Preparazione core tessuto inclusi in paraffina fissati in formalina per entrambi RNA e DNA Extraction

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di estrarre in sequenza RNA e DNA da nuclei di tessuto d'archivio fissati in formalina e inclusi in paraffina. Si tratta di un protocollo per la raccolta di nuclei di tessuto da cui estrarremo sia l'RNA che il DNA. Il vantaggio principale di questo protocollo è che migliora la resa di RNA e DNA da regioni mirate con precisione nel blocco tissutale.

Questa procedura è in gran parte sviluppata nei tessuti di cancro alla prostata d'archivio. Può essere applicato anche ad altri tipi di tessuti d'archivio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di carotaggio dei tessuti non sono comunemente utilizzate nei laboratori di ricerca.

La maggior parte dei laboratori di ricerca utilizza invece sezioni trasversali, che esauriscono i tessuti più velocemente e aggiungono una significativa eterogeneità al campione. Inizia esaminando il vetrino del microscopio e delineando la regione di interesse utilizzando un pennarello indelebile a punta fine. Quindi, tagliare una sezione di pellicola di paraffina abbastanza grande da coprire la regione di interesse sul vetrino del microscopio.

Quindi, posizionare saldamente la pellicola sul vetrino, avvolgendo la pellicola sui bordi per evitare che scivoli. Utilizzando un pennarello indelebile a punta fine, delinea l'intero tessuto e la regione di interesse all'interno del tessuto. Successivamente, rimuovere la pellicola dal vetrino e trasferirla nel blocco di tessuto corrispondente.

Orientare la pellicola capovolgendola o ruotandola in modo che il contorno dell'intero tessuto corrisponda alla forma osservata del tessuto nel blocco. Premere saldamente la sezione della pellicola sulla superficie del blocco per evitare lo slittamento. Usando la punta del pennarello indelebile, fai delle rientranze poco profonde ma visibili lungo il contorno della regione di interesse e poi rimuovi la pellicola.

Quindi, pulire il punzone del recettore dal set di punzoni da 0,6 millimetri immergendo la punta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di candeggina e facendo scorrere il punzone su e giù più volte. Ripetere il lavaggio con il tubo contenente il 70% di etanolo, quindi con acqua. Ora premere il punzone pulito nella regione di interesse a una profondità di tre millimetri e ritirare.

Rilasciare il nucleo in una provetta da microcentrifuga a basso legame spingendolo fuori dal punzone con lo stilo. Aggiungere un millilitro di xilene ai tubi per microfughe contenenti i nuclei di tessuto e agitare energicamente per dieci secondi. Quindi mettere in un blocco di calore impostato a 50 gradi Celsius per tre minuti.

Dopo l'incubazione, centrifugare per due minuti a temperatura ambiente alla massima velocità. Dopo la centrifugazione, posizionare i torsoli sul ghiaccio per cinque minuti per solidificare il residuo ceroso. Ora, rimuovi con cura la paraffina che si è accumulata attorno al menisco insieme al surnatante usando la punta di una pipetta.

Quindi, ripetere il trattamento con xilene. Dopo aver rimosso la miscela di paraffina xilene, aggiungere un millilitro di etanolo al 100% e agitare energicamente per dieci secondi. Dopo aver centrifugato alla massima velocità per due minuti, scartare con cura l'etanolo.

Ripetere ancora una volta il lavaggio con etanolo prima di iniziare l'omogeneizzazione. Risospendere i nuclei deparaffinizzati in 700 microlitri di etanolo al 100% prima dell'omogeneizzazione. Utilizzare un omogeneizzatore di tessuti motorizzato a un'impostazione media per macinare i nuclei in particelle fini.

Per ottenere una resa ottimale di DNA e RNA è necessaria un'accurata omogeneizzazione dei nuclei di tessuto. Quindi, riempire provette separate da 15 millilitri con circa dieci millilitri di candeggina, soluzione neutralizzante RNasi ed etanolo al 70%. Dopo l'omogeneizzazione del campione, lavare la sonda dell'omogeneizzatore in ciascuna delle soluzioni detergenti in ordine.

Far funzionare l'omogeneizzatore alla massima velocità durante la fase di lavaggio. Pulire la sonda con un fazzoletto e lasciare che la sonda si asciughi completamente prima di omogeneizzare il campione successivo. Ispezionare visivamente le lame della sonda per verificare la presenza di pezzi di tessuto residui e, se trovati, pulire nuovamente la sonda.

Dopo l'omogeneizzazione, portare il volume del campione a un millilitro con etanolo al 100%, quindi centrifugare alla massima velocità per 15 minuti. Aspirare con cura l'etanolo e asciugare all'aria i pellet per circa 15-20 minuti prima di iniziare l'estrazione della proteinasi K. Risospendere i pellet in 150 microlitri di tampone di digestione proteinasi K e muovere i tubi per allentare il pellet.

La digestione notturna della proteinasi K è consigliata per un maggiore recupero del DNA. Aggiungere 10 microlitri di proteinasi K stabile alla temperatura e mescolare mescolando con un colpo. Incubare a 56 gradi Celsius per 15 minuti con una leggera agitazione.

Incubare le provette con ghiaccio per tre minuti. Dopo il raffreddamento, centrifugare la provetta per 15 minuti alla massima velocità. Successivamente, senza disturbare i pellet, trasferire con cura ciascun surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga per la purificazione dell'RNA.

Estrarre l'RNA e il DNA utilizzando la procedura ottimizzata nel protocollo scritto, che include un tempo di digestione dei tessuti prolungato per l'estrazione del DNA. L'RNA e il DNA possono essere recuperati da vecchi campioni di tessuto fissati in formalina e inclusi in paraffina utilizzando questo metodo. Gli acidi nucleici sono stati coestratti da campioni di cancro alla prostata di età compresa tra tre e 14 anni.

La resa media è stata di 2.270 nanogrammi di RNA e 820 nanogrammi di DNA. È interessante notare che non c'era alcuna correlazione significativa tra l'età del campione di tessuto e il recupero dell'acido nucleico. Nel complesso, le rese di RNA e DNA erano correlate tra i campioni, anche se nella maggior parte dei casi è stato recuperato più del doppio dell'RNA rispetto al DNA.

Per dimostrare le prestazioni del DNA genomico estratto con questo protocollo, estratti di DNA convertito con bisolfito da campioni d'archivio di cancro alla prostata sono stati amplificati mediante PCR specifica per metilazione. Gli elementi ripetitivi dell'ALU sono stati utilizzati come controllo della metilazione e hanno mostrato poche variazioni tra i campioni. GSTP1, un gene noto per essere ipermetilato nel cancro alla prostata, non ha mostrato alcuna amplificazione rilevabile mediante PCR specifica per metilazione quando è stato utilizzato il DNA estratto da campioni benigni.

I campioni di DNA di pazienti con carcinoma prostatico aggressivo hanno mostrato valori di soglia del ciclo QPCR rilevabili inferiori a quelli delle cellule di carcinoma prostatico indolenti, indicando un aumento della metilazione di GSTP1 nel carcinoma prostatico aggressivo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro tre o quattro ore per l'RNA e, dopo la digestione notturna, in quattro ore per il DNA, se eseguita correttamente. Questa tecnica dovrebbe consentire ai ricercatori in patologia molecolare di esplorare i biomarcatori diagnostici del DNA e dell'RNA in una varietà di tumori.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare nuclei di tessuto per l'estrazione di DNA e RNA da aree di interesse mappate con precisione in blocchi di tessuto d'archivio.