Name: Gestire le celle di Auditory HEI-OC1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Impara a gestire le cellule HEI-OC1 per studiare gli effetti di farmaci sull'udito e caratterizzare la proteina motrice prestin. Questo protocollo standardizzato facilita la ricerca riproducibile in neuroscienza.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01-DC010146 e R01-DC010397. Il suo contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

<ol><li>Jat, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+derivation+of+conditionally+immortall+cell+lines+from+an+H-2Kb-tsA58+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).</li>
<li>Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cochlear+cell+line+as+an+in+vitro+system+for+drug+ototoxicity+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Audiol.+Neurootol%22%5BJournal%5D)">A cochlear cell line as an in vitro system for drug ototoxicity screening.</a> Audiol. Neurootol. 8, 177-189 (2003).</li>
<li>Devarajan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cisplatin-induced+apoptosis+in+auditory+cells%3A+role+of+death+receptor+and+mitochondrial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Cisplatin-induced apoptosis in auditory cells: role of death receptor and mitochondrial pathways.</a> Hear Res. 174, 45-54 (2002).</li>
<li>Chen, F. Q., Hill, K., Guan, Y. J., Schacht, J., Sha, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+apoptotic+pathways+in+the+absence+of+cell+death+in+an+inner-ear+immortomouse+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of apoptotic pathways in the absence of cell death in an inner-ear immortomouse cell line.</a> Hear Res. 284, 33-41 (2012).</li>
<li>Hayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+pathway+maintained+signaling+crosstalk+with+the+Keap1-Nrf2+system+through+p62+in+auditory+cells+under+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">The autophagy pathway maintained signaling crosstalk with the Keap1-Nrf2 system through p62 in auditory cells under oxidative stress.</a> Cell Signal. 27, 382-393 (2015).</li>
<li>Tsuchihashi, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+through+4EBP1+and+AMPK+regulates+oxidative+stress-induced+premature+senescence+in+auditory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Autophagy through 4EBP1 and AMPK regulates oxidative stress-induced premature senescence in auditory cells.</a> Oncotarget. 6, 3644-3655 (2015).</li>
<li>Youn, C. K., Kim, J., Park, J. H., Do, N. Y., Cho, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cisplatin-induced+ototoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pediatr+Otorhinolaryngol%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cisplatin-induced ototoxicity.</a> Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 79, 1814-1819 (2015).</li>
<li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li>
<li>Park, C., Thein, P., Kalinec, G., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+prestin+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">HEI-OC1 cells as a model for investigating prestin function.</a> Hear Res. 335, 9-17 (2016).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCelis%2C+JE+%22Cell+Biology%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Cell Biology: A Laboratory Handbook</a>. 1, 3rd, Elsevier Academic Press. (2006).</li>
<li>Bertolaso, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+OC-k3+immortalized+cell+line+treated+with+different+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Audiology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the OC-k3 immortalized cell line treated with different agents.</a> Audiology. 40, 327-335 (2001).</li>
<li>Kalinec, F., Kalinec, G., Boukhvalova, M., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+conditionally+immortalized+organ+of+corti+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of conditionally immortalized organ of corti cell lines.</a> Cell Biol Int. 23, 175-184 (1999).</li>
<li>Belyantseva, I., Kalinec, G. M., Kalinec, F., Kachar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+two+immortalized+cell+lines+derived+from+the+stria+vascularis+of+a+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%2221st+Midwinter+Meeting+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of two immortalized cell lines derived from the stria vascularis of a transgenic mouse.</a> 21st Midwinter Meeting Association for Research in Otolaryngology. 620a, (1998).</li>
<li>Gratton, M. A., Meehan, D. T., Smyth, B. J., Cosgrove, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strial+marginal+cells+play+a+role+in+basement+membrane+homeostasis%3A+in+vitro+and+in+vivo+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Strial marginal cells play a role in basement membrane homeostasis: in vitro and in vivo evidence.</a> Hear Res. 163, 27-36 (2002).</li>
<li>Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+detect+senescence-associated+beta-galactosidase+%28SA-betagal%29+activity%2C+a+biomarker+of+senescent+cells+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).</li>
<li>Santos-Sacchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+inhibition+of+voltage-dependent+outer+hair+cell+motility+and+capacitance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Reversible inhibition of voltage-dependent outer hair cell motility and capacitance.</a> J. Neurosci. 11, 3096-3110 (1991).</li>
<li>Fink, S. L., Cookson, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+pyroptosis%2C+and+necrosis%3A+mechanistic+description+of+dead+and+dying+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, pyroptosis, and necrosis: mechanistic description of dead and dying eukaryotic cells.</a> Infect Immun. 73, 1907-1916 (2005).</li>
<li>Majno, G., Joris, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%2C+oncosis%2C+and+necrosis.+An+overview+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death.</a> Am J Pathol. 146, 3-15 (1995).</li>
<li>Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+necrosis%3A+the+expanding+network+of+non-apoptotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 135-147 (2014).</li>
<li>Sun, L., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+kind+of+cell+suicide%3A+mechanisms+and+functions+of+programmed+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A new kind of cell suicide: mechanisms and functions of programmed necrosis.</a> Trends Biochem Sci. 39, 587-593 (2014).</li>
<li>Chan, F. K., Luz, N. F., Moriwaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+necrosis+in+the+cross+talk+of+cell+death+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Programmed necrosis in the cross talk of cell death and inflammation.</a> Annu Rev Immunol. 33, 79-106 (2015).</li>
<li>Vercammen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+signaling+of+the+Fas+receptor%3A+initiation+of+both+apoptotic+and+necrotic+cell+death+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dual signaling of the Fas receptor: initiation of both apoptotic and necrotic cell death pathways.</a> J Exp Med. 188, 919-930 (1998).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annu Rev Physiol. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Bian, S., Koo, B. W., Kelleher, S., Santos-Sacchi, J., Navaratnam, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+expressing+Tet-inducible+cell+line+recapitulates+in+situ+developmental+changes+in+prestin%27s+Boltzmann+characteristics+and+reveals+early+maturational+events%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A highly expressing Tet-inducible cell line recapitulates in situ developmental changes in prestin's Boltzmann characteristics and reveals early maturational events.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 299, C828-C835 (2010).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+outer+hair+cell+motor+prestin+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the outer hair cell motor prestin in the mouse.</a> J Membr Biol. 215, 49-56 (2007).</li>
<li>Oliver, D., Fakler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+density+and+functional+characteristics+of+the+outer+hair+cell+motor+protein+are+regulated+during+postnatal+development+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression density and functional characteristics of the outer hair cell motor protein are regulated during postnatal development in rat.</a> J Physiol. 519 Pt 3, 791-800 (1999).</li>
<li>Tsunoo, M., Perlman, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+Oxygen+Tension%3A+Relation+to+Blood+Flow+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Cochlear Oxygen Tension: Relation to Blood Flow and Function.</a> Acta Otolaryngol. 59, 437-450 (1965).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse esistenti o potenziali.

In questo rapporto viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1 e li usiamo per valutare i meccanismi di citotossicità indotta da farmaci e di indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del cocleare OHC. Le modalità tecniche, tuttavia, sono abbastanza generali da essere facilmente adattato ai diversi studi. Tutti i protocolli descritti richiedono il corretto uso di tecniche di coltura cellulare consolidate 10. Come con qualsiasi altra linea cellula...

Casa Ear Institute-organo del Corti 1 (HEI-OC1), le cellule sono derivati ​​dal organo uditivo di un 1,2 topo transgenico. L&#39;incubazione di una cella da questo topo transgenico a 33 ° C / 10% di CO 2 (condizioni permissive) induce l&#39;espressione di un gene che innesca immortalare de-differenziazione e proliferazione accelerata; spostando le cellule a 39 ° C / 5% di CO 2 (condizioni non permissive) determina una diminuzione della proliferazione, differenziazione e, almeno nel caso di HEI-OC1, morte cellulare 2,3. cellule HEI-OC1 sono stati clonati e caratterizzati nel nostro laboratorio oltre un decennio fa, e studi iniziali hanno indicato che essi esprimono specifici marcatori di cellule ciliate cocleari, come prestin, miosina 7a, Atoh1, BDNF, calbindina e calmodulina, ma anche i marcatori di supporto cellule come connessina 26 e recettore del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF-R) 2. Pertanto, è stato suggerito che HEI-OC1 potrebbe rappresentare un common progenitore per le cellule sensoriali e di sostegno dell&#39;organo del Corti 2. Studi paralleli fornito una forte evidenza che archetipo farmaci ototossici come cisplatino, gentamicina e streptomicina indotto caspasi-3 attivazione in queste cellule, mentre i farmaci considerati non ototossici, come la penicillina, non 2,3. Pertanto, questa linea cellulare è stata proposta come un sistema in vitro per studiare i meccanismi cellulari e molecolari coinvolti nella ototossicità e per lo screening del potenziale ototossicità o otoprotective di nuovi farmaci farmacologici. Si stima che le cellule HEI-OC1 sono stati utilizzati in più di centocinquanta studi pubblicati negli ultimi dieci anni. Mentre guardando il potenziale effetto pro-apoptotico di diversi farmaci è stato l&#39;obiettivo principale della maggior parte degli studi che coinvolgono questa linea cellulare, altri importanti processi cellulari come autofagia e senescenza hanno appena cominciato ad essere studiato in cellule HEI-OC1 4-7. iona recente studio condotto dal nostro laboratorio 8, abbiamo usato cellule HEI-OC1 per raccogliere un insieme completo di dati relativi a morte cellulare, la sopravvivenza, la proliferazione, senescenza e autofagia indotta da farmaci diversi farmacologici frequentemente utilizzate per la clinica. Abbiamo anche confrontato alcune delle risposte delle cellule HEI-OC1 con quelli da HEK-293 (cellule renali di embrioni umani) e HeLa (cellule epiteliali umane) che ricevono un trattamento identico. I nostri risultati indicano che le cellule HEI-OC1 rispondono alla ciascun farmaco in modo caratteristico, con una dose distintivo e sensibilità dipendente dal tempo per almeno uno dei meccanismi in esame. Abbiamo anche sottolineato che in studio che una corretta interpretazione dei risultati sperimentali richiederà l&#39;esecuzione di studi paralleli con più di una tecnica 8. In un altro studio abbiamo valutato l&#39;uso di cellule HEI-OC1 per valutare la risposta funzionale di prestin, la proteina del motore delle cellule ciliate esterne cocleari (OHC) 9 </sup&gt;. Abbiamo riportato citometria a flusso e studi di microscopia confocale a scansione laser sul modello di espressione prestin, così come non lineare capacità (NLC) e gli studi di bloccaggio delle cellule-patch di intere cellule HEI-OC1 coltivate a permissiva (P-HEI-OC1) e non permissive (NP-HEI-OC1) condizioni. I nostri risultati indicano che sia espressione prestin e la membrana plasmatica aumento complessivo di localizzazione in un modo dipendente dal tempo in cellule NP-HEI-OC1. È interessante notare, abbiamo anche scoperto che l&#39;aumento di localizzazione prestin a livello della membrana plasmatica delle cellule NP-HEI-OC1 correlata con una diminuzione di Na + K + ATPasi, che translocated dalla membrana plasmatica al citoplasma, senza cambiamenti significativi nell&#39;espressione cellulare totale. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule P-HEI-OC1 hanno un NLC robusta associata Prestin funzione motoria, che è diminuito quando la densità delle molecole Prestin presenti a livello della membrana plasmatica è aumentata. Complessivamente, questi risultati sostengono fortemente l&#39;utilità della HEI-OC1 le cellule per indagare le proteine ​​uditive. In questo articolo il video viene descritto come la cultura delle cellule HEI-OC1, perché è comodo da usare cellule in crescita in condizioni permissive (P-HEI-OC1) per gli studi di citotossicità, come valutare il meccanismo / s della citotossicità indotta da farmaci e come per eseguire studi elettrofisiologici (ad esempio, patch-clamp, capacità non lineare (NLC)) per indagare le proprietà funzionali del prestin, il motore molecolare del OHC cocleari.

<table><tbody><tr>Cellule <td></td><td></td><td>HEI-OC1</td><td>TUTTI I KIT DI ANALISI, LE ATTREZZATURE&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe II</td><td>L'azienda Baker</td><td>Sterilgard III</td><td>E LE AZIENDE INDICATE NELLA</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>PRECEDENTI 2 COLONNE SONO SOLO</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td>ESEMPI, E QUALSIASI ALTRO PRODOTTO SIMILE</td></tr><tr>A<td>BAGNOMARIA</td><td>Stovall</td><td>HWB115</td><td>POTREBBE ESSERE UTILIZZATO.</td></tr><tr><td>Contatore di cellule</td><td>Nexcelom</td><td>Cellometro Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Due (2) incubatori di cellule, uno a 33 gradi; C/10% CO2 e altro a 39 gradi C/5% CO2</td><td>Forma Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, PS, 100 mm x 20 mm con prese d'aria</td><td>Greinier Bio-One</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari, PS,&nbsp; 60 mm x 15 mm con prese d'aria&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar fiasche per colture tissutali 250 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658-175</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar fiasche per colture tissutali 550 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>660-175</td><td></td></tr><tr><td> Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti, con coperchio-Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657-160</td><td></td></tr><tr><td>Microtest Piastra per colture tissutali, 96 pozzetti, fondo piatto con coperchio</td><td>Becton Dickinson</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 pozzetti, bianco, fondo trasparente</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655098</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tubo conico in polipropilene con tappo Cellstars</td><td>Becton Dickinson&nbsp;</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche in polipropilene da 15 ml con tappo-Cellstars</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188-271</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7,4 (1x)&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH10073.1</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium di Leibovitz, senza rosso fenolo</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,25%&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test di proliferazione cellulare TACS MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-25-K</td><td></td></tr><tr><td>Kit di test Caspasi-Glo 3/7</td><td>Promega</td><td> G8091&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il test di proliferazione cellulare BrdU&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>6813</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5789</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il test di citotossicità verde Cell-Tox</td><td>Promega</td><td>&nbsp; G8741&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Strumento FACSAriaIII&nbsp;</td><td>BD Bioscienze</td><td>&nbsp; FACSAriaIII</td><td>Con eccitazione a 488 nm (laser blu)</td></tr><tr><td>Scanner digitale per blot</td><td>LI-COR</td><td>C-DiGit</td><td></td></tr><tr><td>Unità di elettroforesi e blotting</td><td>Hoefer</td><td>SE300 miniVE</td><td></td></tr><tr><td>Spectra Max 5 Lettore di piastre con software Soft Max Pro 5.2</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 5</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore patch-clamp</td><td>HEKA</td><td>EPC-10</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per la preparazione elettrodi patch</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr></tbody></table>

gestire le celle di auditory hei-oc1

Working with Auditory HEI-OC1 Cells

HEI-OC1 è una delle poche linee cellulari uditive di topo disponibili per scopi di ricerca. Originariamente proposte come sistema in vitro per lo screening di farmaci ototossici, queste cellule sono state utilizzate per studiare le vie apoptotiche attivate da farmaci, l'autofagia, la senescenza, il meccanismo di protezione cellulare, le risposte infiammatorie, la differenziazione cellulare, gli effetti genetici ed epigenetici dei farmaci farmacologici, gli effetti dell'ipossia, lo stress ossidativo ed endoplasmatico del reticolo e l'espressione di canali e recettori molecolari. Tra gli altri importanti marcatori delle cellule ciliate cocleari, le cellule HEI-OC1 esprimono endogenamente la prestina, la proteina motore paradigmatica delle cellule ciliate esterne. Pertanto, possono essere molto utili per chiarire nuovi aspetti funzionali di questa importante proteina uditiva. Le cellule HEI-OC1 sono molto robuste e la loro coltura di solito non presenta grandi complicazioni. Tuttavia, richiedono alcune condizioni speciali come evitare l'uso di comuni cocktail antibatterici contenenti streptomicina o altri antibiotici, nonché l'incubazione a 33 °C per stimolare la proliferazione cellulare e l'incubazione a 39 °C per innescare la differenziazione cellulare. In questo articolo, descriviamo come coltivare le cellule HEI-OC1 e come utilizzarle in alcuni saggi tipici, come la proliferazione cellulare, la vitalità, la morte, l'autofagia e la senescenza, nonché come eseguire misure di patch-clamp e capacità non lineare.

In un paio di pubblicazioni recenti abbiamo riportato una serie completa di studi volti a valutare la risposta delle cellule HEI-OC1 a diversi farmaci farmacologici comunemente usati, nonché indagare la funzione prestin 8,9. In questi studi abbiamo fatto uso di tutti i protocolli descritti nelle sezioni precedenti. Uno dei risultati di questi studi precedenti era che le cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non pe...

House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) è una delle poche linee cellulari uditive di topo attualmente disponibili per scopi di ricerca. Questo protocollo descrive come lavorare con le cellule HEI-OC1 per studiare gli effetti citotossici dei farmaci farmacologici e le proprietà funzionali delle proteine dell'orecchio interno.

Gestire le celle di Auditory HEI-OC1

HEI-OC1 is one of the few mouse auditory cell lines available for research purposes. Originally proposed as an in vitro system for screening of ototoxic ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure di base per lavorare con cellule HEI-OC1, che possono essere utilizzate per studiare gli effetti di farmaci di natura farmacologica sulle cellule uditive e per contribuire alla caratterizzazione funzionale della proteina motrice prestina. Le cellule HEI-OC1 sono impiegate da numerosi ricercatori in tutto il mondo in diversi esperimenti, con obiettivi differenti e mediante l'uso di tecniche svariate. Si spera che le procedure qui descritte possano fornire una base comune al fine di rendere confrontabili questi studi.Ovviamente, queste procedure sperimentali potrebbero essere ulteriormente migliorate. Tuttavia, le differenze rispetto a quelle descritte qui potrebbero essere fondamentali per comprendere e spiegare risultati potenzialmente contraddittori. In questa dimostrazione descriveremo come lavorare con cellule HEI-OC1 a partire da un'aliquote congelata fino a ottenere campioni pronti per eseguire diversi studi mediante tecniche ampiamente disponibili.Per iniziare questa procedura, prelevare un'ampolla contenente cellule HEI-OC1 criopreservate dall'azoto liquido e immergerla in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Immergere soltanto la metà inferiore dell'ampolla e lasciar scongelare fino a quando nell'ampolla rimarrà solo una piccola quantità di ghiaccio. All'interno di una cappa a sicurezza biologica, pulire l'esterno dell'ampolla con alcol al 70%.Quindi, pipettare le cellule dalla provetta e trasferire l'intero volume, goccia a goccia e lentamente, in una provetta conica da 15 millilitri contenente 10 millilitri di mezzo di crescita preriscaldato, come DMEM integrato con FBS al 10%. Successivamente, rimuovere il DMSO centrifugando la provetta per cinque minuti. Trascorsi cinque minuti, eliminare il soprannatante e risospendere le cellule in nove millilitri di mezzo di crescita fresco.Disaggregare gli aggregati o i foglietti cellulari facendo fluire e refluire le cellule sospese tra la pipetta e il mezzo da tre a quattro volte, con la punta della pipetta a contatto con il fondo del tubo. Successivamente, trasferire il volume totale delle cellule sospese nel mezzo di crescita in una piastra di coltura cellulare in plastica non trattata di diametro 100 millimetri. Incubare le cellule a 33 gradi Celsius con 10%CO2.In questo passaggio, rimuovere il vecchio mezzo e lavare le cellule con due millilitri di PBS. Successivamente, coprire il monostrato cellulare con tripsina 0,25%. Esaminare le cellule utilizzando un microscopio invertito quando il 40% di esse si è staccato.Se necessario, agitare delicatamente la piastra di coltura per staccare le eventuali cellule ancora aderenti. Ri-sospendere le cellule ed eliminare la tripsina centrifugando il tubo per cinque minuti. Successivamente, eliminare il soprannatante e ri-sospendere le cellule in nove millilitri di mezzo di crescita fresco. Poi, disgregare gli aggregati o i foglietti cellulari aspirando e dispensando la sospensione cellulare tra la pipetta e il mezzo, da tre a quattro volte, con la punta della pipetta a contatto con il fondo del tubo.Procedere con la semina delle cellule in piatti per coltura cellulare di diametro 100 millimetri. Incubarle a 33 gradi Celsius con 10%CO2 e suddividerle tante volte quante necessarie per gli esperimenti previsti o per generare una nuova linea. Per la differenziazione, incubare le cellule HEI-OC1 in condizioni permissive fino a quando raggiungono una confluenza di circa l'80%.Quindi, incubare le cellule a 39 gradi Celsius con 5%CO2 per due o tre settimane e cambiare il mezzo ogni due giorni per rimuovere le cellule morte. Iniziare questa procedura contando le cellule utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare al valore richiesto. Successivamente, seminare le cellule in una piastra da 96 pozzetti trasparente con fondo piatto, in una piastra da 96 pozzetti con pareti bianche o in una piastra da 6 pozzetti.Se richiesto dal particolare saggio, incubare le cellule durante la notte per l'adesione al substrato prima di trattarle con i farmaci di interesse. Successivamente, misurare l'esito del trattamento mediante citometria a flusso o un'altra tecnica adeguata. Per raccogliere le cellule, lavarle due volte con 10 millilitri di PBS privo di calcio e magnesio.Aggiungere due millilitri della soluzione distaccante priva di enzimi e incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius con 5%CO2. Utilizzare un microscopio invertito per verificare il distacco delle cellule. Se necessario, muovere delicatamente la piastra di coltura cellulare per distaccare ulteriori cellule, avendo cura di non agitarla.Successivamente, aggiungere 10 millilitri di DMEM più 10% di FBS e aspirare e rilasciare le cellule su e gi&ugrave; delicatamente per cinque volte. Dopodich&eacute;, osservare le cellule al microscopio. Se pi&ugrave; dell'80% delle cellule &egrave; gi&agrave; separato, non &egrave; necessaria ulteriore pipettaggio.Se le cellule sono ancora in aggregati, continuare a pipettare delicatamente finché oltre l'80% delle cellule non si trova più in aggregati. Un controllo ottico delle cellule dovrebbe mostrare numerose cellule singole e rotonde con margini della membrana lisci. Successivamente, procedere con le misurazioni di patch-clamp e NLC, come descritto nel protocollo testuale.Le cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni non permissive hanno mostrato una diminuzione altamente significativa della vitalità cellulare e un aumento altrettanto significativo della morte cellulare rispetto alle cellule coltivate in condizioni permissive. Poiché gli effetti di un farmaco su cellule già morenti o con vitalità ridotta potrebbero differire dagli effetti dello stesso farmaco su cellule sane, dovrebbero essere dedicati notevoli sforzi per discriminare gli effetti del farmaco dagli effetti delle condizioni di coltura in qualsiasi studio di citotossicità effettuato su cellule HEI-OC1 NP. Pertanto, raccomandiamo di utilizzare cellule HEI-OC1 coltivate in condizioni permissive per esperimenti che non richiedano specificamente cellule differenziate.Le immagini confocali mostrate qui confermano l'espressione della proteina motrice uditiva prestina in cellule HEI-OC1 coltivate a 33 gradi Celsius e a 39 gradi Celsius. Si noti che la prestina si immunolocalizza principalmente nel citoplasma delle cellule HEI-OC1 in crescita nelle condizioni permissive, ed è più concentrata nella membrana plasmatica nelle cellule più differenziate. Studi di citometria a flusso hanno mostrato un chiaro aumento dell'espressione della prestina in entrambe le condizioni, suggerendo che la traslocazione fosse accompagnata dalla sintesi di ulteriori molecole di prestina.D'altra parte, gli studi elettrofisiologici hanno mostrato una marcata corrente non lineare (NLC) nelle cellule HEI-OC1 coltivate a 33 gradi Celsius, con un valore di picco che diminuiva e una tensione di picco della capacità che si spostava verso valori più depolarizzati man mano che le cellule venivano trasferite in condizioni non permissive per una e due settimane. In modo interessante, questi risultati suggeriscono che la funzione motoria potrebbe essere compromessa se la densità delle molecole di prestina nella membrana plasmatica è troppo elevata. È importante ricordare che i protocolli descritti qui richiedono l'uso corretto di tecniche consolidate di coltura cellulare.Inoltre, ricordare di evitare l'uso di antibiotici. In aggiunta, tenere presente che il fenotipo e la risposta delle cellule HEI-OC1 dipenderanno fortemente dai parametri di coltura.

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