Preparazione del campione per l'analisi di massa Citometria
29 aprile 2017
Questo articolo descrive la raccolta e l'elaborazione di campioni per l'analisi della citometria di massa.
L'obiettivo generale di questo processo di preparazione dei campioni è quello di produrre una colorazione anticorpale robusta e coerente di campioni diversi per consentire l'interrogazione di popolazioni cellulari eterogenee. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande sull'identità cellulare, la segnalazione cellulare e la risposta cellulare in una popolazione cellulare eterogenea complessa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione di livelli proteici ad alto parametro a livello di singola cellula.
A dimostrare questa procedura sarà Aundrietta Duncan, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Per ogni singolo campione di sospensione cellulare, ri-sospenderlo a quattro volte da 10 a una sesta cellula per millilitro in terreno privo di siero, aggiungere 500 microlitri di 50 MicroMolar Cisplatino per 2/10 appena preparati nelle sei cellule e incubare i campioni su un agitatore orbitale con miscelazione costante a temperatura ambiente. Dopo un minuto, spegnere il cisplatino con un volume uguale di tampone di lavaggio e centrifugare le cellule.
Scartare il surnatante e lavare i campioni altre due volte aggiungendo 500 microlitri di tampone di lavaggio, centrifugando le cellule e versando il tampone di lavaggio. Seguire due lavaggi in 500 microlitri di PBS, centrifugando in modo simile i campioni e scartando il surnatante. Dopo il secondo lavaggio PBS, risospendere i pellet in 500 microlitri di PBS fresco e fissare le celle con 500 microlitri di PFA al 4%.
Pipettare le cellule per mescolarle. Quindi posizionare i campioni sull'agitatore orbitale mescolando costantemente per 15 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, pellettare le cellule mediante centrifugazione, versare il surnatante e seguire un lavaggio in PBS fresco.
Per permeabilizzare le cellule, centrifugare nuovamente le cellule e scartare i surnatanti. Risospendere i campioni nel PBS residuo mediante vortice delicato e aggiungere immediatamente un millilitro di metanolo al 100% per 2/10 10 alle seste cellule con un pipettaggio delicato. Incubare i campioni a quattro gradi per almeno un'ora e, al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule.
Successivamente, versare il metanolo. Quindi lavare i pellet in un millilitro di tampone di lavaggio per ogni millilitro di metanolo, seguito da altri due lavaggi in 500 microlitri di tampone di lavaggio fresco. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri impostata su 50 microlitri, trasferire il tampone di lavaggio rimanente da ciascun pellet in una provetta del cocktail di anticorpi corrispondente appropriato.
Pipettare la soluzione combinata senza aspirare aria nel puntale, tenendo lo stantuffo parzialmente premuto. Quindi trasferire il puntale della pipetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 500 microlitri di tampone di lavaggio senza rilasciare lo stantuffo. Rilasciare lo stantuffo, prelevare il tampone di lavaggio per un volume totale del cocktail di anticorpi di 50 microlitri ed etichettare il campione corrispondente appropriato con il cocktail di anticorpi aspirati mediante pipettaggio delicato.
Dopo un'ora a temperatura ambiente con agitazione costante, lavare i campioni quattro volte, versando ogni volta il tampone di lavaggio. Per etichettare le celle con iridio, risospendere i pellet finali in 500 microlitri di PBS, seguiti dall'aggiunta di 500 microlitri di PFA al quattro percento per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di iridio nanomolare 62,5 nanomolare e PFA appena preparati ai campioni per altri 15 minuti di agitazione a temperatura ambiente.
Quindi, centrifugare le cellule, versare il surnatante e seguire due lavaggi in 500 microlitri di BSA allo 0,1% e acqua deionizzata filtrata. Analizzare i campioni aggiungendo microsfere di normalizzazione nei pozzetti delle piastre dei campioni, pipettando le cellule in questi pozzetti e quindi eseguendo la citometria di massa entro 24 ore. Dopo la normalizzazione dell'intensità del segnale, le perle di calibrazione possono essere rimosse dai dati mediante il gating sulla popolazione negativa delle microsfere positive all'iridio 191.
Gli eventi di singole cellule possono quindi essere controllati per rimuovere i detriti e i multipletti cellulari utilizzando un grafico biassiale dell'espressione negativa dell'iridio 193 rispetto alla lunghezza dell'evento. La marcatura del cisplatino può essere utilizzata per misurare la quantità di profondità cellulare. Ad esempio, qui vengono mostrati campioni con quantità basse e maggiori di cellule morte.
Le cellule morte possono essere rimosse eliminando la popolazione positiva al platino 198, il codice a barre si traduce in una netta separazione dei campioni all'interno dei parametri di codifica a barre, consentendo alle cellule di essere assegnate alle loro identità di campione originali. L'etichettatura IDU può essere utilizzata per rilevare le cellule facciali statunitensi osservate qui. Dopo la normalizzazione iniziale, il de-barcoding e il gating, i dati ad alta dimensionalità possono essere analizzati utilizzando l'algoritmo SPADE per generare una rappresentazione dimensionale inferiore dei dati che è più suscettibile di interpretazione visiva.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro quattro-sei ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo la perdita di campione durante la fase di lavaggio. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni per l'analisi della citometria di massa.
Non dimenticare che lavorare con l'azide di sodio può essere pericoloso, quindi dovresti usare precauzioni come indossare DPI adeguati quando esegui questa procedura.
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Panoramica
Questo articolo descrive la raccolta e l'elaborazione di campioni per l'analisi di citometria di massa. Il metodo mira a produrre una colorazione coerente degli anticorpi per interrogare popolazioni cellulari eterogenee.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Citometria di massa
Sfondo
- La citometria di massa permette la misurazione di alti livelli di proteine a livello di singola cellula.
- È utile per comprendere l'identità e la segnalazione cellulare.
- La tecnica è applicabile a complesse popolazioni cellulari eterogenee.
- La preparazione del campione è cruciale per risultati robusti.
Obiettivo dello studio
- Dimostra un processo di preparazione del campione per la citometria di massa.
- Permette l'interrogazione di diverse popolazioni cellulari.
- Fornisce approfondimenti sulle risposte e le interazioni cellulari.
Metodi utilizzati
- Risospensione di campioni di sospensione di singole cellule in mezzo privo di siero.
- Utilizzo di Cisplatino fresco preparato per il trattamento cellulare.
- Incubazione su un shaker orbitale per un miscelamento coerente.
- Centrifugazione e lavaggio delle cellule dopo il trattamento.
Principali risultati
- Dimostrazione di una tecnica efficace di preparazione del campione.
- Colorazione coerente degli anticorpi ottenuta tra i campioni.
- Analisi ad alto parametro facilitata a livello di singola cellula.
- Approfondimenti su popolazioni cellulari eterogenee ottenuti.
Conclusioni
- Il metodo migliora la capacità di analizzare popolazioni cellulari complesse.
- Una preparazione robusta del campione è critica per risultati accurati nella citometria di massa.
- Questa tecnica può far progredire la ricerca in biologia cellulare e neuroscienze.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Mass cytometry enables high-parameter single-cell protein analysis, supporting deep interrogation of heterogeneous cell populations in drug discovery. Reliable sample preparation is essential for generating consistent, reproducible data that informs target validation and mechanistic de-risking. This protocol helps biopharma R&D teams reduce variability and improve predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables multiplexed protein profiling to clarify cellular identity and signaling states in complex tissues.
- Operational Value: Supports hypothesis-driven interrogation of drug target engagement and pathway modulation at single-cell resolution.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-dimensional readouts for assessing compound effects across diverse cell types.
- Operational Value: Establishes reproducible staining and fixation procedures critical for assay scalability and cross-experiment comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery and phenotypic characterization in disease-relevant models.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of cellular responses to support go/no-go decisions in preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing quantitative, single-cell resolution data that complements bulk assays and functional screens.
- Discovery Biology: Enables detailed mapping of cellular heterogeneity and dynamic protein expression changes in response to perturbations.
- Screening: Delivers multiplexed, quantitative outputs suitable for hit validation and mechanism-of-action deconvolution.
- Analytics: Produces high-dimensional data requiring computational gating and normalization for accurate interpretation.
- Translational Research: Supports alignment with preclinical models by enabling consistent immunophenotyping across sample sets.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized sample preparation foundation for reusable mass cytometry platforms across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence through comprehensive, single-cell resolution protein profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and minimizes technical variability via standardized washing, fixation, and permeabilization steps.
- Strategic Value: Improves target selection and lead optimization by reducing biological ambiguity in complex samples.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization by revealing off-target effects and cell-state-specific responses early in discovery.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry principles, antibody panel design, and metal-conjugated reagent handling.
- Depends on access to a mass cytometer, centrifugation equipment, and orbital shakers for consistent sample processing.
- Necessitates standardized operating procedures for reagent preparation, particularly Cisplatin and methanol-based permeabilization, to ensure batch-to-batch consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to diverse sample types such as primary tissues, blood, or cultured cells.
- Includes practical limitations related to sample loss during multiple wash steps and the need for careful titration of antibody cocktails to minimize background signal.
