Analisi automatizzata di C. elegans Comportamento Swim Utilizzando Celest Software

L'obiettivo generale di questa metodologia è valutare quantitativamente il comportamento di nuoto di C.Elegans utilizzando il software di Computer Vision chiamato CeleST, per C.Elegans Swim Test"Questo metodo di analisi può aiutare ad affrontare l'impatto di mutazioni genetiche o interventi farmacologici sul comportamento di nuoto di C.elegans. Può anche facilmente segnare il declino associato all'età delle capacità delle locomotive. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è possibile tracciare più animali contemporaneamente, con diversi aspetti della postura di nuoto analizzati per valutare otto parametri del comportamento di nuoto e la valutazione automatizzata dei dati.

Inizia procurandoti uno stereomicroscopio e una fotocamera CCD digitale, nonché un computer con software di registrazione video digitale e software di visione artificiale per l'analisi del comportamento di nuoto di C.Elegans. All'interno del software di registrazione video digitale, impostare le seguenti impostazioni:Coprire il microscopio con un panno scuro per evitare l'abbagliamento nell'area della goccia di nuoto sul vetrino del microscopio e migliorare la qualità dell'immagine. Regolare la distanza di lavoro e l'ingrandimento del microscopio per una visione completa dell'area di nuoto e regolare lo specchio di base per ottenere un contrasto netto degli animali sullo sfondo.

Quindi, imposta l'illuminazione su campo scuro per visualizzare i corpi degli adulti come bianchi su sfondo nero. Quindi, pipettare 60 microlitri di 1 tampone M9 in un anello da 10 millimetri, prestampato su un vetrino da microscopio, e assicurarsi che la goccia copra completamente l'area interna dell'anello. Trasferisci quattro nematodi adulti nella goccia di 1 tampone M9 riducendo al minimo il trasporto di batteri che possono intorbidire il liquido.

Ridurre al minimo i batteri nel pozzo di nuoto consentendo ai nematodi di strisciare brevemente su una regione non posizionata della piastra prima di essere trasferiti, oppure mescolando leggermente il pozzo di nuoto per disperdere le tracce di batteri minori prima della registrazione. Quindi, posizionare il vetrino caricato con nematodi adulti sulla base del microscopio per registrare il loro comportamento di nuoto nel liquido in video di 30 secondi. Per registrare, selezionare Nuova sequenza nella RAM sotto l'intestazione Home, quindi premere il pulsante rosso di registrazione.

Infine, al termine della registrazione, fare clic sull'intestazione Home e selezionare Esporta sequenza completa, in modo da frammentare il video in una sequenza di fotogrammi di immagine. Inizia avviando il software Computer Vision per l'analisi del comportamento di nuoto di C.elegans da Mat Lab facendo clic sul pulsante Esegui. Nella schermata iniziale del programma di analisi del nuoto, utilizzare i pulsanti Aggiungi un video o Aggiungi più video per caricare sequenze di fotogrammi di immagini uno alla volta o in gruppi allegando etichette pertinenti, come genotipo, data, prova e durata.

Quindi, fare clic su Elabora video"per abilitare il tracciamento simultaneo di più animali nelle sequenze caricate. Nella nuova schermata che appare, seleziona i video desiderati nella casella di sinistra e fai clic su Aggiungi all'elenco"Successivamente, delimita la zona di nuoto selezionando tre punti all'interno dell'anello e avvia l'elaborazione facendo clic su Elabora tutti i video sopra elencati. Visualizza l'avanzamento dell'elaborazione video nella parte inferiore centrale dello schermo.

Al termine, chiudere la schermata di elaborazione video. Inizia cliccando su Calcola misure"per aprire una nuova schermata in cui i video elaborati possono essere caricati uno alla volta per convalidare o rifiutare il tracciamento dei singoli animali. Utilizzare questo passaggio manuale per concentrarsi sulle aree di rilevamento mancato, mostrate nei blocchi rossi, e in contrasto con il rilevamento riuscito, indicato nei blocchi verdi.

Trova la validità del corpo segmentato"nella prima barra dei colori sullo schermo nella metà inferiore. Si noti che la percentuale di frame validi è in verde e la percentuale di frame rifiutati è in rosso. Quindi, naviga e modifica i blocchi di frame validi o rifiutati utilizzando il blocco successivo, cambia le opzioni di validità"Dividi blocco" e Isola frame".

Nel raro caso in cui due animali si incrocino in una zona di balneazione poco affollata, cambia i loro numeri di identificazione su un intervallo di fotogrammi specifico con il pulsante Switch". Infine, fai clic su Salva e calcola misure"per salvare l'input di validità prima di caricare un altro video elaborato. Quindi selezionare Chiudi"per uscire dalla schermata Calcola misure.

Si noti che il software calcola le mappe di curvatura delle prestazioni di nuoto dei singoli animali sullo sfondo, nonché gli otto parametri indicati in seguito. Nella schermata iniziale del programma software Computer Vision, fare clic su Visualizza risultati"per ottenere l'output dell'analisi. Quindi, crea gruppi di campioni per il trattamento statistico selezionando le sequenze di fotogrammi analizzate desiderate nella casella di sinistra e spostandole in un gruppo di campioni esistente più recente facendo clic sui pulsanti Aggiungi al campione selezionato o Aggiungi a un nuovo campione.

Fare clic su Mostra grafici per questi campioni"per passare a una seconda schermata che visualizza i grafici e le statistiche chiave dei campioni per ciascuno degli otto parametri per selezione nella parte superiore dello schermo. Quindi, seleziona gli istogrammi 2D"per tracciare combinazioni di due parametri qualsiasi tramite la misurazione sull'asse X e la misurazione sui menu a discesa dell'asse Y a sinistra dello schermo. Fare clic su Chiudi"per uscire e tornare alla schermata Visualizza risultati".

Quindi, seleziona il pulsante di esportazione in alto a sinistra dello schermo per salvare i dati numerici dettagliati come file csv da aprire e manipolare ulteriormente in un programma di fogli di calcolo. Infine, seleziona Chiudi"per uscire dalla schermata Visualizza risultati" e tornare alla schermata principale. Fare clic su Esci"per garantire il salvataggio del database contenente le sequenze video analizzate.

Alcuni parametri del nuoto, come il tasso di inizio delle onde, l'indice di attività, la pennellata e la velocità di percorrenza diminuivano gradualmente con l'età anche in contesti genetici favorevoli. D'altra parte, il numero di onde corporee, l'asimmetria, l'allungamento e i parametri di arricciatura hanno avuto una tendenza all'aumento con l'età negli adulti mutanti wild type e anziani. Sebbene tutti i nematodi inizino come adulti sani, alcuni perdono rapidamente la loro forma fisica, mentre altri mantengono il vigore per periodi di tempo più lunghi, indicando che i cattivi hanno una durata di salute considerevolmente più breve rispetto agli aggraziati.

Una volta padroneggiata, l'analisi di quattro vermi nuotatori può essere acquisita in pochi minuti. Il calcolo richiede circa sei minuti per video e può essere eseguito in remoto. È possibile lavorare 250 animali al giorno.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come acquisire video di prove di nuoto ed elaborare i dati per ottenere la valutazione della locomozione in liquidi.