Protocollo per la conversione diretta dei fibroblasti murini embrionali in trofoblasto cellule staminali

L'obiettivo generale di questa procedura è generare cellule staminali del trofoblasto indotte in buona fede o iTSC da fibroblasti murini. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali riguardo alla natura della barriera che separa il lignaggio embrionale da quello extraembrionale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'espressione transgenica viene attivata solo transitoriamente, facilitando la selezione di cellule convertite stabilmente.

In un laboratorio di biosicurezza di livello due utilizzando gli appropriati dispositivi di protezione individuale, coprire cinque piastre da 100 millilitri con cinque millilitri di soluzione di poli-L-lisina, facendo oscillare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente la soluzione di rivestimento. Metti le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi aspira la poli-L-lisina e sciacqua le stoviglie una volta con PBS. Successivamente, piastrate sette volte da 10 a 293 cellule T per piatto in 10 millilitri di terreno di 293 cellule T, agitate le piastre per distribuire uniformemente le cellule e rimettete le piastre nell'incubatore.

La mattina successiva, sostituire il terreno di coltura con cinque millilitri di terreno di trasfezione. Quindi trattare le colture con sei microlitri di una soluzione di clorochina 1000X e riposizionare le piastre nell'incubatore a 37 gradi Celsius. Per preparare la miscela di trasfezione, per ogni vettore lentivirale, aggiungere 600 microlitri di soluzione di DNA lentivettore goccia a goccia in 600 microlitri di soluzione salina tamponata 2X HEPES durante il vorticing e incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente.

Dopo 15 minuti, aggiungere con molta attenzione la miscela goccia a goccia alle 293 cellule T preparate e rimettere le piastre nell'incubatore. Dopo cinque o sei ore, sostituire il terreno con 10 millilitri di terreno di produzione del virus e riposizionare le piastre nell'incubatore. La mattina seguente, sostituire con cura il terreno con sette millilitri di terreno di produzione del virus fresco per un'altra incubazione notturna.

Quindi, trasferire il terreno da ciascuna piastra in singole provette coniche da 15 millilitri e aggiungere sette millilitri di terreno di produzione di virus freschi sulle piastre per un'altra incubazione notturna. La mattina successiva, raccogliere il secondo lotto di terreno contenente virus, raggruppando il surnatante con il primo lotto di virus e filtrare il terreno contenente virus attraverso un filtro a membrana in acetato di cellulosa privo di tensioattivi da 0,45 micron per la conservazione in Aliquote da 500 microlitri a meno 80. Per convertire i fibroblasti in cellule staminali del trofoblasto indotto, lavare i fibroblasti embrionali di massa trasdotta o MEF due volte con due millilitri di PBS.

Quindi staccare le cellule con 0,5 millilitri di soluzione di tripsina EDTA a 37 gradi Celsius. Dopo tre o quattro minuti, confermare che le cellule si sono sollevate dalla piastra al microscopio invertito e quindi attivare la tripsina con un millilitro di terreno TS. Trasferire le sospensioni cellulari in singole provette coniche da 15 millilitri e centrifugare le cellule.

Quindi risospendere i pellet in due millilitri di terreno TS e impiattare due volte da 10 al quinto fattore quattro mCherry o controllare i MEF non trasdotti per piatto da 100 millilitri in 10 millilitri di terreno TS contenente fattore di crescita dei fibroblasti quattro ed eparina integrata con doxiciclina per la coltura notturna. Il giorno successivo, al microscopio a epifluorescenza, utilizzare l'espressione della proteina mCherry per stimare l'efficienza di trasduzione. Se l'efficienza di trasduzione è di circa il 100%, rimettere le colture nell'incubatrice, cambiando il terreno in tutte le piastre a giorni alterni fino al giorno 10.

Successivamente, nutrire le cellule con terreno TS fresco contenente fattore di crescita dei fibroblasti quattro ed eparina senza doxiciclina utilizzando il microscopio invertito per monitorare l'aspetto delle aree transdifferenziate sulla piastra dei quattro fattori per un massimo di tre settimane. L'identificazione delle aree transdifferenziate è fondamentale, poiché a questo punto, i MEF non assomigliano morfologicamente alle cellule staminali del trofoblasto. Cerca le colonie densamente ammucchiate adiacenti alle cellule giganti del trofoblasto, identificate dalle dimensioni delle cellule e dal grande nucleo.

Per isolare le singole linee iTSC, pulire prima il microscopio invertito con etanolo al 70% per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione batterica. Quindi, aggiungere 40 microlitri di tripsina EDTA allo 05% in 12 pozzetti di una piastra a pozzetti inferiori da 96 U e posizionare la piastra sul ghiaccio. Ora aspirare il terreno dalla piastra di transdifferenziazione MEF dei quattro fattori e lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS.

Dopo il lavaggio, aggiungere 10 millilitri di PBS fresco alle cellule e posizionare la piastra sul tavolino del microscopio invertito. Utilizzando una pipetta da 100 microlitri impostata su 40 microlitri, circondare ogni singola colonia con la punta della pipetta e aspirare la colonia galleggiante risultante. Trasferire ogni colonia nei singoli pozzetti della piastra a 96 pozzetti fino a quando non sono state prelevate 12 colonie.

Quindi incubare le colonie a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, dissociare le cellule con il pipettaggio e trasferire le sospensioni cellulari in pozzetti individuali di una piastra da 24 pozzetti contenente 500 microlitri di TS completo più fattore di crescita dei fibroblasti e terreno di eparina per la coltura notturna. Il giorno successivo, sostituire il terreno con un TS completo fresco più fattore di crescita dei fibroblasti e terreno di eparina per rimuovere le cellule morte e rimettere la piastra nell'incubatore.

Monitoraggio quotidiano delle colture per la comparsa di colonie epiteliali con confini luminosi. Quando si osservano le colonie, coltivare le cellule per un massimo di una settimana o fino a quando non sono confluenti al 70%. Nelle colture in cui è attivata l'espressione del transgene del quattro fattori, le cellule cambiano rapidamente morfologia.

Intorno ai giorni 14-21, emergono aree transdifferenziate distinte. Queste colonie primarie mancano della tipica morfologia delle cellule staminali del trofoblasto, tuttavia, una volta che sono state subcoltivate, si osserva una caratteristica morfologia epiteliale con bordi stretti e bordi luminosi, che ricorda molto le cellule staminali del trofoblasto in buona fede. Quando le cellule staminali del trofoblasto indotte dai quattro fattori rimangono positive per il fattore di trascrizione del trofoblasto, Cdx2 e Tfap2c, l'idea di queste linee può essere utilizzata per successive analisi in vitro o in vivo.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei settimane se eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'iniezione assistita da sabbiatura per rispondere a ulteriori domande sul potenziale di chimerizzazione delle iTSC generate. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segregazione precoce del lignaggio per esplorare la conversione del destino cellulare embrionale rispetto a quella extraembrionale nei topi.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come convertire direttamente i nuovi fibroblasti embrionali in cellule staminali del trofoblasto indotto. Non dimenticare che lavorare con i vettori lentivirali può essere estremamente pericoloso e che devono essere sempre seguite precauzioni come l'uso di procedure di lavoro appropriate di livello di sicurezza biologica due.