Anionico polimerizzazione di un copolimero Amphiphilic per la preparazione di copolimero a blocchi micelle stabilizzata da π-¸ Interazioni Stacking

L'obiettivo generale di questo lavoro è quello di dimostrare i passaggi critici necessari per la sintesi di materiali copolimerici a blocchi mediante polimerizzazione anionica ad apertura di anello e di mostrare il flusso necessario di studi per la formulazione di micelle di copolimeri a blocchi di un farmaco idrofobo. Questo protocollo dimostra la corretta esecuzione dei passaggi e delle procedure necessarie per la sintesi del copolimero a blocchi mediante polimerizzazione anionica. Il grande vantaggio dell'apertura dell'anello in una polimerizzazione anionica è la sintesi di materiali in buona resa e bassa dispersione inquinante.

Così come la scalabilità del processo. Questo è un momento entusiasmante per la somministrazione di farmaci polimerici. Con una serie di farmaci che si basano su micelle di formulazione e copolimero a blocchi, ora in fase avanzata di sviluppo preclinico o clinico.

Preparare i reagenti e i materiali per il trasferimento come descritto nel protocollo di testo. Pesare il metossipolietilenglicole con un peso molecolare di 5.000. Aggiungere l'mPEG in un pallone asciutto contenente una barra di agitazione e sigillare l'adattatore di lavaggio con un setto nella parte superiore.

Collegare il pallone al collettore e appollaiarlo per due o tre minuti con Argon. Ruotare la valvola in posizione di vuoto per appollaiare il pallone. Ruotare manualmente il pallone e asciugare il recipiente di reazione in modo omogeneo, con un asciugacapelli o una pistola termica, fino a quando l'mPEG non si scioglie.

Dopo un minuto, rompere il vuoto ruotando la valvola sul collettore verso la posizione Argon con diversi scatti rapidi per raffreddare il pallone. Tenere il macroiniziatore polimerico sotto vuoto per circa due ore, e poi sotto Argon prima che inizi la reazione. Successivamente, montare sotto la cappa due apparecchi di distillazione ad alto vuoto precedentemente essiccati in un forno.

Un apparecchio è per la distillazione del DMSO e un apparecchio è per la distillazione del monomero, l'etere fenilglicerolo. Collegare i palloni separati ai due apparecchi e installarli su una mensola riscaldante emisferica o in un bagno d'olio. Collegare l'acqua fredda alla parte superiore di ciascun apparecchio e al collettore.

Assicurarsi che ogni apparecchio sia sicuro e ben sigillato. Innestare il vuoto tramite la valvola. Imposta il riscaldamento tramite un regolatore di temperatura e inizia a mescolare le soluzioni.

Dopo due ore di distillazione in circolazione di DMSO, chiudere la valvola ad alto vuoto per raccogliere circa 20 millilitri di soluzione. Quindi, rilasciare la frazione nel pallone e ripetere l'operazione ancora una volta, per garantire la purezza della frazione desiderata che viene raccolta successivamente. Riscaldare il pallone contenente l'mPEG sotto vuoto con la pistola termica fino a quando il polimero non si scioglie, quindi appollaiarsi nuovamente con Argon.

Dopo due ore, chiudere la valvola per alto vuoto e raccogliere il volume di solvente. Interrompere il riscaldamento e rompere il vuoto dal collettore. Rilasciare l'argon nella camera, come descritto in precedenza.

Sotto una pressione positiva di Argon, collegare un lato della cannula ad un cilindro graduato, o direttamente al pallone contenente il mPEG, anch'esso sotto Argon, e immergere accuratamente l'altra estremità nella frazione appena distillata. Collegare un gorgogliatore aggiuntivo al pallone, chiudere il flusso di argon e utilizzare solo la pressione dell'argon dall'apparecchio di distillazione. Per evitare incidenti causati dalla pressione dell'Argon, aprire il rubinetto di arresto in vetro per uno o due secondi e richiuderlo per continuare il flusso di DMSO fino al completamento del trasferimento completo.

Quindi, sotto Argon, collegare un lato della cannula dal cilindro graduato essiccato, sigillato da un setto, a una soluzione madre di naftalene potassio 0,3 molari. Quindi, aggiungere un gorgogliatore extra al cilindro graduato, chiudere il flusso di Argon al cilindro e, sotto pressione positiva di Argon, trasferire cinque millilitri di naftalene di potassio molare 0,3 molare tramite canulazione dalla soluzione madre al cilindro graduato. Inserire un altro ago dal collettore nel cilindro e rimuovere il gorgogliatore in eccesso.

Rimuovere con cautela la cannula collegata alla soluzione madre, inserirla rapidamente nel pallone di reazione e collegare un gorgogliatore aggiuntivo. Successivamente, come descritto in precedenza, aggiungere la base goccia a goccia fino a quando la soluzione non diventa scura. Dopo la lenta scomparsa del colore, aggiungere un'altra porzione fino a quando il colore scuro non riappare e ripetere fino al trasferimento completo.

Come descritto in precedenza, trasferire il volume desiderato di monomero alla reazione per raggiungere un grado di polimerizzazione dell'etere di polifenolo glicole di circa 18-20 unità. Lasciare la reazione per 48 ore a 80 gradi Celsius, in atmosfera di Argon con agitazione costante, per garantire la completa polimerizzazione. Estinguere la reazione con l'aggiunta di gocce di un normale acido cloridrico e metanolo, come osservato da una scomparsa di colore.

Estrarre il naftalene dalla soluzione di DMSO con esano. Rimuovere circa 70 millilitri di DMSO mediante distillazione sotto vuoto. Raffreddare la soluzione di impasto e aggiungere 15 millilitri di THF.

Rimuovere il sale dalla soluzione di impasto liquido mediante centrifugazione a 5.000 volte g per dieci minuti. Trasferire il surnatante e aggiungere una goccia alla volta a 500 millilitri di etere etilico freddo. Raccogliere il precipitato mediante filtrazione o centrifugazione.

Dopo aver ripetuto due volte la precipitazione, asciugare il precipitato a temperatura ambiente sotto la cappa, durante la notte, e poi sotto vuoto a 30 gradi Celsius per 24-48 ore, per una resa dell'85%Il copolimero è ora pronto per la caratterizzazione, come descritto nel protocollo di testo. Sciogliere 12 milligrammi di doxorubicina in un millilitro di acetonitrile. Aggiungere 10 microlitri di trietilammina e lasciare mescolare la soluzione al buio per due ore.

Sciogliere 45 milligrammi di copolimero in un millilitro di THF e mescolare per lo stesso periodo di tempo. Aggiungere la soluzione di copolimero alla soluzione di doxorubicina e sciacquare il copolimero residuo contenente fiala con un volume extra di THF. Quindi, aggiungere la miscela di copolimero-farmaco goccia a goccia fino a una fiala da 20 millilitri contenente 15 millilitri di soluzione fisiologica allo 0,9% mescolando.

Trasferire la soluzione in una sacca per dialisi e dializzare con 500 millilitri di soluzione fisiologica allo 0,9%. Trasferire il dialisato in una provetta da 15 millilitri e centrifugare a 5.000 volte g, per 15 minuti. Quindi, trasferire il surnatante in un sistema di ultrafiltrazione che contiene una membrana di dialisi.

Inserire l'adattatore per mescolare nel sistema di ultrafiltrazione, chiudere il coperchio e aprire a un flusso di azoto. Concentrare la soluzione di micelle di copolimero a blocchi a un volume di quattro millilitri e aggiungere sei millilitri di soluzione salina fresca. Quindi, concentrare nuovamente la soluzione di micelle di copolimero a blocchi a 4 millilitri, sciacquare la camera con 0,5 millilitri di soluzione fisiologica e aggiungerla alla soluzione.

Conservare la soluzione risultante in fiale marroni a temperatura ambiente al buio, prima di un ulteriore utilizzo. La polimerizzazione anionica con apertura dell'anello dell'etere fenilglicerico sul macroiniziatore mPEG è stata utilizzata per preparare il copolimero diblocco anfifilico mediante la protonazione profonda del gruppo ossidrilico di mPEG. Utilizzo del naftalene di potassio come anione radicale, seguito dalla polimerizzazione del monomero etere fenilglicerolo.

La caratterizzazione del copolimero a blocchi mediante cromatografia a permeazione di gel e l'analisi della spettroscopia NMR protonica hanno confermato una stretta distribuzione del peso molecolare con un grado di polimerizzazione dell'etere di fenil glicerolo di 15 unità. In acquis media, i copolimeri a blocchi anfifilici si assemblano per formare micelle che consistono in un nucleo idrofobico circondato da un guscio idrofilo. La microscopia elettronica a trasmissione ha confermato una morfologia sferica e la diffusione dinamica della luce ha indicato un diametro idrodinamico di 25 nanometri.

La doxorubicina è stata incapsulata con successo nelle micelle del copolimero a blocchi. Rispetto al farmaco protonato libero in soluzione, l'autoestinzione della doxorubicina, osservata mediante spettroscopia di fluorescenza, ha confermato l'incorporazione del farmaco nelle micelle polimeriche, con una capacità di carico del farmaco fino al 14%Il profilo di rilascio della doxorubicina, dalle micelle del copolimero a blocchi, ha indicato una buona stabilità per questa formulazione a pH neutro. E rilascio prolungato del farmaco nell'arco di quattro giorni in condizioni fisiologicamente rilevanti.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può aiutare i tirocinanti nelle scienze farmaceutiche a preparare i copolimeri diblocco di sintesi per l'applicazione nella somministrazione di farmaci. Questa procedura qui descritta può essere applicata per la sintesi di un'ampia gamma di copolimeri con PEG come iniziatore. Qui l'accento è stato posto sull'assicurare buone pratiche di laboratorio, che forniscano condizioni anidre e si traducano in materiali di alta qualità.

Dopo aver visto questo video, dovrei avere una buona comprensione di come lavorare in condizioni anidre e dovrei essere in grado di applicare questi passaggi per la sintesi di poliestere PEG o materiali in poliestere PEG. Nel perseguire una qualsiasi delle ricerche descritte, è essenziale ricordare che si sta lavorando in condizioni controllate, con solventi organici potenzialmente pericolosi e altri agenti. Inoltre, tutti i farmaci sono tossici e devono essere maneggiati con le precauzioni necessarie.

Ad esempio, indossare guanti, camice da laboratorio, scarpe chiuse e indossare una maschera quando si desidera pesare i farmaci.