Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

L'obiettivo generale di questa serie di esperimenti è quello di precipitare le proteine delle cellule ospiti delle piante utilizzando il calore. Facilitando così la successiva purificazione cromatografica di proteine biofarmaceutiche ricombinanti. Questo metodo può aiutare a semplificare lo sviluppo del processo e ad aumentare la stabilità del prodotto, ad esempio attivando le proteasi dell'ospite.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facile da implementare nelle proteasi esistenti e può essere rapidamente adattata a diverse proteine bersaglio. A dimostrare la procedura sarà Hannah Gruchow, una studentessa del mio laboratorio. Per riscaldare precipitare le proteine della cellula ospite.

Ad esempio dalle foglie di tabacco. Dopo aver coltivato le piante di tabacco secondo il protocollo di testo, allestire un bagno d'acqua con volume di lavoro di otto litri in un secchio di polistirene espanso isolato termicamente. Trasferire l'intero gruppo su una piastra di agitazione magnetica e posizionare una barra magnetica nel bagnomaria.

Quindi circondare l'ancoretta con una piastrella di supporto non magnetica che sormonta l'ancoretta di circa un centimetro. Su cui verrà posizionato un cestello in polipropilene più avanti durante la procedura. Aggiungere otto litri di tampone al bagnomaria.

Posizionare quindi un cestello in polipropilene di 23 x 23 x 23 centimetri sulle piastrelle di supporto. Assicurarsi che il supporto non interferisca con la rotazione dell'ancoretta e che il cestello sia completamente immerso nel liquido. Quindi rimuovere il cestello.

Usa un termostato regolabile per portare il bagnomaria a 70 gradi Celsius. Attendere almeno 15 minuti dopo il raggiungimento della temperatura desiderata per assicurarsi che l'intero gruppo abbia raggiunto l'equilibrio termico. Successivamente, prepara aliquote da 150 grammi dalle foglie di tabacco.

Mettere un'aliquota nel cestello evitando compressioni irreversibili e danni alle foglie. Ad esempio, per strappo. Immergere con cura ma rapidamente il cestello nel liquido caldo e posizionarlo sulle piastrelle di supporto.

Quindi posizionare un blocco di acciaio inossidabile sopra il cestello per evitare che si gonfi. Incubare le foglie per cinque minuti nel liquido di scottatura. Oppure selezionare un orario adatto al disegno sperimentale.

Monitorare la temperatura del liquido durante l'intero periodo di incubazione. Dopo l'incubazione, rimuovere con cautela il cestello dal liquido di sbollentamento e lasciare scolare le foglie per 30 secondi. Quindi togli le foglie della pianta dal cestello, trasferiscile nel frullatore e avvia immediatamente l'estrazione secondo i protocolli di testo.

Per riscaldare far precipitare gli HCP in un recipiente agitato. Trasferire un bagnomaria su una piastra di agitazione magnetica e posizionare un recipiente di acciaio inossidabile da due litri nel bagnomaria in modo che il centro del recipiente sia allineato al centro della piastra di agitazione. Posizionare un'ancoretta magnetica nel recipiente in acciaio inossidabile.

Riempire il recipiente con il tampone di estrazione. Poi con l'acqua deionizzata. Riempire il bagnomaria fino a cinque centimetri sotto il bordo superiore del recipiente in acciaio inossidabile.

Usa un coperchio in polistirene espanso per coprirlo. Quindi, inserisci un termometro nel recipiente in acciaio inossidabile attraverso un foro lenitivo nel coperchio. Quindi impostare la temperatura del bagnomaria a 78 gradi Celsius e incubare l'intero gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico.

Quando l'assemblaggio ha raggiunto l'equilibrio, svuotare il recipiente e versare 300 millilitri di estratto nel recipiente mentre è ancora nel bagnomaria e avviare il timer. Mescolare l'estratto a 150 giri/min mentre si incuba per cinque minuti. Assicurarsi che l'estratto raggiunga una temperatura di 70 gradi Celsius per almeno due minuti durante il periodo di incubazione.

Dopo l'incubazione, rimuovere il bagno di acqua calda dall'agitatore magnetico. Estrarre il recipiente in acciaio inossidabile e metterlo in un secchio con acqua ghiacciata. Quindi posizionare il secchio sulla piastra di agitazione.

Assicurarsi che l'omogeneizzato dell'impianto sia ben agitato a 150 giri/min. Metti il termometro nell'estratto e incubalo fino a raggiungere una temperatura di 20 gradi Celsius o la temperatura specificata. Dopo aver impostato due bagni d'acqua con volume di lavoro da otto litri secondo il protocollo di testo, utilizzare acqua deionizzata per riempire il primo bagno.

Impostare il termostato a 74,5 gradi Celsius e incubare il gruppo per 15 minuti per raggiungere l'equilibrio termico. Preparare un recipiente di stoccaggio isolato inserendo un bicchiere di plastica da 0,5 litri in un bicchiere di plastica da un litro. E usa un materiale isolante come un batuffolo di cotone per riempire gli spazi vuoti.

Utilizzando il tubo LS24, collegare lo scambiatore di calore a una pompa peristaltica a un'estremità e a un tubo di uscita all'altra estremità. Posizionare entrambe le estremità del tubo insieme al termometro nel recipiente di stoccaggio isolato. E riempirlo con 300 millimetri di tampone di estrazione.

Quindi, posizionare lo scambiatore di calore nel bagno di acqua calda e avviare la pompa peristaltica a una velocità di 300 millilitri al minuto. Dopo tre minuti, assicurarsi che la temperatura risultante nel recipiente sia di 70 gradi Celsius. Circa 4,5 gradi Celsius al di sotto del set point del bagnomaria.

Scartare il tampone di estrazione dal recipiente isolato e preparare aliquote da 300 millilitri dell'estratto vegetale. Quindi, con un'aliquota, riempire il recipiente isolato. Ora pompa l'estratto vegetale attraverso lo scambiatore di calore a 300 millilitri al minuto per cinque minuti.

Quindi assicurarsi che la temperatura dell'estratto sia di 70 gradi Celsius dopo tre minuti o sia uguale alla temperatura da trovare nel disegno sperimentale. Dopo cinque minuti, trasferire lo scambiatore di calore nel bagno di acqua ghiacciata. Assicurati che la temperatura dell'estratto sia inferiore a 30 gradi Celsius prima di procedere.

Rimuovere il tubo di alimentazione collegato alla pompa peristaltica dal recipiente isolato. E continuare il pompaggio per raccogliere il calore residuo estratto dall'impianto precipitato dall'interno dello scambiatore di calore. Quindi arrestare la pompa.

Per eseguire la filtrazione a maniche dell'estratto vegetale, montare un filtro a maniche nell'apposito cestello di supporto inserito nell'alloggiamento del filtro. Posizionare un recipiente da un litro sotto il cestello e applicare le aliquote di estratto sulla sacca a una velocità di 150 millilitri al minuto. Dopo la filtrazione, utilizzare un torbidimetro per misurare la torbidità di una diluizione da uno a 10 del filtrato nel tampone di estrazione.

Aliquotare un campione da un millilitro ed elaborare il filtrato a sacco. Ad esempio, attraverso la filtrazione di profondità e la cromatografia. Analizzare ulteriormente il campione in base al protocollo di testo.

La precipitazione termica delle proteine della cellula ospite mediante sbollentamento riduce la proteina solubile totale o TSP del 96 più o meno l'uno percento. Blanching ha recuperato fino all'83% più o meno l'uno per cento di DsRed e il 51 per cento della proteina bersaglio Vax8. Aumento della sua purezza dallo 0,1% all'1,2% prima della separazione cromatografica.

La capacità del filtro diminuiva a temperature di scottatura superiori a 63 gradi Celsius. Questo problema può essere risolto aggiungendo flocculanti dopo l'estrazione delle proteine e coadiuvanti di filtrazione dopo la filtrazione a sacco. Un recipiente agitato per la precipitazione del calore ha rimosso un massimo di 84 HCP più o meno l'uno percento.

Raggiungimento di una purezza di 0,33 più o meno 0,02 percento per Vax8 e 20,2 più o meno 1,4 percento per DsRed. A differenza della scottatura e della configurazione dello scambiatore di calore, la precipitazione HCP in un recipiente aumenta di 2,5 volte la capacità di filtrazione della profondità a valle. Riflettendo le forze inferiori nel recipiente rispetto al pompaggio dell'estratto attraverso lo scambiatore di calore o all'omogeneizzazione dopo la scottatura.

Circa l'88,3% più o meno lo 0,7% del contenuto di HCP è stato costantemente rimosso dall'estratto utilizzando uno scambiatore di calore tra 60 e 70 gradi Celsius. Raggiungimento di una purezza di 0,31 più o meno 0,01 percento per Vax8. E 27,6 più o meno il 2,0 per cento per DsRed.

Infine, lo scambiatore di calore ha anche raggiunto la più bassa capacità di filtraggio della profondità a valle. Chiarificazione di soli 13,5 più o meno 6,0 litri per metro quadrato prima dell'intasamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 50 minuti più il campione se viene eseguita correttamente.

Quando si tenta questo metodo, è importante ricordare di assicurarsi che la proteina bersaglio sia stabile al calore. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la cromatografia, per purificare ulteriormente il prodotto al livello richiesto. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle piante grazie a una tecnologia per esplorare la purificazione delle proteine candidate ai vaccini e delle specie di nicotiana.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come precipitare le proteine delle cellule ospiti delle piante usando lo sbollentamento, il recipiente agitato o lo scambiatore di calore.