La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

L'obiettivo generale di questa metodologia è sintetizzare idrogeli per applicazioni nell'ingegneria tissutale in modo molto semplice. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale, come la possibilità di mantenere un'elevata vitalità cellulare in sistemi di coltura cellulare tridimensionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, grazie a una reazione rapida, possiamo modificare facilmente i sistemi a base di idrogel per migliorarne la capacità di mantenere le cellule vive.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle lesioni del midollo spinale poiché le cellule caricate all'interno dell'impalcatura possono ricostruire il tessuto danneggiato. Questo metodo può fornire informazioni significative sulle terapie cellulari in medicina rigenerativa e sulle loro implicazioni in numerose metodologie. Può inoltre essere applicato in diversi altri sistemi, come l'osso, il cuore e la cartilagine.

Per sintetizzare il derivato RGD-azide, sciogliere 50 milligrammi di RGD in un millilitro di idrossido di sodio uno molare. Quindi sciogliere 24 milligrammi di 4-azidobutanoyl cloruro in due millilitri di tetraidrofurano. Aggiungere tutta la soluzione di RGD alla soluzione di 4-azidobutanoyl cloruro a zero gradi Celsius, goccia a goccia.

Riportare a temperatura ambiente e agitare durante la notte. Aggiungere un millilitro di HCl uno molare. Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.

Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica, sciogliendo il campione in ossido di deuterio o D2O. Per eseguire la modifica dell'alkine del PAA, sciogliere 200 milligrammi di una soluzione di PAA al 35% in peso in 15 millilitri di acqua distillata. Aggiungere 15,4 milligrammi di cloridrato di propargilammina.

Quindi sciogliere 42,8 milligrammi di HOBt in 14 millilitri di una soluzione di acetonitrile e acqua distillata in rapporto uno a uno, riscaldando a 50 gradi Celsius. Aggiungere tutta la soluzione di HOBt alla soluzione di PAA a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 53,6 milligrammi di EDC alla miscela di reazione.

Usare HCl 1 M per aggiustare il pH a 5,5 e agitare il sistema di reazione tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, sciogliere 11,2 grammi di cloruro di sodio in due litri di acqua distillata. Quindi aggiungere 200 microlitri di HCl al 37% in peso.

Dializzare la soluzione utilizzando una membrana con un cutoff di peso molecolare di 3,5 chilodalton. Eseguire la dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi ogni giorno con due litri di acqua distillata appena preparata contenente 200 microlitri di HCl al 37% in peso/peso.

Conservare la soluzione finale a meno 80 gradi Celsius. Caratterizzare il polimero funzionalizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica, sciogliendo il campione in D2O. Per sintetizzare il polimero PAA-RGD, sciogliere 78 milligrammi di PAA modificato con alchino in 10 millilitri di acqua distillata.

Quindi sciogliere 25 milligrammi del derivato RGD-azide in cinque millilitri di tetraidrofurano. Aggiungere tutta la soluzione di RGD alla soluzione polimerica. Successivamente, aggiungere 2,2 milligrammi di ioduro rameico.

E 2,2 milligrammi di ascorbato di sodio. Sottoporre la miscela risultante a riflusso durante la notte a 60 gradi Celsius sotto agitazione. Raffreddare la miscela a 25 gradi Celsius.

Per eseguire la dialisi della soluzione, sciogliere 11,2 grammi di cloruro di sodio in due litri di acqua distillata e aggiungere 200 microlitri di HCl al 37 percento in peso. Eseguire la dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi ogni giorno con due litri di acqua distillata appena preparata contenente 200 microlitri di HCl al 37% in peso.

Quindi, posizionare la soluzione finale a meno 80 gradi Celsius. Caratterizzare e conservare il polimero PAA-RGD ottenuto come fatto per i suoi costituenti. Mescolare 40 milligrammi di carbomero e 10 milligrammi di PAA funzionalizzato in nove millilitri di soluzione salina fosfato tamponata a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione.

Aggiungere 400 milligrammi di PEG alla soluzione e continuare a mescolare per 45 minuti. Arrestare il mescolamento e lasciare decantare il sistema per 30 minuti. Successivamente, utilizzare idrossido di sodio 1 M per aggiustare il pH a 7,4.

Aggiungere a cinque millilitri della miscela ottenuta 25 milligrammi di polvere di agarosio. Irradiare il sistema con radiazione a microonde a 500 watt per 30 secondi fino a un minuto fino all'ebollizione. E riscaldare elettromagneticamente la soluzione a 80 gradi Celsius.

Lasciare la miscela esposta a temperatura ambiente fino a quando la temperatura scende a 50 gradi Celsius. Aggiungere quindi cinque millilitri di PBS per ottenere una soluzione in rapporto volumetrico uno a uno. Preparare una piastra a 12 pozzetti contenente cilindri di acciaio con un diametro di 1,1 centimetri.

Prelevare aliquote di 500 microlitri dalla soluzione e posizionarle in ciascun cilindro di acciaio. Lasciare la piastra a riposo per 45 minuti fino al completamento della gelificazione del sistema. Rimuovere i cilindri utilizzando pinze in acciaio inossidabile per ottenere gli idrogeli.

Vedere il protocollo testuale per la caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche degli idrogeli funzionalizzati con RGD. Il Carbomer 974P, il PAA-RGD e il PEG, insieme all'agarosio, partecipano a una policondensazione statistica casuale dopo irradiazione a microonde. I gruppi ossidrilici contenuti nel PEG e nell'agarosio reagiscono con i gruppi carbossilici presenti nel Carbomer 947P e nel PAA-RGD per formare idrogeli ACPEG-RGD.

Considerando le proprietà reologiche, il modulo di stoccaggio si è rivelato circa un ordine di grandezza superiore rispetto al modulo di perdita, indicando un materiale di tipo elastico piuttosto che viscoso. Inoltre, è chiaramente visibile che il comportamento dell'idrogel è dominato, a valori di deformazione ridotti, dal modulo elastico. La microscopia elettronica a scansione mostra la morfologia di un campione di idrogel funzionalizzato con RGD e di un idrogel senza funzionalizzazione.

Entrambi gli idrogeli hanno rivelato di possedere una struttura altamente intrecciata di pori interconnessi, con alcuni pori più grandi contenenti pori più piccoli e alcune reti fibrose sulle pareti dei pori. Le proprietà simili indicano che la presenza di RGD non altera la rete polimerica. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la stabilità di questi sistemi di coltura cellulare in diverse altre malattie.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come funzionalizzare gli idrogeli. Migliorandone la capacità di mantenere cellule staminali vitali.