccoli pezzi per migliorare la dissoluzione. Aggiungere il sodio metallico a una soluzione di 1,4 grammi di naftelina in 20 millilitri di tetraidrofurano in un flacone di vetro da 100 millilitri con tappo a vite, dotato di un'ancoretta magnetica rivestita in PTFE.

Riscaldare modestamente la soluzione per migliorare ulteriormente la dissoluzione. La soluzione finale ha un colore scuro, leggermente verdastro, e può essere conservata in condizioni rigorosamente asciutte. Perforare dischi in PTFE di 12 millimetri di diametro da un foglio di 0,5 millimetri di spessore.

Segnare un lato e pulire è l'iso-propanolo. Incubare i campioni di PTFE singolarmente nella soluzione attivante per uno o due minuti, utilizzando una pinza. Il cambiamento di colore dal bianco al marrone scuro indica il successo del trattamento.

Successivamente risciacquare due volte con THF e poi con iso-propanolo. Ossidare i campioni trattati in perossido di idrogeno al 30%, contenente il 20% di acido tricloroacedico per tre ore. Lavare con acqua e asciugare.

La superficie ha ora un leggero aspetto brunastro. Trattare i dischi ossidati con il 50% di HMDI in THF secco per due ore. Quindi, risciacquare con THF e lasciare asciugare.

Infine, idrolizzare i campioni contenenti isocianato in acqua per due o tre ore e asciugarli. Posizionare ciascun disco amminato con il lato contrassegnato rivolto verso l'alto nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 1,5 millilitri di soluzione epossidica, garantendo la copertura completa dei campioni.

Dopo l'incubazione per due ore, lavare due volte con acqua e una volta con tampone carbonato. Sul fondo dei singoli pozzetti di una piastra fresca a 24 pozzetti, aggiungere 50 microlitri di peptide da 0,5 milligrammi per millilitro e 50 millimolari di tampone carbonato, pH nove, contenente lo 0,1% di azoturo di sodio. Posizionare con cura i dischi funzionalizzati con resina epossidica capovolti sulle gocce della soluzione peptidica.

Assicurarsi che lo spazio tra il fondo di un pozzetto e il disco in PTFE sia completamente bagnato a causa dell'azione capillare. Incubare la piastra per almeno tre ore, o per una notte in una camera umida con atmosfera umidificata, posizionando carta velina bagnata sul fondo della camera. Dopo l'incubazione, lavare tre volte con acqua e sterilizzare in acqua iso-propanolo al 50% per almeno 30 minuti.

Prima della semina cellulare, come descritto nel protocollo di testo, sciacquare i campioni in soluzione salina sterile tamponata con fosfato. I risultati delle fasi cruciali della reazione chimica sono stati monitorati mediante spettroscopia a infrarossi. L'attivazione iniziale con la naftalamide di sodio genera doppi legami e, in misura minore, funzionalità ossidrilici.

Il segnale che indica i doppi legami del carbonio scompare con l'ossidazione, producendo una superficie che porta quasi esclusivamente gruppi ossidrilici. I cambiamenti di colore dovuti all'attivazione e all'ossidazione sono in accordo con la chimica prevista. Ci si aspetta che i sistemi di doppio legame coniugati siano brunastri e la perdita dei sistemi di doppio legame provoca uno schiarimento.

Inoltre, è stato studiato il possibile esito dell'attivazione e dell'ossidazione sulla morfologia superficiale mediante microscopia elettronica a scansione. Praticamente non è stato osservato alcun effetto dannoso del trattamento. L'immobilizzazione del peptide adesivo delle cellule endoteliali, arginina, glutammina, valina dell'acido aspartico, sulla superficie del polimero, supporta la crescita delle cellule endoteliali.

Mentre praticamente non si verifica alcuna adesione e proliferazione cellulare su materiale non trattato, la modifica supporta fortemente la colonizzazione per un periodo di due settimane. Esemplificato per un'applicazione clinica, la modifica è stata eseguita in modo identico su materiale originale da un innesto disponibile in commercio in PTFE espanso con risultati simili per un periodo di una settimana. Una volta padroneggiata, questa tecnica richiede circa 12 ore.

Va tenuto presente che questa procedura è specifica per il PTFE. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come attivare il PTFE in superficie e come immobilizzare i peptidi nei passaggi successivi. Seguendo questa procedura, altre molecole, come i polisaccaridi o i fattori del cordone ombelicale, possono essere immobilizzate in modo simile.

Tieni presente che lavorare con sostanze chimiche altamente tossiche e corrosive è pericoloso e che devono essere prese le precauzioni standard.