Gestire le celle di Auditory HEI-OC1

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di descrivere le procedure di base per lavorare con le cellule HEI-OC1, che possono essere utilizzate per studiare gli effetti dei farmaci farmacologici sulle cellule uditive e aiutare nella caratterizzazione funzionale della proteina motoria prestina. Le cellule HEI-OC1 sono utilizzate da molti ricercatori in tutto il mondo in diversi esperimenti con obiettivi diversi e utilizzando tecniche diverse. Si spera che le procedure qui descritte forniscano una base comune per rendere comparabili questi studi.

Naturalmente, queste procedure sperimentali possono essere ulteriormente migliorate. Ma le differenze con quelle qui descritte potrebbero essere fondamentali per capire e spiegare risultati possibilmente contraddittori. In questa dimostrazione descriveremo come lavorare con le cellule HEI-OC1 a partire da un'aliquota congelata fino ad avere campioni pronti per eseguire diversi studi con tecniche ampiamente disponibili.

Per iniziare questa procedura, rimuovere una fiala di cellule HEI-OC1 crioconservate dall'azoto liquido e metterla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Immergere solo la metà inferiore del flaconcino e lasciarlo scongelare fino a quando non rimane solo una piccola quantità di ghiaccio nel flaconcino. In una cappetta di sicurezza biologica, pulire l'esterno della fiala con alcol al 70%.

Quindi, pipettare le cellule dalla fiala e somministrare l'intero volume goccia a goccia, lentamente, in una provetta conica da 15 millilitri contenente 10 millilitri di terreno di crescita preriscaldato come il DMEM integrato con il 10% di FBS. Quindi, rimuovere il DMSO centrifugando la provetta per cinque minuti. Dopo cinque minuti, scartare il surnatante e risospendere le cellule in nove millilitri di terreno di crescita fresco.

Disaggregare i grumi o i fogli di cellule flussando e rifluendo le cellule sospese tra la pipetta e il terreno tre o quattro volte con la punta della pipetta che tocca il fondo della provetta. Quindi, posizionare il volume totale delle cellule sospese nel terreno di crescita in una piastra di coltura cellulare in plastica non trattata di 100 millimetri di diametro. Incubare le cellule a 33 gradi Celsius con il 10% di CO2.

In questo passaggio, rimuovere il vecchio terreno e lavare le cellule con due millilitri di PBS. Quindi, coprire il monostrato cellulare con lo 0,25% di tripsina. Esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito quando il 40% di esse è stato staccato.

Se necessario, scuotere delicatamente la piastra di coltura per rilasciare le cellule attaccate rimanenti Risospendere le cellule e rimuovere la tripsina centrifugando la provetta per cinque minuti. Successivamente, scartare il surnatante e risospendere le cellule in nove millilitri di terreno di crescita fresco. Quindi, disaggregare i grumi o i fogli di cellule flussando e rifluendo le cellule sospese tra la pipetta e il terreno, tre o quattro volte con la punta della pipetta che tocca il fondo del tubo.

Procedere a seminare le cellule in piastre di coltura cellulare di 100 millimetri di diametro. Incubarli a 33 gradi Celsius con il 10% di CO2 e dividerli tante volte quanto necessario per gli esperimenti pianificati o per generare un nuovo stock. Per la differenziazione, incubare le cellule HEI-OC1 alle condizioni permissive fino a raggiungere circa l'80% di confluenza.

Quindi, incubare le cellule a 39 gradi Celsius con il 5% di CO2 per due o tre settimane e cambiare il terreno a giorni alterni per rimuovere le cellule morte. Iniziare questa procedura contando le cellule utilizzando un contatore automatico di cellule o un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare al valore richiesto. Quindi, semina le cellule in una piastra a fondo piatto trasparente da 96 pozzetti, una piastra a 96 pozzetti con pareti bianche o una piastra a sei pozzetti.

Se richiesto dal particolare test, incubare le cellule durante la notte per l'adesione al substrato prima di trattarle con i farmaci di interesse. Quindi, misurare l'esito del trattamento mediante citometria a flusso o un'altra tecnica adeguata. Per raccogliere le cellule, lavarle due volte con 10 millilitri di PBS senza calcio e magnesio.

Aggiungere due millilitri della soluzione di distacco senza enzimi e incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2. Utilizzare un microscopio invertito per controllare il distacco delle cellule. Se necessario, spostare delicatamente la piastra di coltura cellulare per staccare altre cellule e fare attenzione a non scuoterla.

Successivamente, aggiungere 10 millilitri di DMEM più il 10% di FBS e pipettare le cellule su e giù, delicatamente, cinque volte. Dopodiché, guarda le cellule al microscopio. Se più dell'80% delle cellule è già separato, non è necessario un ulteriore pipettaggio.

Se le cellule sono ancora in cluster, continuare a pipettare delicatamente fino a quando più dell'80% delle cellule non sono più in cluster. Un controllo ottico delle celle dovrebbe mostrare molte singole celle rotonde con bordi lisci della membrana. Successivamente, procedere con le misure di patch-clamp e NLC, come descritto nel protocollo di testo.

cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non permissive hanno mostrato una diminuzione altamente significativa della vitalità cellulare e un aumento altrettanto significativo della morte cellulare rispetto alle colture cellulari in condizioni permissive. Poiché gli effetti dei farmaci su cellule già morenti o con una ridotta vitalità potrebbero essere diversi dagli effetti dello stesso farmaco su cellule sane, dovrebbero essere dedicati sforzi considerevoli per discriminare gli effetti dei farmaci dagli effetti delle condizioni di coltura in qualsiasi studio di citotossicità eseguito su cellule NP-HEI-OC1. Pertanto, si consiglia di utilizzare cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni permissive per esperimenti che non richiedono specificamente cellule differenziate.

Le immagini confocali mostrate qui confermano l'espressione della proteina motoria uditiva prestin in cellule HEI-OC1 coltivate a 33 gradi Celsius e 39 gradi Celsius. Si noti che la prestina immunolocalizza principalmente nel citoplasma delle cellule HEI-OC1 che crescono in condizioni permissive, ed è più concentrata sulla membrana plasmatica nelle cellule più differenziate. Gli studi di citometria a flusso hanno mostrato un chiaro aumento dell'espressione di prestin in entrambe le condizioni, suggerendo che la traslocazione era accompagnata dalla sintesi di più molecole di prestina.

D'altra parte, gli studi elettrofisiologici hanno mostrato una robusta NLC nelle cellule HEI-OC1 che crescono a 33 gradi Celsius, con un valore di picco che diminuisce e una tensione alla capacità di picco che si sposta verso valori più depolarizzati man mano che le celle vengono spostate in condizioni non permissive per una e due settimane. Curiosamente, questi risultati suggeriscono che la funzione motoria potrebbe essere compromessa se la densità delle molecole di prestina nella membrana plasmatica è troppo alta. È importante ricordare che i protocolli qui descritti richiedono l'uso corretto di tecniche di coltura cellulare ben consolidate.

Inoltre, ricorda di evitare l'uso di antibiotici. Inoltre, ricorda che il fenotipo e la risposta delle cellule HEI-OC1 dipenderanno fortemente dai parametri di coltura.