Analisi automatizzata di C. elegans Comportamento Swim Utilizzando Celest Software
7 dicembre 2016
Una metodologia efficace e semplice per l'analisi computer basato su un comportamento nuoto nematode in un liquido è descritto. Il metodo richiede poco o nessun investimento per C. elegans laboratori. L'hardware utilizzato è standard, e il software per l'analisi comportamentale (Celest) è un open source uno.
L'obiettivo generale di questa metodologia è valutare quantitativamente il comportamento di nuoto di C.Elegans utilizzando il software di Computer Vision chiamato CeleST, per C.Elegans Swim Test"Questo metodo di analisi può aiutare ad affrontare l'impatto di mutazioni genetiche o interventi farmacologici sul comportamento di nuoto di C.elegans. Può anche facilmente segnare il declino associato all'età delle capacità delle locomotive. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è possibile tracciare più animali contemporaneamente, con diversi aspetti della postura di nuoto analizzati per valutare otto parametri del comportamento di nuoto e la valutazione automatizzata dei dati.
Inizia procurandoti uno stereomicroscopio e una fotocamera CCD digitale, nonché un computer con software di registrazione video digitale e software di visione artificiale per l'analisi del comportamento di nuoto di C.Elegans. All'interno del software di registrazione video digitale, impostare le seguenti impostazioni:Coprire il microscopio con un panno scuro per evitare l'abbagliamento nell'area della goccia di nuoto sul vetrino del microscopio e migliorare la qualità dell'immagine. Regolare la distanza di lavoro e l'ingrandimento del microscopio per una visione completa dell'area di nuoto e regolare lo specchio di base per ottenere un contrasto netto degli animali sullo sfondo.
Quindi, imposta l'illuminazione su campo scuro per visualizzare i corpi degli adulti come bianchi su sfondo nero. Quindi, pipettare 60 microlitri di 1 tampone M9 in un anello da 10 millimetri, prestampato su un vetrino da microscopio, e assicurarsi che la goccia copra completamente l'area interna dell'anello. Trasferisci quattro nematodi adulti nella goccia di 1 tampone M9 riducendo al minimo il trasporto di batteri che possono intorbidire il liquido.
Ridurre al minimo i batteri nel pozzo di nuoto consentendo ai nematodi di strisciare brevemente su una regione non posizionata della piastra prima di essere trasferiti, oppure mescolando leggermente il pozzo di nuoto per disperdere le tracce di batteri minori prima della registrazione. Quindi, posizionare il vetrino caricato con nematodi adulti sulla base del microscopio per registrare il loro comportamento di nuoto nel liquido in video di 30 secondi. Per registrare, selezionare Nuova sequenza nella RAM sotto l'intestazione Home, quindi premere il pulsante rosso di registrazione.
Infine, al termine della registrazione, fare clic sull'intestazione Home e selezionare Esporta sequenza completa, in modo da frammentare il video in una sequenza di fotogrammi di immagine. Inizia avviando il software Computer Vision per l'analisi del comportamento di nuoto di C.elegans da Mat Lab facendo clic sul pulsante Esegui. Nella schermata iniziale del programma di analisi del nuoto, utilizzare i pulsanti Aggiungi un video o Aggiungi più video per caricare sequenze di fotogrammi di immagini uno alla volta o in gruppi allegando etichette pertinenti, come genotipo, data, prova e durata.
Quindi, fare clic su Elabora video"per abilitare il tracciamento simultaneo di più animali nelle sequenze caricate. Nella nuova schermata che appare, seleziona i video desiderati nella casella di sinistra e fai clic su Aggiungi all'elenco"Successivamente, delimita la zona di nuoto selezionando tre punti all'interno dell'anello e avvia l'elaborazione facendo clic su Elabora tutti i video sopra elencati. Visualizza l'avanzamento dell'elaborazione video nella parte inferiore centrale dello schermo.
Al termine, chiudere la schermata di elaborazione video. Inizia cliccando su Calcola misure"per aprire una nuova schermata in cui i video elaborati possono essere caricati uno alla volta per convalidare o rifiutare il tracciamento dei singoli animali. Utilizzare questo passaggio manuale per concentrarsi sulle aree di rilevamento mancato, mostrate nei blocchi rossi, e in contrasto con il rilevamento riuscito, indicato nei blocchi verdi.
Trova la validità del corpo segmentato"nella prima barra dei colori sullo schermo nella metà inferiore. Si noti che la percentuale di frame validi è in verde e la percentuale di frame rifiutati è in rosso. Quindi, naviga e modifica i blocchi di frame validi o rifiutati utilizzando il blocco successivo, cambia le opzioni di validità"Dividi blocco" e Isola frame".
Nel raro caso in cui due animali si incrocino in una zona di balneazione poco affollata, cambia i loro numeri di identificazione su un intervallo di fotogrammi specifico con il pulsante Switch". Infine, fai clic su Salva e calcola misure"per salvare l'input di validità prima di caricare un altro video elaborato. Quindi selezionare Chiudi"per uscire dalla schermata Calcola misure.
Si noti che il software calcola le mappe di curvatura delle prestazioni di nuoto dei singoli animali sullo sfondo, nonché gli otto parametri indicati in seguito. Nella schermata iniziale del programma software Computer Vision, fare clic su Visualizza risultati"per ottenere l'output dell'analisi. Quindi, crea gruppi di campioni per il trattamento statistico selezionando le sequenze di fotogrammi analizzate desiderate nella casella di sinistra e spostandole in un gruppo di campioni esistente più recente facendo clic sui pulsanti Aggiungi al campione selezionato o Aggiungi a un nuovo campione.
Fare clic su Mostra grafici per questi campioni"per passare a una seconda schermata che visualizza i grafici e le statistiche chiave dei campioni per ciascuno degli otto parametri per selezione nella parte superiore dello schermo. Quindi, seleziona gli istogrammi 2D"per tracciare combinazioni di due parametri qualsiasi tramite la misurazione sull'asse X e la misurazione sui menu a discesa dell'asse Y a sinistra dello schermo. Fare clic su Chiudi"per uscire e tornare alla schermata Visualizza risultati".
Quindi, seleziona il pulsante di esportazione in alto a sinistra dello schermo per salvare i dati numerici dettagliati come file csv da aprire e manipolare ulteriormente in un programma di fogli di calcolo. Infine, seleziona Chiudi"per uscire dalla schermata Visualizza risultati" e tornare alla schermata principale. Fare clic su Esci"per garantire il salvataggio del database contenente le sequenze video analizzate.
Alcuni parametri del nuoto, come il tasso di inizio delle onde, l'indice di attività, la pennellata e la velocità di percorrenza diminuivano gradualmente con l'età anche in contesti genetici favorevoli. D'altra parte, il numero di onde corporee, l'asimmetria, l'allungamento e i parametri di arricciatura hanno avuto una tendenza all'aumento con l'età negli adulti mutanti wild type e anziani. Sebbene tutti i nematodi inizino come adulti sani, alcuni perdono rapidamente la loro forma fisica, mentre altri mantengono il vigore per periodi di tempo più lunghi, indicando che i cattivi hanno una durata di salute considerevolmente più breve rispetto agli aggraziati.
Una volta padroneggiata, l'analisi di quattro vermi nuotatori può essere acquisita in pochi minuti. Il calcolo richiede circa sei minuti per video e può essere eseguito in remoto. È possibile lavorare 250 animali al giorno.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire video di prove di nuoto ed elaborare i dati per ottenere la valutazione della locomozione in liquidi.
Panoramica
Questo articolo presenta una metodologia semplice per l'analisi del comportamento natatorio di C. elegans mediante il software open-source CeleST. L'approccio è economico e utilizza attrezzature di laboratorio standard, risultando così accessibile in diversi contesti di ricerca.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi del comportamento
- Genetica
Sfondo
- C. elegans è un organismo modello ampiamente utilizzato negli studi genetici e comportamentali.
- La comprensione del comportamento natatorio può fornire informazioni sugli effetti delle mutazioni genetiche e degli interventi farmacologici.
- I cambiamenti legati all'età nelle capacità locomotorie possono essere valutati quantitativamente.
- Le tecniche di visione artificiale migliorano la precisione dell'analisi comportamentale.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per valutare quantitativamente il comportamento natatorio di C. elegans.
- Valutare l'impatto di fattori genetici e ambientali sul comportamento natatorio.
- Facilitare l'analisi del declino associato all'età nella locomozione.
Metodi Utilizzati
- Utilizzo di un microscopio stereoscopico e di una telecamera CCD digitale per la registrazione video.
- Applicazione del software CeleST per il tracciamento e l'analisi del comportamento natatorio.
- Registrazione del comportamento natatorio in un ambiente controllato con interferenza batterica minima.
- Elaborazione dei dati video per estrarre parametri comportamentali chiave e generare analisi statistiche.
Risultati principali
- È possibile tracciare contemporaneamente più C. elegans, consentendo un'analisi completa.
- Sono stati osservati declini legati all'età in determinati parametri natatori.
- Alcuni nematodi hanno mantenuto la forma fisica più a lungo di altri, indicando una variabilità nell'invecchiamento.
- Il metodo consente un'analisi rapida del comportamento natatorio, migliorando l'efficienza della ricerca.
Conclusioni
- Il software CeleST fornisce una piattaforma robusta per l'analisi del comportamento natatorio di C. elegans.
- Questa metodologia può contribuire in modo significativo agli studi sulla genetica e sull'invecchiamento.
- La ricerca futura potrà sfruttare questo approccio per esplorare ulteriori domande comportamentali e fisiologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi automatizzata del comportamento natatorio di C. elegans consente uno screening fenotipico ad alto rendimento per la scoperta di composti neuroattivi e la validazione di bersagli. Quantificando i parametri di locomozione in ambiente liquido, il metodo supporta l'eliminazione dei rischi meccanicistici associati a interventi genetici e farmacologici in un sistema modello scalabile e riproducibile. Questo approccio aumenta la fiducia predittiva nella fase iniziale della scoperta, collegando gli output comportamentali alla funzione dei circuiti neuronali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche attraverso la valutazione quantitativa della funzione neuromuscolare in mutanti genetici.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico monitorando contemporaneamente otto parametri del comportamento natatorio in centinaia di animali.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio identificando composti che modificano il declino associato all'età nella capacità locomotoria.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Prepara sistemi biologici validati per flussi di lavoro successivi attraverso la delimitazione standardizzata delle zone di nuoto e il tracciamento automatizzato.
- Risultati quantitativi: Genera mappe di curvatura e otto parametri basati sulla postura senza soglie predeterminate, consentendo una valutazione affidabile dei composti.
- Scalabilità: Elabora 250 animali al giorno con calcolo remoto, favorendo il riutilizzo della piattaforma in diverse campagne di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Collega i fenotipi del comportamento natatorio a modelli di invecchiamento e neurodegenerazione attraverso andamenti parametrici legati all'età.
- Continuità traslazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica mantenendo letture comportamentali coerenti tra diversi flussi di lavoro.
- Avanzamento basato sul rischio: Guida le decisioni di proseguimento o interruzione rivelando nuovi fenotipi in contesti genetici ben caratterizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto leader, fornendo letture comportamentali quantitative che contribuiscono alla comprensione meccanicistica e alla selezione dei composti.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'analisi automatizzata della postura nuotata e della dinamica del movimento.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio grazie al tracciamento simultaneo di più animali e a un processo video standardizzato.
- Analisi: Fornisce output statistici e statistiche chiave per ciascuno degli otto parametri, consentendo il confronto tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un collegamento con la continuità preclinica attraverso l'allineamento di biomarcatori legati all'età nelle traiettorie di declino della locomozione.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come capacità riutilizzabile per lo screening comportamentale in progetti multipli e aree terapeutiche diverse.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Maggiore affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie alla riduzione dell'ambiguità meccanicistica nella funzione neuromuscolare.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante valutazione automatizzata dei dati e intervento manuale minimo.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci su prosegui/non prosegui, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate grazie alla riduzione precoce del rischio fenotipico.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su soglie quantitative di comportamento natatorio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso di software di visione artificiale e nell'allestimento di C. elegans.
- Necessita di un microscopio stereoscopico, una telecamera digitale CCD e un computer dotato del software CeleST per l'acquisizione e l'analisi dei video.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la delimitazione della zona di nuoto e per l'etichettatura dei video in base a genotipo, data, prova e durata.
- Comporta considerazioni di adattamento tra diversi sistemi modello a causa della dipendenza da saggi di locomozione in ambiente liquido.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di minimizzare la contaminazione batterica nei pozzetti di nuoto per mantenere la qualità delle immagini.
