Preparazione del campione per l'analisi di massa Citometria

L'obiettivo generale di questo processo di preparazione dei campioni è quello di produrre una colorazione anticorpale robusta e coerente di campioni diversi per consentire l'interrogazione di popolazioni cellulari eterogenee. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande sull'identità cellulare, la segnalazione cellulare e la risposta cellulare in una popolazione cellulare eterogenea complessa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione di livelli proteici ad alto parametro a livello di singola cellula.

A dimostrare questa procedura sarà Aundrietta Duncan, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Per ogni singolo campione di sospensione cellulare, ri-sospenderlo a quattro volte da 10 a una sesta cellula per millilitro in terreno privo di siero, aggiungere 500 microlitri di 50 MicroMolar Cisplatino per 2/10 appena preparati nelle sei cellule e incubare i campioni su un agitatore orbitale con miscelazione costante a temperatura ambiente. Dopo un minuto, spegnere il cisplatino con un volume uguale di tampone di lavaggio e centrifugare le cellule.

Scartare il surnatante e lavare i campioni altre due volte aggiungendo 500 microlitri di tampone di lavaggio, centrifugando le cellule e versando il tampone di lavaggio. Seguire due lavaggi in 500 microlitri di PBS, centrifugando in modo simile i campioni e scartando il surnatante. Dopo il secondo lavaggio PBS, risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS fresco e fissare le celle con 500 microlitri di PFA al 4%.

Pipettare le cellule per mescolarle. Quindi posizionare i campioni sull'agitatore orbitale mescolando costantemente per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, versare il surnatante e seguire un lavaggio in PBS fresco.

Per permeabilizzare le cellule, centrifugare nuovamente le cellule e scartare i surnatanti. Risospendere i campioni nel PBS residuo mediante vortice delicato e aggiungere immediatamente un millilitro di metanolo al 100% per 2/10 10 alle seste cellule con un pipettaggio delicato. Incubare i campioni a quattro gradi per almeno un'ora e, al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule.

Successivamente, versare il metanolo. Quindi lavare i pellet in un millilitro di tampone di lavaggio per ogni millilitro di metanolo, seguito da altri due lavaggi in 500 microlitri di tampone di lavaggio fresco. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata su 50 microlitri, trasferire il tampone di lavaggio rimanente da ciascun pellet in una provetta del cocktail di anticorpi corrispondente appropriato.

Pipettare la soluzione combinata senza aspirare aria nel puntale, tenendo lo stantuffo parzialmente premuto. Quindi trasferire il puntale della pipetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di tampone di lavaggio senza rilasciare lo stantuffo. Rilasciare lo stantuffo, prelevare il tampone di lavaggio per un volume totale del cocktail di anticorpi di 50 microlitri ed etichettare il campione corrispondente appropriato con il cocktail di anticorpi aspirati mediante pipettaggio delicato.

Dopo un'ora a temperatura ambiente con agitazione costante, lavare i campioni quattro volte, versando ogni volta il tampone di lavaggio. Per etichettare le celle con iridio, risospendere i pellet finali in 500 microlitri di PBS, seguiti dall'aggiunta di 500 microlitri di PFA al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di iridio nanomolare 62,5 nanomolare e PFA appena preparati ai campioni per altri 15 minuti di agitazione a temperatura ambiente.

Quindi, centrifugare le cellule, versare il surnatante e seguire due lavaggi in 500 microlitri di BSA allo 0,1% e acqua deionizzata filtrata. Analizzare i campioni aggiungendo microsfere di normalizzazione nei pozzetti delle piastre dei campioni, pipettando le cellule in questi pozzetti e quindi eseguendo la citometria di massa entro 24 ore. Dopo la normalizzazione dell'intensità del segnale, le perle di calibrazione possono essere rimosse dai dati mediante il gating sulla popolazione negativa delle microsfere positive all'iridio 191.

Gli eventi di singole cellule possono quindi essere controllati per rimuovere i detriti e i multipletti cellulari utilizzando un grafico biassiale dell'espressione negativa dell'iridio 193 rispetto alla lunghezza dell'evento. La marcatura del cisplatino può essere utilizzata per misurare la quantità di profondità cellulare. Ad esempio, qui vengono mostrati campioni con quantità basse e maggiori di cellule morte.

Le cellule morte possono essere rimosse eliminando la popolazione positiva al platino 198, il codice a barre si traduce in una netta separazione dei campioni all'interno dei parametri di codifica a barre, consentendo alle cellule di essere assegnate alle loro identità di campione originali. L'etichettatura IDU può essere utilizzata per rilevare le cellule facciali statunitensi osservate qui. Dopo la normalizzazione iniziale, il de-barcoding e il gating, i dati ad alta dimensionalità possono essere analizzati utilizzando l'algoritmo SPADE per generare una rappresentazione dimensionale inferiore dei dati che è più suscettibile di interpretazione visiva.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro quattro-sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la perdita di campione durante la fase di lavaggio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni per l'analisi della citometria di massa.

Non dimenticare che lavorare con l'azide di sodio può essere pericoloso, quindi dovresti usare precauzioni come indossare DPI adeguati quando esegui questa procedura.