Name: Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri come riprogrammare fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per generare precursori ematopoietici in vitro. Questo metodo diretto evita stadi pluripotenti intermedi e facilita la ricerca sull'ematopoiesi.

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione NHLBI a K.M. e I.R.L. (1RO1HL119404). Carlos-Filipe Pereira è stato il destinatario di una borsa di studio Revson Senior Biomedical. Ringraziamo il Mount Sinai hESC/iPSC Shared Resource Facility e S. D'Souza per l'assistenza fornita con materiali e protocolli. Ringraziamo anche le strutture di citometria a flusso, genomica e topo del Mount Sinai.

dichiarazione etica: linee di cellule del mouse sono derivati ​​seguendo le linee guida per la cura degli animali della Scuola Icahn di Medicina presso il Monte Sinai, e dovrebbe essere fatto in conformità con qualsiasi istituto ospitante. 1. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Isolamento dei topi C57BL / 6 <ol><li> Impostare l&#39;accoppiamento temporizzato 13. Una volta che un tappo vaginale viene visualizzato, prendere in considerazione questa Giornata 0.5. </li><li> Separare le femmine collegati alla data spina e verificare su di loro il giorno 10-11 per confermare la gravidanza. </li><li> Il giorno di 13,5-14,5 eutanasia topi femmine gravide di via CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Mettere a bagno in stato di gravidanza addome femminile con il 70% di etanolo, sezionare la cavità addominale con forbici sterili e pinze lungo la linea mediana, e rimuovere chirurgicamente le corna uterine che contengono gli embrioni 14. Estrarre gli embrioni delicatamente mentre tagliando il tessuto addominale rimanente. NOTA: recuperare circa 8 embrioni con 4 su ogni lato. </li><li> Posizionare il uterina hORNS contenenti gli embrioni in un piatto di 10 centimetri con 5-10 ml di sterile refrigerata tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Con le forbici e pinze sterili, fare un&#39;incisione lungo le corna uterine per isolare le sacche che trasportano gli embrioni. Trasferire le sacche ad un nuovo 10 centimetri piatto con 5-10 ml di sterili refrigerate PBS e disporli sul ghiaccio. </li><li> Mettere alcune delle sacche in un nuovo 10 centimetri piatto con 5-10 ml di sterile raffreddato PBS. Utilizzando forbici sterili e pinze delicatamente tagliare aperto le sacche (senza tagliare troppo in profondità) al fine di evitare penetrante gli embrioni. </li><li> Separare gli embrioni da placenta tagliando il cordone ombelicale. </li><li> Trasferire gli embrioni per un nuovo 10 centimetri piatto contenente 5-10 ml di acqua refrigerata PBS e lasciare sul ghiaccio, mentre il completamento delle rimanenti dissezioni. </li><li> Decapitare gli embrioni con pinza sterile. Tagliare con cautela lungo la linea mediana dell&#39;embrione con le forbici e pinze sterili, a partire dalla zona decapitato per aprire l&#39;addome. Posizione pinza sotto tegli organi viscerali (compreso il cuore, il fegato, i polmoni e) e raschiare 15. </li><li> Tagliare il tessuto rimanente in piccoli pezzi con le forbici e pinze e trasferire in un tubo conico da 50 ml contenente 10 ml di tripsina. </li><li> Pipettare su e giù con una pipetta 10 ml 20-30 volte per mescolare e dissociare il tessuto. </li><li> Incubare il tessuto e mix tripsina in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per 45 minuti, agitando di tanto in tanto. </li><li> Pipettare su e giù con una pipetta 10 ml per circa 5 minuti per mescolare il contenuto. </li><li> Aggiungere cellule trypsinized a 3X volume di Modified Eagle Medium standard di Dulbecco (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 10 mg / ml penicillina / streptomicina (P / S), e 1 mm L-glutammina (L-GLUT) in piatti 10 cm (~ 10 ml) e la cultura a 37 ° C fino confluenti (circa 2-4 giorni). Culture circa 1-2 embrioni per 10 cm piatto. NOTA: le cellule Blocca una volta le piastre sono confluenti. cellule congelate possono essere scongelati e diversi passaggi altre 2 volte. Le celle possono essere alternativamentedividere 2 volte prima del congelamento, e quindi ancora una volta dopo essere stati scongelati. </li></ol> 2. La produzione virale <ol><li> Expand cellule 293T in 10 cm piastre con 10 ml DMEM con 10% FBS, 1% P / S, e 1% L-GLUT per la trasfezione. <ol><li> Trypsinize cellule 293T con 2 ml di tripsina, incubare a 37 ° C per 5 minuti, raccogliere le cellule in provette da 15 ml, spin a 300 xg, e la piastra in modo appropriato (10 ml per 10 centimetri piatto). </li></ol></li><li> 24 ore prima della trasfezione, dividere confluenti 10 cm piatto di cellule 293T 1: 6 e seme in 10 cm di gelatina rivestito (0,1% di gelatina in PBS) piatti. NOTA: saranno tenuti 4 piastre per virus. <ol><li> Per piastre cappotto in gelatina, aggiungere almeno 2 ml della soluzione di gelatina 0,1% per rivestire il fondo 10 piatti cm. Incubare a 37 ° C per almeno 20 min. Aspirare fuori la gelatina prima di aggiungere le cellule alle piastre. </li></ol></li><li> In un tubo da 15 ml, aggiungere 84 mcg plasmide (ad esempio GATA2, Gfi1b, i CFO, o Etv6 (sub-clonato nel vect pFUW-tetoo 16) o FUW-M2rtTA 17), 84 mg psPAX2, e 42 mg pMD2.G. Aggiungere acqua (H 2 O) per compensare il volume di 2 ml. Preparare un tubo per ogni fattore (ad es. GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 FUW-M2rtTA). </li><li> Aggiungere 250 ml di 2M CaCl 2 a ciascuna provetta contenente la miscela 2 ml composta da 84 mg del gene prescelto (GATA2, Gfi1b, CFO, Etv6 o FUW-M2rtTA) + 84 mcg psPAX2 + 42 mcg pMD2.G + H 2 O . </li><li> Usando una pipetta Pasteur inserito nel pipetta soccorso, rilascio di bolle in 2,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 miscela. Poiché le bolle vengono prodotti, posizionare la punta di un P1000 contro la pipetta di vetro e lentamente espellere 2 ml di 100 mM N, N-bis (2-idrossietil) -2-amminoetano solfonico (BES) salina per pipetta Pasteur 1 ml alla volta. </li><li> Incubare tutte le provette nella cappa coltura a temperatura ambiente per almeno 15 min. NOTA: il 4,25 ml di miscela (ora DNA + H 2 O + 2M CaCl 2 </sub&gt; + BES salina) sarà leggermente nuvoloso. </li><li> Come la miscela incuba, media aspirare al largo piastre 293T e aggiungere 10 ml DMEM + 10% FBS + 1 mM L-glutammina + 25 Nm clorochina. NOTA: Questo supporto non contiene P / S. </li><li> Dopo almeno 15 min di incubazione (o fino a cambio di un supporto su cellule 293T), aggiungere il 4,25 ml DNA + H 2 O + 2 M CaCl 2 + BES miscela salina goccia a goccia per le cellule 293T, distribuendo in modo uniforme 4 piastre di cellule per provetta (cioè poco più di 1 ml di miscela per piastra). </li><li> Incubare le piastre durante la notte (O / N) a 37 ° C. </li><li> 24 dopo incubazione ore, sostituire media su tutte le piastre con 4 ml di DMEM standard (vedere il punto 1.15). </li><li> Mantenere le cellule in un incubatore a 32 ° da ora in poi. </li><li> 24 ore dopo il punto 2.10, raccogliere supporti in distinte provette da 50 ml. Sostituire i mezzi raccolti da ogni piatto con 4 ml di standard di DMEM. NOTA: 4 piastre per i primi risultati della miscela tubo in 16 ml di media raccolti. <ol><li> UNopo 12 ore di incubazione, raccogliere i media ancora una volta nelle stesse provette da 50 ml e sostituirlo con un altro 4 ml di standard di DMEM. </li><li> Dopo 12 ore di incubazione, raccogliere i mezzi di comunicazione e di aggiungere le stesse provette da 50 ml. NOTA: ogni tubo dovrebbe contenere circa 48 ml di supporti contenenti virus. </li></ol></li><li> Per concentrare il virus raccolti, primo filtro dei media raccolti tramite 0,45 micron a basso contenuto proteico filtri vincolanti. </li><li> Versare i media filtrati contenenti virus in provette da centrifuga concentrazione virale (circa 16 ml per volta). </li><li> Spin a 4.000 xg a 4 ° C per 25 minuti e rimuovere flow-through. NOTA: un piccolo volume di mezzi concentrati e virus sarà visibile nel filtro. </li><li> Aggiungere altri 16 ml di media virus contenenti filtrato per il volume del supporto + virus concentrati rimanente nel filtro e mescolare capovolgendo la provetta. </li><li> tubo Spin nuovamente a 4.000 xg a 4 ° C per 25 min e scarti flow-through. </li><li> Aggiungere rimanendo filtratoraccolta ai media + volume di virus concentrati lasciato nel filtro e mescolare invertendo la provetta. </li><li> Spin nuovamente a 4.000 xg a 4 ° C per 10-20 minuti (a seconda del volume nel filtro) e assicurarsi che il volume residuo di supporti concentrato + virus lasciato nel filtro è di circa 1 ml. Se è maggiore di 1 ml di concentrato supporti + virus rimane nel filtro, far girare nuovamente a 4.000 xg per 1 min e ripetere fino 1 ml viene lasciato nel filtro. </li><li> Aliquotare 200 ml di virus concentrati in provette da 1,5 ml e congelare a -80 ° C o utilizzare immediatamente. </li></ol> 3. Riprogrammazione MEF <ol><li> Pre-coat 6 e piastre con 0,5 ml di 0,1% di gelatina in PBS per pozzetto, assicurando che la gelatina copre l&#39;intera area del pozzo. Mettere in un incubatore a 37 ° C e incubare per almeno 20 min. Dopo l&#39;incubazione, rimuovere le piastre e aspirare la gelatina. </li><li> MEF piastra con DMEM standard ad una densità di 25.000 cellule per pozzetto (150.000 celluleper 6-pozzetti) sul 6 pozzetti gelatinizzato (s) dal punto 3.1 e si lascia stratificare O / N in un incubatore a 37 °. </li><li> Preparare un cocktail di virus 100 ml mescolando 50 ml M2rtTA e il restante 50 ml un mix di GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6 (12,5 ml ciascuno). </li><li> supporti Aspirare dal MEF e aggiungere 2 ml di DMEM serie con 8 mg / ml di bromuro hexadimethrine. </li><li> Trasdurre ciascun pozzetto delle piastre MEF con 15 ml di cocktail di virus e incubare O / N a 37 ° C. NOTA: Questo è il giorno 0 del processo di riprogrammazione. </li><li> Il giorno 1, dopo 16-20 ore di incubazione, sostituire il supporto con 2 ml di DMEM fresco di serie integrato con 1 mg / ml DOX per pozzetto. </li><li> Preparare terreni di coltura ematopoietiche integrato con idrocortisone (10 -6 M), 100 ng / ml fattore delle cellule staminali (SCF), 100 ng / ml FMS relativi tirosin-chinasi 3 ligando (Flt3L), 20 ng / ml di interleuchina-3 (IL- 3), 20 ng / ml di interleuchina-6 (IL-6), e 1 mg / ml DOX. </li><li> Il giorno 4 aspirate dei media da ciascun pozzetto e lavare le cellule con 1 ml di PBS per pozzetto. </li><li> Aspirare PBS, dissociare le cellule usando 1 ml di 0,05% tripsina per bene e raccogliere le cellule. </li><li> Contare le cellule con un emocitometro, far girare a 300 xg per 5 minuti, risospendere in 12 ml di mezzi ematopoietiche descritti al punto 3.7 e piastra 60.000 cellule per 6 pozzetti su 0.1% piastre rivestite di gelatina (2 ml per pozzetto, 10.000 cellule per pozzetto ). </li><li> Sostituire media con terreni di coltura ematopoietiche INTEGRAZIONI fresco ogni 6 giorni per tutta la durata della cultura (35 a 36 giorni). </li><li> Analizzare sia cellule intermedie o cellule ematopoietiche come emergenti tramite immuno-colorazione 12, l&#39;analisi FACS 8,12, qRT-PCR 12, e mRNA sequenziamento 12 per confermare l&#39;acquisizione di endoteliale hemogenic o marcatori HSC-like e l&#39;espressione genica. </li></ol> 4. placentare di aggregazione e Colony Forming unità (CFU) saggi in metilcellulosa <ol><li> Sezionare placente da C5 incinta7BL / 6 topi come precedentemente descritto 18 a E12.5 e mantenere il tessuto sul ghiaccio. </li><li> Per avviare la placenta dissociazione 19, lavo tessuto placentare in 2-5 ml di 0,2% di tipo collagenasi io in PBS con il 20% FBS e dissocio meccanicamente con un ago da 18G montato in una siringa da 5 ml da passaging la placenta e PBS attraverso l&#39;ago almeno 3 volte. </li><li> Dopo la dissociazione meccanica, mantenere le cellule placentari in 2-5 ml di soluzione di collagenasi a 37 ° C per 1,5 ore. </li><li> cellule passaggio attraverso 20-25 aghi G montati su 5 ml siringhe più volte per ulteriori dissociarsi meccanicamente le cellule placentari. </li><li> Filtro sospensioni singola cella attraverso 70 micron filtri cellulari. </li><li> Contare le cellule con un emocitometro e irradiare a 2.000 cGy per l&#39;inattivazione mitotico 20. </li><li> Aggiungere 10 ml di terreni di coltura ematopoietiche integrato con 100 ng / ml SCF, 100 ng / ml Flt3L, 20 ng / ml di IL-3, 20 ng / ml di IL-6, e 10 ng / trombopoietina ml (TPO) per 10 cm piatto. NOTA: DOX non è necessario in questa fase. </li><li> Collocare un filtro 0,65 micron direttamente su terreni di coltura ematopoietiche nel piatto, che galleggi per creare una interfaccia liquido-gas e impostare il piatto da parte. </li><li> Dissociarsi giorno 25 MEF trasdotte (derivati ​​dal passaggio 3,11), come descritto nei punti 3.8-3.10 e mescolare 33.000 dei MEF trasdotte con 167.000 cellule degli aggregati placentari dal punto 4.6 (rapporto 1: 6). </li><li> Per generare un aggregato 18,21, prima rotazione lungo il MEF e mix cellula placentare dal passaggio 4,9 per 5 min a 300 x g. Aspirare i media e risospendere le cellule pellet in 30-50 ml di standard di DMEM con una pipetta P200, disegnando la sospensione singola cella in 200 ml nonbevelled punta della pipetta. </li><li> Occludere la punta della pipetta con la pellicola di paraffina. Posizionare la punta bloccato in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare per 5 min a 300 xg per cui si forma una pallina alla fine coperta di punta. </li><li> Rimuovere la punta dal tubo da 15 ml con attenzione e postola punta sull&#39;estremità della pipetta P200. Eliminare la pellicola di paraffina e estrudere il pellet cellulare sul filtro galleggiante dal punto 4.8. NOTA: Piastra al massimo 3 aggregati per filtro. </li><li> Cultura aggregati sui galleggianti 0,65 micron filtri per 4-5 giorni a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Raccogliere gli aggregati (al massimo 3 per filtro) con un raschietto cellulare, combinarli, e digerire con lo 0,2% collagenasi, seguendo lo stesso protocollo fatto con l&#39;intero placenta dissociare le cellule (passi 4,2-4,5). </li><li> Dopo la dissociazione, lavare gli aggregati con 2-5 ml di PBS integrato con il 5% FBS e centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min. </li><li> Risospendere gli aggregati in 500 ml di DMEM senza FBS, P / S, o L-GLUT. Prendete questo 500 risospensione microlitri e aggiungerla al 3 ml 1% Mezzi di metilcellulosa supplementato con 10 ng / ml di TPO, evitando accuratamente la formazione di bolle. Piastra volumi uguali di questa miscela in 3 35 x 10 mm non trattato piatti della cultura perCFU Saggi 12. </li><li> Come controllo, la cultura irradiato aggregati placentari senza mescolando in MEF riprogrammate 4-5 giorni e posto in saggi di CFU come sopra descritto ai punti 4.7-4.16. NOTA: Questi aggregati da solo non formano colonie. </li><li> Contare le colonie ematopoietiche manualmente al microscopio dopo 10-14 giorni di coltura a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cytospin 22 raccolse colonie per mostrare fenotipo morfologica delle singole cellule. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Generazione HSPCs de novo da cellule somatiche facilmente raggiungibili offre un metodo unico per studiare ematopoiesi in vitro, e la possibilità di potenzialmente applicare questa tecnologia al sistema umano. Questa traduzione genererebbe un nuovo strumento per studiare la malattia ematologica umana in un piatto, oltre a fornire le piattaforme di prova della droga e gene targeting opportunità per il trattamento di numerose malattie con terapie nuove o trapianti di CSE. Nel campo, recenti studi hanno a...

Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso in cui le cellule staminali ematopoietiche (CSE) germogliano fuori endotelio hemogenic presente in una varietà di siti emopoietiche embrionali, come l&#39;aorta-gonadi-Mesonefro e la placenta 1,2. L&#39;incapacità di coltura in vitro CSE impedisce approfondita analisi di questo processo così come l&#39;applicazione clinica di questi studi. Per aggirare questa limitazione, studi precedenti hanno tentato di derivare cellule staminali emopoietiche de novo sia attraverso la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti (PSC) 3, o la plasticità indotta nelle cellule somatiche e la differenziazione diretto utilizzo di supporti riprogrammazione 4,5. Questi studi, tuttavia, non generano le cellule engraftable clinicamente sicuri o consentono lo studio di emopoiesi sviluppo definitivo &quot;in un piatto.&quot; Le cellule staminali pluripotenti Il lavoro romanzo stabilito da Yamanaka e colleghi di generare indotto (iPSCs) da fibroblasti somatica provides un quadro di fattore di trascrizione (TF) strategie basate iperespressione nella cella riprogrammazione destino 6,7. Questo lavoro ha spinto i ricercatori in diversi settori per generare tipi di cellule di scelta tramite TF riprogrammazione delle cellule somatiche facilmente ottenibili. L&#39;obiettivo della strategia di riprogrammazione qui descritto è quello di indurre un processo hemogenic da cellule somatiche di topo usando un approccio riprogrammazione TF base con l&#39;obiettivo di tradurre questi risultati per il sistema umano di riprogrammare fibroblasti paziente-specifici al fine di studiare ematopoiesi umana in vitro e generare prodotti sanguigni paziente-specifici per la modellazione della malattia, test anti-droga, e trapianto di cellule staminali. Il primo passo per assicurare una corretta riprogrammazione in questo sistema il mouse è stato quello di sviluppare una linea giornalista che è servito come un read-out per l&#39;espressione di CD34, un marker conosciuto in cellule progenitrici endoteliali e cellule staminali emopoietiche. Per fare questo, le linee di topo transgenico huCD34-AS e teto-H2BGFP sono stati usati per generate topo transgenico fibroblasti embrionali doppie (MEF), ora indicati 34 / H2BGFP, che fluorescenza verde dopo l&#39;attivazione del promotore CD34 8. Questo ha permesso lo screening di una varietà di TF notoriamente richiesto in diversi punti durante specifica ematopoietico e sviluppo. Cominciando con 18 TF in PMX vettori retrovial (determinati attraverso la letteratura estrazione e profilatura di etichetta GFP trattenere HSC dalla descritto in precedenza 34 topi / H2BGFP), 34 / H2BGFP MEFs state trasdotte con tutti i fattori e coltivati ​​su AFT024 HSC-portante cellule stromali. Dopo il riconoscimento di 34 / H2BGFP attivazione, TF sono stati successivamente rimossi dal cocktail riprogrammazione fino a quando è stato identificato il set ottimale di TF per l&#39;attivazione giornalista. Dopo questa schermata iniziale, i fattori sono stati trasferiti in un sistema di inducibile vettore DOX pFUW per consentire l&#39;espressione controllabile dei TF. Dal momento che questi due sistemi controllabili DOX sono incompatibili (le celle 34 / H2BGFP e vettori inducibili pFUW), MEF dasono stati necessari wild-type C57BL / 6 topi. E &#39;stato anche necessario fornire un microambiente appropriato per consentire hemogenesis di procedere e creare progenitori clonogeniche multilineage. Gli studi attuali che tentano di riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPCs) hanno incontrato vari livelli di successo 9-11. Ad oggi, la generazione di entrambi i mouse e HSPCs trapiantabili umani con a lungo termine e di auto-rinnovamento capacità ripopolamento non è stato raggiunto utilizzando lo stesso set di TF. In questo protocollo, forniamo una descrizione dettagliata della strategia precedentemente stabilito per indurre riproducibile hemogenesis in MEF. Abbiamo dimostrato che l&#39;introduzione di un insieme minimo di TF (GATA2, Gfi1b, i CFO, e Etv6) è in grado di istigare un programma di sviluppo complesso in vitro che fornisce una piattaforma con la quale emopoiesi sviluppo e applicazione clinica di riprogrammazione ematopoietiche possono essere studiate ulteriormente 12.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>0,45 &mu; Filtri</td><td>M Corning</td><td>430625</td><td></td></tr><tr><td>Filtri ultra centrifughi</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini's Benchmark</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 18 G</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Aghi da 20 G Aghi</td><td>BD</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>25 G BD</td><td></td><td>305125</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo I</td><td>Sigma</td><td>C0130-100MG</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Myelocult media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>R & D Systems</td><td>455-MC</td><td></td></tr><tr><td>Flt3L</td><td>R & D Systems</td><td>427-FL</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>R & D Systems</td><td>403-ML</td><td></td></tr><tr><td>IL-6</td><td>R & D Systems</td><td>406-ML</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>R & D Systems</td><td>488-TO</td><td></td></tr><tr><td>Doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Polibrene (bromuro di esadimetrina)</td><td>Sigma</td><td>AL-118</td><td></td></tr><tr><td>Durapore 0.65 &mu; Filtri a membrana</td><td>M Millipore</td><td>DVPP14250</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa media</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>Methocult M3434</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>07904</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Sigma</td><td>G-1890 100g</td><td></td></tr><tr><td>pFUW-tetO</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #20321</td><td></td></tr><tr><td>Gata2</td><td>Origene</td><td>MR226728</td><td></td></tr><tr><td>Gfi1b</td><td>Origene</td><td>MR204861</td><td></td></tr><tr><td>cFos&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #19259</td><td></td></tr><tr><td>Etv6</td><td>Origene</td><td>MR207053</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #12259</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670-100g</td><td></td></tr><tr><td>FUW-M2rtTA</td><td></td><td>Addgene Plasmid #20342</td><td></td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm coltura piatti</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr></tbody></table>

riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma hemogenic

Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with Transcription Factors to Induce a Hemogenic Program

Questo protocollo descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo (MEF) tramite sovraespressione di fattori di trascrizione (TF). Per prima cosa abbiamo progettato uno screening reporter utilizzando MEF di topi transgenici doppi CD34-tTA/TetO-H2BGFP (34/H2BGFP). Le cellule CD34+ di questi topi marcano gli istoni H2B con GFP e cessano la marcatura dopo l'aggiunta di doxiciclina (DOX). Le MEFS sono state trasdotte con TF candidati e quindi osservate per l'emergere di cellule GFP+ che indicherebbero l'acquisizione di un destino cellulare ematopoietico o endoteliale. Partendo da 18 TF candidati, e attraverso un processo di eliminazione combinatoria, abbiamo ottenuto un insieme minimo di fattori che inducerebbero la più alta percentuale di cellule GFP+. Abbiamo scoperto che Gata2, Gfi1b e cFos erano necessari e l'aggiunta di Etv6 ha fornito l'induzione ottimale. Una serie di analisi dell'espressione genica eseguite in diversi momenti durante il processo di riprogrammazione ha rivelato che queste cellule sembravano passare attraverso una cellula precursore che ha subito una transizione da endoteliale a ematopoietica (EHT). In quanto tale, questo processo di riprogrammazione imita l'emopoiesi dello sviluppo "in un piatto", consentendo lo studio dell'emopoiesi in vitro e una piattaforma per identificare i meccanismi che sono alla base di questa specificazione. Questa metodologia fornisce anche un quadro per la traduzione di questo lavoro nel sistema umano nella speranza di generare una fonte alternativa di cellule staminali ematopoietiche (HSC) paziente-specifiche per una serie di applicazioni nel trattamento e nello studio delle malattie ematologiche.

Emopoiesi è un processo di sviluppo complesso che inizia in vari siti embrionali. Cellule endoteliali Hemogenic risiedono in questi siti e danno luogo a CSE tramite gemmazione delle cellule 23. Questo processo attualmente non può essere riprodotto mettendo CSE o precursori emopoietici nella cultura, che richiede una metodologia per ottenere in qualche modo queste cellule in vitro, sia per HSPC espansione ex vivo o la generazione de novo. Questo proto...

Il protocollo qui descritto descrive in dettaglio l'induzione di un programma emogenico nei fibroblasti embrionali di topo attraverso la sovraespressione di un insieme minimo di fattori di trascrizione. Questa tecnologia può essere tradotta nel sistema umano per fornire piattaforme per studi futuri sull'emopoiesi, la malattia ematologica e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche.

Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

This protocol details the induction of a hemogenic program in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) via overexpression of transcription factors (TFs). We ...

L'obiettivo generale di questo protocollo di induzione ematogena è innescare un processo di sviluppo in fibroblasti murini mediante sovraespressione di fattori di trascrizione per generare in vitro cellule precursori ematopoietiche che producano cellule ematopoietiche dopo una coltura prolungata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della programmazione ematopoietica, come ad esempio se sia possibile sviluppare un protocollo in grado di ottenere de novo cellule staminali ematopoietiche autentiche, capaci di differenziamento multilineage e di attecchimento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, grazie alla sovraespressione di un numero ridotto di fattori di trascrizione, è possibile avviare il processo di sviluppo in cellule riprogrammate senza dover passare attraverso un intermedio pluripotente.Dopo aver coltivato fibroblasti embrionali di topo o MEFS e aver prodotto il virus secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare gelatina allo 0,1 percento in PBS per pre-trattare le piastre a 6 pozzetti. Assicurarsi che la gelatina ricopra l'intera superficie del pozzetto. Collocare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per almeno 20 minuti.Quindi, rimuovere le piastre ed aspirare la gelatina. Seminare le MEF con DMEM standard a una densità di 25.000 cellule per pozzetto e lasciare che le cellule si attacchino a 37 gradi Celsius durante la notte. Preparare un cocktail virale di 100 microlitri mescolando 50 microlitri di M2RTTA e 12,5 microlitri ciascuno di GATA2, GFI1B, CFOS ed ETV6.Aspirare il mezzo dai MEF e aggiungere due millilitri di DMEM standard contenente 8 microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina. Quindi, trasdurre ogni pozzetto di MEF con 15 microlitri del cocktail virale e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo un'incubazione di 16-20 ore, sostituire il mezzo in ogni pozzetto con due millilitri di DMEM standard fresco, integrato con un microgrammo per millilitro di DOX.Incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Al quarto giorno, preparare il mezzo di coltura ematopoietico integrato con idrocortisone, fattore di crescita delle cellule staminali, ligando della tirosina chinasi tre correlato a MFS, interleuchina tre, interleuchina sei e DOX. Successivamente, aspirare il mezzo dai MEF e utilizzare un millilitro di PBS per lavare le cellule.Quindi, dopo aver aspirato il PBS, aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05 percento per pozzetto per dissociare e raccogliere le cellule. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro, quindi centrifugare a 300 ×g per cinque minuti e utilizzare 12 millilitri del mezzo ematopoietico appena preparato per risospendere le cellule. Successivamente, seminare 10.000 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti rivestite con gelatina.Ogni sei giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di coltura ematopoietico fresco e supplementato per tutta la durata della coltura. Analizzare le cellule secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo aver dissezionato le placentre da topi gravidi secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare da due a cinque millilitri di collaghenasi di tipo uno allo 0,2 percento in PBS con il 20 percento di FBS per lavare il tessuto e, utilizzando un ago da 18 gauge montato su una siringa da cinque millilitri, dissociare meccanicamente il tessuto nella soluzione PBS.Incubare le cellule placentari in due-cinque millilitri di soluzione di collaghenasi a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Successivamente, passare le cellule più volte attraverso aghi da 20-25 gauge montati su siringhe da 5 millilitri per dissociarle ulteriormente in modo meccanico. Poi, filtrare le sospensioni cellulari singole attraverso filtri cellulari da 70 micron.Quindi, utilizzando un emocitometro, contare le cellule e irradiarle a 2.000 centigray per l'inattivazione mitotica. Aggiungere dieci millilitri di mezzo di coltura ematopoietico integrato con i seguenti componenti a una piastra da dieci centimetri. Posizionare il filtro da 0,65 micron direttamente sul mezzo di coltura nella piastra, lasciandolo galleggiare per creare un'interfaccia liquido-gas e mettere da parte la piastra.Dissociare i MEF transdotti del giorno 25 come mostrato in precedenza in questo video e mescolare 33.000 dei MEF transdotti con 167.000 cellule degli aggregati placentari inattivati mitoticamente. Per generare un aggregato, centrifugare la miscela di cellule MEF e placentari a 300 × g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e utilizzare da 30 a 50 microlitri di DMEM standard per risospendere le cellule pellettizzate, aspirando la sospensione monocellulare in una punta di pipetta non biconica da 200 microlitri.Successivamente, sigillare la punta della pipetta con pellicola di paraffina. Quindi, inserire la punta bloccata in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti, in modo da formare un pellet all'estremità coperta della punta. Rimuovere con attenzione la punta dalla provetta da 15 millilitri e posizionarla sull'estremità di una pipetta P200.Scartare il film di paraffina ed espellere il pellet cellulare sul filtro galleggiante nella piastra con mezzo di coltura. Coltivare gli aggregati sui filtri galleggianti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per quattro o cinque giorni. Utilizzando una spatola per cellule, raccogliere gli aggregati, combinarli e digerirli con collaghenasi allo 0,5 percento.Dopo la dissociazione, utilizzare da due a cinque millilitri di PBS con il cinque percento di FBS per lavare gli aggregati e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Risospendere gli aggregati in 500 microlitri di DMEM senza FBS, Pen-Strep o L-glutamina. Aggiungere l'intera sospensione a tre millilitri di mezzo di metilcellulosa all'uno percento integrato con dieci nanogrammi per millilitro di Tepo, avendo cura di evitare la formazione di bolle.Piastrare volumi uguali di questa miscela in tre piatti di coltura non trattati da 35 per 10 millimetri per saggi di UFC. Come controllo, coltivare aggregati placentari irradiati. Infine, contare manualmente le colonie ematopoietiche al microscopio dopo 10-14 giorni di coltura a 37 gradi Celsius con il 5 percento di anidride carbonica.Nel processo di riprogrammazione dei MEF in HSC, le cellule vengono transdotte con fattori di trascrizione come mostrato qui. Dopo tre giorni di espansione e esposizione alla DOX per avviare l'attivazione del transgene, le cellule vengono dissociate, suddivise e coltivate su piastre rivestite con gelatina in mezzo ematopoietico supplementato. Al giorno 20 di coltura, dopo la transduzione con il mezzo di riprogrammazione, i MEF 34/H2BGFP assumono evidenti cambiamenti morfologici, inclusa una morfologia endoteliale distinta rispetto ai MEF.Un'ulteriore coltura fino al giorno 35 porta alla comparsa di diverse cellule rotonde simili a cellule ematopoietiche che emergono da intermedi simili a cellule endoteliali, positive per GFP e che risultano positive alla colorazione per i marcatori ematopoietici Sca1 e CD45. Un'ulteriore coltura determina cellule che esprimono CD45 mantenendo l'espressione del reporter umano CD34. Dopo l'aggregazione placentaria, le cellule in coltura acquisiscono potenziale clonogeno e generano colonie in metilcellulosa contenente diverse morfologie ematopoietiche e cellule di tipo blastico.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni sezione lentamente per non confondersi. Eventuali errori saranno difficili da notare fino a settimane dopo l'inizio del riprogrammazione. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come i saggi per cellule formanti colonie tipo selciato e i saggi per cellule iniziatrici di colture a lungo termine possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le cellule ottenute possiedono effettivamente funzione ematopoietica, come dimostrato nei saggi funzionali.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della programmazione delle cellule staminali ematopoietiche per esplorare altre strategie di riprogrammazione e protocolli di ottimizzazione nel sangue, nelle cellule endoteliali e in altri tipi cellulari. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come indurre un programma ematogenico nei fibroblasti murini, del modo di sovraesprimere i fattori di trascrizione e di come eseguire un saggio funzionale sulle cellule ottenute. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Questo video mostra la procedura per la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte con lentivirus inducibile che esprimono Oct4, Sox2, c-Myc e Klf4.

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Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

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Diretto lignaggio riprogrammazione di fibroblasti di topo adulto ai progenitori eritroidi

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La convalida sperimentale dell'attività dell'enhancer è meglio affrontata dall'analisi della perdita di funzione. Viene presentato un protocollo efficiente che utilizza la delezione mediata da CRISPR/Cas9 per studiare la regolazione allele-specifica della trascrizione genica nelle cellule ES F1 che contengono un genoma ibrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

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