Riprogrammazione fibroblasti embrionali di topo con fattori di trascrizione per indurre un programma Hemogenic

L'obiettivo generale di questo protocollo di induzione ematogena è innescare un processo di sviluppo in fibroblasti murini mediante sovraespressione di fattori di trascrizione per generare in vitro cellule precursori ematopoietiche che producano cellule ematopoietiche dopo una coltura prolungata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della programmazione ematopoietica, come ad esempio se sia possibile sviluppare un protocollo in grado di ottenere de novo cellule staminali ematopoietiche autentiche, capaci di differenziamento multilineage e di attecchimento. Il principale vantaggio di questa tecnica è che, grazie alla sovraespressione di un numero ridotto di fattori di trascrizione, è possibile avviare il processo di sviluppo in cellule riprogrammate senza dover passare attraverso un intermedio pluripotente.

Dopo aver coltivato fibroblasti embrionali di topo o MEFS e aver prodotto il virus secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare gelatina allo 0,1 percento in PBS per pre-trattare le piastre a 6 pozzetti. Assicurarsi che la gelatina ricopra l'intera superficie del pozzetto. Collocare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per almeno 20 minuti.

Quindi, rimuovere le piastre ed aspirare la gelatina. Seminare le MEF con DMEM standard a una densità di 25.000 cellule per pozzetto e lasciare che le cellule si attacchino a 37 gradi Celsius durante la notte. Preparare un cocktail virale di 100 microlitri mescolando 50 microlitri di M2RTTA e 12,5 microlitri ciascuno di GATA2, GFI1B, CFOS ed ETV6.

Aspirare il mezzo dai MEF e aggiungere due millilitri di DMEM standard contenente 8 microgrammi per millilitro di bromuro di esadimetrina. Quindi, trasdurre ogni pozzetto di MEF con 15 microlitri del cocktail virale e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte. Dopo un'incubazione di 16-20 ore, sostituire il mezzo in ogni pozzetto con due millilitri di DMEM standard fresco, integrato con un microgrammo per millilitro di DOX.

Incubare a 37 gradi Celsius per tre giorni. Al quarto giorno, preparare il mezzo di coltura ematopoietico integrato con idrocortisone, fattore di crescita delle cellule staminali, ligando della tirosina chinasi tre correlato a MFS, interleuchina tre, interleuchina sei e DOX. Successivamente, aspirare il mezzo dai MEF e utilizzare un millilitro di PBS per lavare le cellule.

Quindi, dopo aver aspirato il PBS, aggiungere un millilitro di tripsina allo 0,05 percento per pozzetto per dissociare e raccogliere le cellule. Contare le cellule utilizzando l'emocitometro, quindi centrifugare a 300 ×g per cinque minuti e utilizzare 12 millilitri del mezzo ematopoietico appena preparato per risospendere le cellule. Successivamente, seminare 10.000 cellule per pozzetto in piastre a sei pozzetti rivestite con gelatina.

Ogni sei giorni, sostituire il mezzo con un mezzo di coltura ematopoietico fresco e supplementato per tutta la durata della coltura. Analizzare le cellule secondo il protocollo descritto nel testo. Dopo aver dissezionato le placentre da topi gravidi secondo il protocollo descritto nel testo, utilizzare da due a cinque millilitri di collaghenasi di tipo uno allo 0,2 percento in PBS con il 20 percento di FBS per lavare il tessuto e, utilizzando un ago da 18 gauge montato su una siringa da cinque millilitri, dissociare meccanicamente il tessuto nella soluzione PBS.

Incubare le cellule placentari in due-cinque millilitri di soluzione di collaghenasi a 37 gradi Celsius per 1,5 ore. Successivamente, passare le cellule più volte attraverso aghi da 20-25 gauge montati su siringhe da 5 millilitri per dissociarle ulteriormente in modo meccanico. Poi, filtrare le sospensioni cellulari singole attraverso filtri cellulari da 70 micron.

Quindi, utilizzando un emocitometro, contare le cellule e irradiarle a 2.000 centigray per l'inattivazione mitotica. Aggiungere dieci millilitri di mezzo di coltura ematopoietico integrato con i seguenti componenti a una piastra da dieci centimetri. Posizionare il filtro da 0,65 micron direttamente sul mezzo di coltura nella piastra, lasciandolo galleggiare per creare un'interfaccia liquido-gas e mettere da parte la piastra.

Dissociare i MEF transdotti del giorno 25 come mostrato in precedenza in questo video e mescolare 33.000 dei MEF transdotti con 167.000 cellule degli aggregati placentari inattivati mitoticamente. Per generare un aggregato, centrifugare la miscela di cellule MEF e placentari a 300 × g per cinque minuti. Aspirare il mezzo e utilizzare da 30 a 50 microlitri di DMEM standard per risospendere le cellule pellettizzate, aspirando la sospensione monocellulare in una punta di pipetta non biconica da 200 microlitri.

Successivamente, sigillare la punta della pipetta con pellicola di paraffina. Quindi, inserire la punta bloccata in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti, in modo da formare un pellet all'estremità coperta della punta. Rimuovere con attenzione la punta dalla provetta da 15 millilitri e posizionarla sull'estremità di una pipetta P200.

Scartare il film di paraffina ed espellere il pellet cellulare sul filtro galleggiante nella piastra con mezzo di coltura. Coltivare gli aggregati sui filtri galleggianti a 37 gradi Celsius e al cinque percento di anidride carbonica per quattro o cinque giorni. Utilizzando una spatola per cellule, raccogliere gli aggregati, combinarli e digerirli con collaghenasi allo 0,5 percento.

Dopo la dissociazione, utilizzare da due a cinque millilitri di PBS con il cinque percento di FBS per lavare gli aggregati e centrifugare a 300 ×g per cinque minuti. Risospendere gli aggregati in 500 microlitri di DMEM senza FBS, Pen-Strep o L-glutamina. Aggiungere l'intera sospensione a tre millilitri di mezzo di metilcellulosa all'uno percento integrato con dieci nanogrammi per millilitro di Tepo, avendo cura di evitare la formazione di bolle.

Piastrare volumi uguali di questa miscela in tre piatti di coltura non trattati da 35 per 10 millimetri per saggi di UFC. Come controllo, coltivare aggregati placentari irradiati. Infine, contare manualmente le colonie ematopoietiche al microscopio dopo 10-14 giorni di coltura a 37 gradi Celsius con il 5 percento di anidride carbonica.

Nel processo di riprogrammazione dei MEF in HSC, le cellule vengono transdotte con fattori di trascrizione come mostrato qui. Dopo tre giorni di espansione e esposizione alla DOX per avviare l'attivazione del transgene, le cellule vengono dissociate, suddivise e coltivate su piastre rivestite con gelatina in mezzo ematopoietico supplementato. Al giorno 20 di coltura, dopo la transduzione con il mezzo di riprogrammazione, i MEF 34/H2BGFP assumono evidenti cambiamenti morfologici, inclusa una morfologia endoteliale distinta rispetto ai MEF.

Un'ulteriore coltura fino al giorno 35 porta alla comparsa di diverse cellule rotonde simili a cellule ematopoietiche che emergono da intermedi simili a cellule endoteliali, positive per GFP e che risultano positive alla colorazione per i marcatori ematopoietici Sca1 e CD45. Un'ulteriore coltura determina cellule che esprimono CD45 mantenendo l'espressione del reporter umano CD34. Dopo l'aggregazione placentaria, le cellule in coltura acquisiscono potenziale clonogeno e generano colonie in metilcellulosa contenente diverse morfologie ematopoietiche e cellule di tipo blastico.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni sezione lentamente per non confondersi. Eventuali errori saranno difficili da notare fino a settimane dopo l'inizio del riprogrammazione. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come i saggi per cellule formanti colonie tipo selciato e i saggi per cellule iniziatrici di colture a lungo termine possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se le cellule ottenute possiedono effettivamente funzione ematopoietica, come dimostrato nei saggi funzionali.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della programmazione delle cellule staminali ematopoietiche per esplorare altre strategie di riprogrammazione e protocolli di ottimizzazione nel sangue, nelle cellule endoteliali e in altri tipi cellulari. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come indurre un programma ematogenico nei fibroblasti murini, del modo di sovraesprimere i fattori di trascrizione e di come eseguire un saggio funzionale sulle cellule ottenute. Grazie per aver guardato il video e buona fortuna con i vostri esperimenti.