Name: Preparazione del campione per lanalisi di massa Citometria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Impara la preparazione dei campioni per la citometria di massa con marcatura anticorpale coerente. Questo metodo consente l'analisi di popolazioni cellulari eterogenee a livello di singola cellula per studi di biologia cellulare e neuroscienza.

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Il lavoro nel laboratorio Barton è stato supportato da una sovvenzione del Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). Questa ricerca è stata in parte supportata da una borsa di studio per la formazione per Ryan L. McCarthy dal National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. La struttura principale che mantiene e gestisce la macchina per citometria di massa è supportata dalla sovvenzione CPRIT (RP121010) e dalla sovvenzione centrale NIH (CA016672).

<ol><li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> J Vis Exp. , e4398(2012).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+step+on+the+path+to+mass+cytometry+standardization%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Another step on the path to mass cytometry standardization.</a> Cytometry A. 87, 380-382 (2015).</li>
<li>Newell, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+tetramer+staining+and+mass+cytometry+analysis+facilitate+T-cell+epitope+mapping+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization.</a> Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).</li>
<li>Leong, M. L., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Peptide-MHC+Tetramer+Staining+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).</li>
<li>Zunder, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry A. 87, 369-374 (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry A. 81, 467-475 (2012).</li>
<li>Krutzik, P. O., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cell+barcoding+in+flow+cytometry+allows+high-throughput+drug+screening+and+signaling+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling.</a> Nat Methods. 3, 361-368 (2006).</li>
<li>Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+adapted+to+measurements+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle.</a> Cytometry A. 81, 552-566 (2012).</li>
<li>Edgar, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hypoxic+cells+using+an+organotellurium+tag+compatible+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Horowitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+determinants+of+human+NK+cell+diversity+revealed+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry.</a> Sci Transl Med. 5, 208ra145(2013).</li>
<li>Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+molecular+roadmap+to+iPSC+reprogramming+through+progression+analysis+of+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry.</a> Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).</li>
<li>Han, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+intracellular+survival%2Fproliferative+signaling+in+FLT3-ITD-mutated+AML+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells.</a> Cytometry A. 87, 346-356 (2015).</li>
<li>Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+trajectory+detection+uncovers+progression+and+regulatory+coordination+in+human+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development.</a> Cell. 157, 714-725 (2014).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).</li>
<li>Behbehani, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+partial+permeabilization+with+saponin+enables+cellular+barcoding+prior+to+surface+marker+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining.</a> Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).</li>
<li>Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry A. 83, 483-494 (2013).</li>
<li>Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algorithmic+Tools+for+Mining+High-Dimensional+Cytometry+Data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data.</a> J Immunol. 195, 773-779 (2015).</li>
<li>Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+discovery+and+characterization+of+cell+subsets+in+high+dimensional+mass+cytometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data.</a> Methods. 82, 55-63 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+Phenotypes+and+Signaling+Networks+of+Single+Human+Cells+by+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry.</a> Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).</li>
<li>van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v9/vandermaaten08a.html">Visualizaing Data using t-SNE.</a> J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).</li>
<li>Kling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry%3A+Measure+for+measure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cytometry: Measure for measure.</a> Nature. 518, 439-443 (2015).</li>
<li>Gregori, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral cytometry.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).</li>
<li>Chattopadhyay, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brilliant+violet+fluorophores%3A+a+new+class+of+ultrabright+fluorescent+compounds+for+immunofluorescence+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments.</a> Cytometry A. 81, 456-466 (2012).</li>
<li>Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-FISH%3A+Analysis+of+cellular+RNA+expression+patterns+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+simultaneous+detection+of+RNAs+and+proteins+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells.</a> Nat Methods. 13, 269-275 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo presentato qui è stato impiegato con successo per il trattamento di varie linee in coltura di cellule (H1 e H9 hESC, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) e campioni di tessuti primari (midollo osseo di topo, il mouse del fegato embrionale, il mouse per adulti fegato, tumore mouse). Indipendentemente dalla fonte, qualsiasi tessuto che può essere dissociato in singole cellule preservando lo stato cellulare dovrebbe essere suscettibile di analisi mediante citometria di massa, ma può richiedere alcuni ott...

Citometria consente la misurazione simultanea di più target anticorpali a livello di singola cellula attraverso grandi popolazioni di cellule. Nel tradizionale citometria di flusso basato sulla fluorescenza, il numero di parametri che possono essere quantificate è limitato dalla sovrapposizione spettrale tra lo spettro di emissione dei fluorofori multipli, che richiede calcoli di compensazione sempre più complessi come il numero di parametri aumenta. Queste limitazioni sono rivolte in massa citometria, dove vengono rilevati e quantificati mediante tempo di volo (TOF) spettrometria di massa per espandere notevolmente il numero di parametri raccolti simultaneamente e produrre un alto dimensionale profilo proteico-abbondanza per ogni singola cella anticorpi metallo coniugati pesanti. Una conoscenza di base del funzionamento della massa citometria strumento è vantaggioso per l&#39;utente e può essere essenziale per la risoluzione dei problemi. Per una descrizione più approfondita di messa a punto e l&#39;esecuzione di una macchina citometria di massa,consultare il relativo manoscritto 1. Brevemente, un campione di cellule è etichettato con un pannello di metallo anticorpi coniugati destinati marcatori di superficie cellulare, le proteine citoplasmatiche, proteine nucleari, proteine cromatina-bound o altri epitopi di interesse (Figura 1i). Le cellule marcate vengono caricate sulla macchina, uno alla volta mediante iniezione manuale o mediante un autocampionatore che i campioni da una piastra a 96 pozzetti. Le cellule caricate vengono iniettate attraverso un nebulizzatore, che genera uno spruzzo di goccioline di liquido che incapsulano le cellule (Figura 1ii). Questo spray è posizionato in modo che le cellule vengono ionizzati da una torcia al plasma di argon. Questo ionizzazione genera una nube di particelle comprendente tutti gli atomi costituenti ciascuna cella (Figura 1iii). Poiché questa nube particella viaggia verso il rivelatore, bassi atomi di massa atomica sono separati dalle alte ioni massa da un filtro di massa a quadrupolo. I restanti alti ioni di massa continuano al rivelatore, dove l&#39;abundance di ciascun isotopo viene quantificato (Figura 1iv). I dati grezzi raccolti dal rivelatore, vengono analizzati dal software dello strumento citometria di massa per identificare gli eventi cellulari. Per ciascun evento cella identificata, il segnale rilevato in ciascun canale viene quantificata e salvata in un file un&#39;uscita .fcs. I canali di massa utilizzati per rilevare gli anticorpi metallo pesante coniugati presentano minima sovrapposizione spettrale, che va da 0,4% con la maggior parte dei contributi inferiori all&#39;1%. A causa di questa cross-talk tra i canali, è generalmente necessario trasformare i dati con una matrice di compensazione prima dell&#39;analisi 2. Tuttavia, occorre prestare attenzione durante la progettazione del pannello sperimentale di anticorpi per garantire che un anticorpo con un epitopo alta abbondanza non è assegnato a un canale di massa che contribuisce segnale ad un canale assegnato ad un anticorpo a bassa abbondanza, in quanto ciò può creare artificialmente elevati della popolazione nel canale di ricezione del segnale del contributo. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; La preparazione esatta di campioni per analisi di citometria di massa dipende fortemente i tipi di campioni che vengono raccolti e l&#39;ipotesi sperimentale in fase di test. Forniamo esempi di due protocolli per la raccolta diversi tipi di cellule (cellule staminali embrionali umane) e cellule primarie (topo tumore mammario isolare cellule epiteliali). Quando si inizia uno studio citometria di massa, si consiglia di effettuare prima un piccolo esperimento pilota per garantire che tutti i protocolli e gli anticorpi per essere utilizzati stanno lavorando bene nelle mani del ricercatore. Questo è particolarmente importante quando devono essere utilizzati anticorpi coniugati personalizzati, come la reazione di riduzione parziale durante la coniugazione anticorpo ha il potenziale di distruggere affinità anticorpale; Pertanto, ogni anticorpo personalizzato deve essere convalidata empiricamente per assicurare l&#39;accuratezza dei dati. Altre considerazioni includono la determinazione se gli anticorpi superficie cellulare da utilizzare nel saggio riconoscerà loro epitopi dopo fissazione o se NEEd da applicare per vivere le cellule. Alcuni fissaggio può impedire il corretto colorazione con anticorpi superficie cellulare come noto verifica con peptide-MHC colorazione 3, 4. Esecuzione di superficie cellulare colorazione anticorpale su cellule vive può essere necessario per alcuni anticorpi, ma esclude la possibilità di codici a barre prima dell&#39;etichettatura anticorpo come maggior parte dei metodi di codici a barre vengono eseguiti dopo fissazione 5 sebbene codici a barre a base di anticorpi 6, 7 è un&#39;eccezione. Nel determinare il numero di cellule da preparare per l&#39;analisi, è importante sapere che solo una frazione delle cellule caricate sulla macchina sarà rilevato e produrre dati. Questa perdita è dovuta in primo luogo a inefficienze quando il nebulizzatore spray campione al cannello. La perdita percentuale esatta dipende dalla massa citometria configurazione della macchina e tipo cellulare, ma può variare da 50-85% e deve essereconsiderati quando si progetta l&#39;esperimento. Questo protocollo è stato ottimizzato per 2x10 6 cellule per campione, ma può essere adatta a lavorare campioni di dimensioni più piccole o più grandi. Questo protocollo può essere utilizzato con minime modifiche per dimensioni del campione da 1 x 10 6 a 4 x 10 6, tuttavia è fondamentale che la dimensione del campione essere mantenuta costante in un esperimento. Cambiamenti nel numero di cellule possono influenzare l&#39;intensità dei codici a barre e colorazione degli anticorpi ed essere comunque ridotti all&#39;incirca costante attraverso campioni da confrontare direttamente. Alcune procedure, come l&#39;etichettatura di cellule morte e l&#39;etichettatura del DNA, devono essere effettuate nella stragrande maggioranza, se non tutti i disegni sperimentali. L&#39;etichettatura di cellule morte in esperimenti analizzare solo marcatori di superficie può essere ottenuta utilizzando Rh103, ma Rh103 dovrebbe essere evitato per esperimenti in cui è richiesta permeabilizzazione come si verifica una perdita di colorazione. Per gli esperimenti che coinvolgono permeabilizzazione, si consiglia di utilizzare cisplatino Campioni codici a barre possono ridurre il consumo di anticorpi, ridurre il tempo di acquisizione ed eliminare campione a campione variabilità 9. Il processo di barcoding comporta l&#39;applicazione di un codice specifico di esempio unico per tutte le celle, che viene utilizzato per assegnare ogni cella per il campione di origine. Dopo barcoding i campioni possono essere riuniti prima della colorazione anticorpale, un processo che assicura tutti i campioni sono macchiati ugualmente. Per ridurre al minimo errore sperimentale, è prudente codice a barre e piscina i campioni che devono essere direttamente confrontate tra di loro. Attualmente esistono diversi metodi per codici a barre dei campioni per l&#39;analisi di citometria di massa 5, 6, 7, due dei quali sono qui presentati (vedi sotto). Con Reagen attualmente disponibilits è possibile quantificare l&#39;abbondanza di 38 bersagli degli anticorpi, identificare le cellule in fase S 10, distinguere le cellule vive e morte 8 e misurare i livelli cellulari di ipossia 11 in un esperimento multiplex di campioni multipli. Questa capacità di raccogliere dati monocellulari alta parametro per grandi popolazioni cellulari consente una migliore profilatura di popolazioni cellulari altamente eterogenee e ha già prodotto una serie di dati biologici nuovi 12, 13, 14, 15, 16. Distillando i dati complesso risultante per informazioni interpretabili ha richiesto l&#39;uso di algoritmi di calcolo includendo Spanning Tree progressione della densità Eventi normalizzati (SPADE) 17 e 18 viSNE. Questo articolo presenta una accessibilipanoramica di come progettare e realizzare una massa citometria esperimento e introduce analisi di base della massa citometria dati.

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 kit medio</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>05850</td><td>Caldo a temperatura ambiente prima dell'uso</td></tr><tr><td>DMEM F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>11330-032</td><td>Caldo a 37&nbsp; &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell technologies</td><td>07920</td><td>Caldo a 37&nbsp; &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Equitech</td><td>BAH62</td><td></td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Cell ID Pt194</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>Fornito a 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cell ID Pt195</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>fornito a 1&nbsp; </td></tr><tr><td>mM Cell ID Pt196</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>fornito a 1&nbsp; mM</td></tr><tr><td>Cisplatino</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-400-040-M250</td><td>Solubile a 25&nbsp; mg/mL in DMSO</td></tr><tr><td>Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit</td><td>Fluidigm</td><td>201060</td><td></td></tr><tr><td>5-Iodo-2'-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7125</td><td>solubile a 74&nbsp; mg/mL in 0,2&nbsp; N NaOH</td></tr><tr><td>Rodio 103 agente intercelante</td><td>Fluidigm</td><td>201103A</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher</td><td>BP1105-4</td><td>Raffreddare a -20&nbsp; &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Sodio Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>5 mL provette a fondo tondo</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 35 &#956; m tubi con tappo del filtro</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>EQ perle di calibrazione a quattro elementi</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi Tipo I-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi da Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi monouso #10</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z69239</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del campione per l&#39;analisi di massa citometria

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Massa utilizza citometria anticorpi coniugati con le etichette di metalli pesanti, un approccio che ha notevolmente aumentato il numero di parametri e opportunità per l&#39;analisi pozzo profondo di quanto sia possibile con i tradizionali flusso basato sulla fluorescenza citometria. Come per ogni nuova tecnologia, ci sono passaggi critici che aiutano a garantire la generazione affidabile di dati di alta qualità. Qui presentata è un protocollo ottimizzato che comprende molteplici tecniche per il trattamento di campioni di cellule per l&#39;analisi di citometria di massa. I metodi descritti qui aiuterà l&#39;utente a evitare problemi comuni e raggiungere risultati coerenti minimizzando variabilità, che può portare a dati accurati. Per informare disegno sperimentale, la logica alla base operazioni opzionali o alternative nel protocollo e la loro efficacia nello scoprire nuove scoperte nella biologia del sistema oggetto di indagine è coperto. Infine, i dati rappresentativi è presentato per illustrare i risultati attesi dalle tecniche Presented qui.

Il protocollo presentato qui può essere ampiamente applicata ad una vasta gamma di campioni di cellule in coltura e primario con modifiche solo minori. A seconda delle esigenze dell'esperimento, può essere eseguita in modo modulare quando alcuni elementi, come codici a barre o superficie cellulare colorazione, non sono necessarie. Utilizzato nella sua interezza questo protocollo consente la preparazione di massa multiplato citometria campioni etichettati per identificazione popolazione m...

Questo articolo descrive la raccolta e l'elaborazione di campioni per l'analisi della citometria di massa.

Preparazione del campione per l&#39;analisi di massa Citometria

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

L'obiettivo generale di questo processo di preparazione dei campioni è quello di produrre una colorazione anticorpale robusta e coerente di campioni diversi per consentire l'interrogazione di popolazioni cellulari eterogenee. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande sull'identità cellulare, la segnalazione cellulare e la risposta cellulare in una popolazione cellulare eterogenea complessa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione di livelli proteici ad alto parametro a livello di singola cellula.A dimostrare questa procedura sarà Aundrietta Duncan, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Per ogni singolo campione di sospensione cellulare, ri-sospenderlo a quattro volte da 10 a una sesta cellula per millilitro in terreno privo di siero, aggiungere 500 microlitri di 50 MicroMolar Cisplatino per 2/10 appena preparati nelle sei cellule e incubare i campioni su un agitatore orbitale con miscelazione costante a temperatura ambiente. Dopo un minuto, spegnere il cisplatino con un volume uguale di tampone di lavaggio e centrifugare le cellule.Scartare il surnatante e lavare i campioni altre due volte aggiungendo 500 microlitri di tampone di lavaggio, centrifugando le cellule e versando il tampone di lavaggio. Seguire due lavaggi in 500 microlitri di PBS, centrifugando in modo simile i campioni e scartando il surnatante. Dopo il secondo lavaggio PBS, risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS fresco e fissare le celle con 500 microlitri di PFA al 4%.Pipettare le cellule per mescolarle. Quindi posizionare i campioni sull'agitatore orbitale mescolando costantemente per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, versare il surnatante e seguire un lavaggio in PBS fresco.Per permeabilizzare le cellule, centrifugare nuovamente le cellule e scartare i surnatanti. Risospendere i campioni nel PBS residuo mediante vortice delicato e aggiungere immediatamente un millilitro di metanolo al 100% per 2/10 10 alle seste cellule con un pipettaggio delicato. Incubare i campioni a quattro gradi per almeno un'ora e, al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule.Successivamente, versare il metanolo. Quindi lavare i pellet in un millilitro di tampone di lavaggio per ogni millilitro di metanolo, seguito da altri due lavaggi in 500 microlitri di tampone di lavaggio fresco. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata su 50 microlitri, trasferire il tampone di lavaggio rimanente da ciascun pellet in una provetta del cocktail di anticorpi corrispondente appropriato.Pipettare la soluzione combinata senza aspirare aria nel puntale, tenendo lo stantuffo parzialmente premuto. Quindi trasferire il puntale della pipetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di tampone di lavaggio senza rilasciare lo stantuffo. Rilasciare lo stantuffo, prelevare il tampone di lavaggio per un volume totale del cocktail di anticorpi di 50 microlitri ed etichettare il campione corrispondente appropriato con il cocktail di anticorpi aspirati mediante pipettaggio delicato.Dopo un'ora a temperatura ambiente con agitazione costante, lavare i campioni quattro volte, versando ogni volta il tampone di lavaggio. Per etichettare le celle con iridio, risospendere i pellet finali in 500 microlitri di PBS, seguiti dall'aggiunta di 500 microlitri di PFA al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di iridio nanomolare 62,5 nanomolare e PFA appena preparati ai campioni per altri 15 minuti di agitazione a temperatura ambiente.Quindi, centrifugare le cellule, versare il surnatante e seguire due lavaggi in 500 microlitri di BSA allo 0,1% e acqua deionizzata filtrata. Analizzare i campioni aggiungendo microsfere di normalizzazione nei pozzetti delle piastre dei campioni, pipettando le cellule in questi pozzetti e quindi eseguendo la citometria di massa entro 24 ore. Dopo la normalizzazione dell'intensità del segnale, le perle di calibrazione possono essere rimosse dai dati mediante il gating sulla popolazione negativa delle microsfere positive all'iridio 191.Gli eventi di singole cellule possono quindi essere controllati per rimuovere i detriti e i multipletti cellulari utilizzando un grafico biassiale dell'espressione negativa dell'iridio 193 rispetto alla lunghezza dell'evento. La marcatura del cisplatino può essere utilizzata per misurare la quantità di profondità cellulare. Ad esempio, qui vengono mostrati campioni con quantità basse e maggiori di cellule morte.Le cellule morte possono essere rimosse eliminando la popolazione positiva al platino 198, il codice a barre si traduce in una netta separazione dei campioni all'interno dei parametri di codifica a barre, consentendo alle cellule di essere assegnate alle loro identità di campione originali. L'etichettatura IDU può essere utilizzata per rilevare le cellule facciali statunitensi osservate qui. Dopo la normalizzazione iniziale, il de-barcoding e il gating, i dati ad alta dimensionalità possono essere analizzati utilizzando l'algoritmo SPADE per generare una rappresentazione dimensionale inferiore dei dati che è più suscettibile di interpretazione visiva.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro quattro-sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la perdita di campione durante la fase di lavaggio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni per l'analisi della citometria di massa.Non dimenticare che lavorare con l'azide di sodio può essere pericoloso, quindi dovresti usare precauzioni come indossare DPI adeguati quando esegui questa procedura.

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