Name: La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Scopri la sintesi di idrogeli funzionalizzati con RGD per applicazioni di ingegneria tissutale utilizzando CuAAC e poliaddensazione assistita da microonde. Questo metodo migliora la vitalità cellulare e supporta terapie rigenerative.

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Gli autori desiderano ringraziare il Prof. Maurizio Masi per la discussione proficua e Miss Chiara Allegretti per la modifica della lingua. Autori &#39;è supportata dal Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2.312.573).

Nota: Le sostanze chimiche sono utilizzate come ricevuto. Linear RGD è stato acquistato, ma può essere preparato in fase solida serie Fmoc peptide di sintesi 16,19. I solventi sono di grado analitico. La dialisi richiede l&#39;uso di membrane con un M w pari a 3.500 Da cut-off. I composti sintetizzati sono caratterizzati da spettri 1 H NMR registrati su uno spettrometro 400 MHz usando cloroformio (CDCl 3) o ossido di deuterio (D 2 O) come solventi e spostamenti chimici sono riportati come valori δ in parti per milione. Inoltre, idrogel sono sottoposti ad analisi FT-IR con tecnica KBr pellet e la loro caratterizzazione fisica coinvolge studi gelificazione valutati utilizzando la provetta capovolta a 37 ° C. 1. Sintesi di 4-Azidobutanoyl Cloruro 1 <ol><li> Sciogliere 500 mg di 4-azidobutanoic acido (3,90 mmol) in 10 ml di diclorometano e 0,5 ml di dimetilformamide. </li><li> Raffreddare la soluzione a 0 ° C, Utilizzando un bagno di ghiaccio. </li><li> Aggiungere 505 ml di cloruro di ossalile (5,85 mmol) a 5 ml di diclorometano e aggiungere lentamente goccia a goccia al sistema di reazione, sotto agitazione. </li><li> Dopo 1 ora a 0 ° C utilizzando un bagno di ghiaccio, tornare a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia 1 H-NMR, sciogliendo il campione in CDCl 3 16. </li></ol> 2. Sintesi di RGD-azide Derivata 2 <ol><li> Sciogliere 50 mg di RGD (0,145 mmoli) in 1 ml di 1 M NaOH. </li><li> Sciogliere 24 mg di 1 (0,16 mmol) in 2 ml di tetraidrofurano. </li><li> Aggiungere tutta la soluzione RGD di soluzione 1 a gocce a 0 ° C utilizzando un bagno di ghiaccio. </li><li> Ritorno a temperatura ambiente e mescolare durante la notte. </li><li> Aggiungere 1 ml di 1 M HCl. </li><li> Eliminare il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. </li><li> Caratterizzare la OBTained prodotto 1 spettroscopia H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16. </li></ol> 3. PAA Acetilene Modifica 3 <ol><li> Sciogliere 200 mg di 35% w / w soluzione PAA (2,8 mmol) in 15 ml di acqua distillata. </li><li> Aggiungere 15.4 mg di propargylamine cloridrato (0.20 mmol). </li><li> Disciogliere 42,8 mg di 1-idrossibenzotriazolo idrato (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml di una miscela 1: 1 v / v acetonitrile: soluzione acquosa, tramite riscaldamento a 50 ° C. </li><li> Aggiungere tutta la soluzione HOBt alla soluzione di PAA a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 53,6 mg di ethyldimethylaminopropylcarbodiimide (EDC, 0,28 mmol) alla miscela di reazione. </li><li> Utilizzare 1 M HCl per regolare il pH a 5,5 e agitare il sistema di reazione notte a temperatura ambiente. </li><li> Dializzare la soluzione. Sciogliere 11.2 g di cloruro di sodio in 2 L di acqua distillata e aggiungere 0,2 ml di 37% w / w HCl. Dializzare la soluzione con una membrana con un M w cut-off di 3,5 kDa. </li><li> Perfola dialisi rm per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi quotidiana con 2 L di acqua distillata preparata di recente contenente 0,2 ml di 37% w / w HCl. </li><li> Conservare la soluzione finale a -80 ° C. Lyophilize in un liofilizzatore secondo i protocolli del produttore. </li><li> Caratterizzare il polimero funzionalizzato da 1 spettroscopia H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16. </li></ol> 4. Sintesi di PAA-RGD Polymer 4 <ol><li> Sciogliere 78 mg di PAA modificato alkyne 3 (1.083 mmol) in 10 ml di acqua distillata. </li><li> Disciogliere 25 mg del RGD azide 2 derivato (0,0722 mmoli) in 5 ml di tetraidrofurano. </li><li> Aggiungere tutta la soluzione RGD alla soluzione polimerica. </li><li> Aggiungere 2,2 mg di ioduro di rame (0,0116 mmoli) e 2,2 mg di ascorbato di sodio (0.0111 mmol). </li><li> Riflusso la miscela risultante per una notte a 60 ° C, sotto agitazione. </li><li> Raffreddare la miscela a 25 ° C. </li><li> Dialyzvia e la soluzione. Sciogliere 11.2 g di cloruro di sodio in 2 L di acqua distillata e aggiungere 0,2 ml di 37% w / w HCl. Dializzare la soluzione con una membrana con un M w cut-off di 3,5 kDa. </li><li> Eseguire dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi quotidiana con 2 L di acqua distillata preparata di recente contenente 0,2 ml di 37% w / w HCl. </li><li> Conservare la soluzione finale a -80 ° C. Lyophilize in un liofilizzatore secondo i protocolli del produttore. </li><li> Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia 1 H-NMR, sciogliendo il campione in D 2 O 16. </li></ol> 5. RGD-funzionalizzati idrogel Sintesi <ol><li> Preparare il PBS. Sciogliere 645 mg di sale PBS in 50 ml di acqua distillata. </li><li> Miscela 40 mg di carbomer e 10 mg di PAA funzionalizzati 4 in 9 ml di PBS (passo 5.1), a temperatura ambiente, fino a dissoluzione completa (30 min). </li><li> Aggiungere 400 mg di PEG alla soluzione e mantenere agitazione per 45 min. </li><li> Fermare l&#39;agitazione e consentire al sistema di accontentarsi di 30 min. </li><li> Utilizzare 1 N NaOH per aggiustare il pH a 7,4. </li><li> A 5 ml della miscela ottenuta, aggiungere 25 mg di polvere di agarosio. </li><li> Irradiare il sistema con radiazione a microonde a 500 W fino a ebollizione, per un tempo generalmente compreso tra 30 secondi e 1 minuto ed elettromagneticamente riscaldare fino a 80 ° C. </li><li> Lasciare la miscela esposto a temperatura ambiente fino alla temperatura scende a 50 ° C e aggiungere 5 ml di PBS (punto 5.1), in modo da ottenere una soluzione in un rapporto 1: 1 volumetrico. </li><li> Preparare 12 piastra contenente cilindri di acciaio multipozzetto con un diametro di 1,1 cm. </li><li> Prendere 500 microlitri aliquote dalla soluzione e metterle a ciascun cilindri in acciaio. </li><li> Lasciare a riposo per 45 minuti fino a completa gelificazione del sistema. </li><li> Rimuovere i cilindri con una pinza in acciaio inox per ottenere gli idrogel. </li></ol> 6. Caricamento di strumento terapeutico (Drug o cellule) <ol><li> ripetere steps 5,1-5,7. </li><li> Quando il composto (già allo stato sol) raggiunge 37 ° C, aggiungere 5 ml della soluzione contenente la coltura soluzione medicinale o cella desiderato, al fine di ottenere un sistema finale in un rapporto 1: 1 volumetrico. </li><li> Ripetere i passaggi 5,9-5,12 per ottenere reti polimerici con biocompounds intrappolate fisicamente all&#39;interno del gel. </li></ol> 7. Hydrogel Caratterizzazione <ol><li> Analisi FT-IR <ol><li> Dopo formazione del gel, immergere uno degli idrogel sintetizzati in 2,5 ml di acqua distillata per 24 ore. </li><li> Rimuovere i mezzi acquosi in cui è sommerso idrogel e congelare-secco con liquido N 2. </li><li> Laminato campione idrogel secondo la tecnica pellet KBr. <ol><li> Aggiungere una spatola piena di KBr in un mortaio di agata. Prendere una piccola quantità di campione idrogel (circa 0,1-2% dell&#39;importo KBr, o appena sufficiente a coprire la punta di spatola) e mescolare con la polvere KBr. </li><li> Macinare il composto fino a quando la polvere è fine ed omogenea. &lt;/ Li&gt; <li> Utilizzare il kit di pellet di KBr per formare il pellet IR. Pressare la polvere utilizzando una pressa da laboratorio manuale: per 3 min a capacità di pressione pari a 5 tonnellate e poi per 3 min a capacità di pressione di 10 tonnellate. </li><li> Rilasciare la pressione per ottenere il pellet finale omogeneo e trasparente in apparenza. Inserire il pellet nel supporto del campione IR ed eseguire lo spettro 16. </li></ol></li></ol></li><li> Studi gelificazione <ol><li> Riempire provetta 2 ml con 900 ml di PBS ed equilibrare a 37 ° C. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della soluzione polimerica preparata per formare l&#39;idrogel e incubare a 37 ° C. </li><li> Capovolgere la provetta e osservare se il gel fluisce a 1, 2, 5, 10 e 20 min. Registrare il momento in cui il gel non scorre come il tempo di gelificazione. </li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi e di non aver ricevuto alcun pagamento per la preparazione di questo manoscritto.

La modifica post-polimerizzazione del PAA con frazioni alchine e la funzionalizzazione dell'RGD con il gruppo azidico garantiscono la formazione di un legame stabile tra il polimero e il peptide. Infatti, il triazolo funge da unità di collegamento rigida tra gli atomi di carbonio, attaccato alle posizioni 1,4 dell'anello 1,2,3-triazolico e non può essere scisso idroliticamente o in altro modo. Inoltre, il triazolo è estremamente difficile da ossidare e ridurre, a differenza di altre strutture cicliche come i benzenoidi e...

Gli idrogel sono reti tridimensionali formate da polimeri reticolati idrofili, che sono naturali o sintetici, e caratterizzata da una struttura tridimensionale distintivo. Questi dispositivi sono sempre più interessante nel campo biomedico di drug delivery, l&#39;ingegneria dei tessuti, portatori del gene e sensori intelligenti 1,2. Infatti, il loro elevato contenuto di acqua, come pure le proprietà reologiche e meccaniche li rendono idonei ad imitare microambienti tessuti molli e renderli strumenti efficaci per citochine idrosolubile o la crescita consegna fattore. Uno degli utilizzi più promettenti è come biomateriale iniettabile trasportano cellule e composti bioattivi. Gli idrogel possono migliorare la sopravvivenza delle cellule e il destino delle cellule staminali di controllo tenendo premuto e consegnando precisamente segnali regolatori di cellule staminali in modo rilevante fisiologico, come osservato in in vitro e in esperimenti in vivo 3,4. Il vantaggio principale di questo è la possibilitàmantenere cellule iniettate nella zona di inoculazione (in situ), minimizzando la quantità di cellule che lascia la zona e extravasates nel torrente circolatorio, migrando tutto il corpo e perdere l&#39;obiettivo di destinazione 5. La stabilità delle reti idrogel tridimensionali è dovuto suoi siti di reticolazione, formate da legami covalenti o forze di coesione tra le catene polimeriche 6. In questo quadro, ortogonale chimica selettiva applicata a catene polimeriche è uno strumento versatile in grado di migliorare le prestazioni di idrogel 7. Infatti, la modifica di polimeri con opportuni gruppi chimici potrebbe contribuire a fornire proprietà meccaniche chimiche appropriate, fisica e migliorare la vitalità cellulare e il loro uso nella formazione di tessuto. Allo stesso modo, tra le tecniche per caricare cellule o fattori di crescita nella matrice del gel, l&#39;uso del peptide RGD permette miglioramenti nella adesione cellulare e la sopravvivenza. RGD è un tripeptide compostodi arginina, glicina e acido aspartico, che è di gran lunga il più efficace e spesso impiegato tripeptide grazie alla sua capacità di affrontare più di un recettore adesione cellulare e il suo impatto biologica sulla ancoraggio delle cellule, il comportamento e la sopravvivenza 8,9. In questo lavoro, la sintesi di idrogel RGD-funzionalizzato è studiato con l&#39;obiettivo di progettare reti caratterizzate da sufficienti proprietà biochimiche per un microambiente delle cellule ospitale. L&#39;uso di radiazione a microonde nella sintesi idrogel offre una semplice procedura per minimizzare le reazioni collaterali e di ottenere velocità di reazione più elevate e rendimenti in un periodo di tempo più breve rispetto ai processi termici convenzionali 10. Questo metodo non richiede fasi di purificazione e rese idrogel sterili a causa delle interazioni dei polimeri e l&#39;assenza di solvente organico nel sistema di reazione 11. Pertanto, si garantisce elevate percentuali di RGD collegati alla rete polimerica perché no modifications sono tenuti ai gruppi chimici dei polimeri coinvolti nella formazione di gel. gruppi carbossilici, da PAA e carbomer, e gruppi idrossilici, da PEG e agarosio, danno luogo alla struttura tridimensionale idrogel attraverso una reazione di policondensazione. I polimeri citati sono utilizzati per la sintesi degli idrogel nelle lesioni del midollo spinale trattamenti riparazione 12. Questi dispositivi, come riportato nel precedente opere 13,14, presentano un&#39;elevata biocompatibilità e proprietà meccaniche e chimico-fisiche che assomigliano a quelli di molti tessuti viventi e in natura tissotropica. Inoltre, essi rimangano localizzati in situ, in corrispondenza della zona di iniezione. In questo lavoro, PAA gruppi carbossilici vengono modificati con un residuo alchino (figura 1), e un composto RGD-azide viene sintetizzata sfruttando la reattività del gruppo terminale tripeptide -NH 2 con un composto chimico preparato con struttura (CH 2) n - N 3 (&lt;strong&gt; Figura 2). Successivamente, il PAA modificato reagisce con il derivato RGD-azide attraverso CuAAC click reazione 15-17 (Figura 3). L&#39;uso di rame (I) catalizzatore comporta notevoli miglioramenti sia la velocità di reazione e la regioselettività. La reazione CuAAC è ampiamente utilizzato nella sintesi organica e nella scienza dei polimeri. Esso combina alta efficienza e un&#39;alta tolleranza ai gruppi funzionali, ed è influenzato dalla uso di solventi organici. Una alta selettività, un tempo di reazione veloce e semplice procedura di purificazione consentono l&#39;ottenimento di polimeri stella, copolimeri a blocchi o catene innesto frazioni desiderate 18. Questa strategia scatto consente di modificare polimeri dopo la polimerizzazione per personalizzare le proprietà fisico-chimiche a seconda dell&#39;applicazione finale biochimico. Le condizioni sperimentali CuAAC sono facilmente riproducibile (la reazione è insensibile all&#39;acqua, mentre l&#39;ossidazione del rame può verificarsi minimamente), e la natura ditriazolo formata assicura la stabilità del prodotto. L&#39;uso di rame metallico può essere considerato un punto critico, per il suo potenziale effetto tossico sulle cellule e nel microambiente biologico, ma la dialisi è utilizzato come metodo di purificazione per consentire la completa rimozione dei residui catalitici. Infine, PAA modificato RGD è utilizzato nella sintesi idrogel (figura 4) e le proprietà fisico-chimiche delle reti risultanti sono indagati, al fine di verificare il potenziale funzionalità di questi sistemi come cellule o farmaci vettori. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig1.jpg" /> Figura 1: PAA modificato sintesi alkyne Uno schema di PAA funzionalizzazione con il gruppo alkyne;. &quot;n&quot; indica i monomeri con gruppo carbossilico reagendo con propargylamine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere</a>una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig2.jpg" /> Figura 2:.. RGD-azide sintesi La sintesi di derivato RGD-azide <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig3.jpg" /> Figura 3: Clicca reazione Schema di reazione click tra RGD-azide derivato e alchini-PAA.. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54445/54445fig4.jpg" /> Figura 4: Hydrogel SyntESI. RGD funzionalizzato procedura di sintesi idrogel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54445/54445fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Soluzione di poli(acido acrilico) media Mw ~100.000, 35% in peso in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>523925</td><td>CAS 9003-01-4</td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico) 2.000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84797</td><td>CAS 25322-68-3</td></tr><tr><td>Carbomeer 974P</td><td>Fagron</td><td>1387083</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Invitrogen Corp.</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>Peptide ultrapuro di agarosio RGD</td><td>abcam</td><td>ab142698</td><td></td></tr><tr><td>acido 4-azidobutanoico</td><td>Aurum Pharmatech</td><td>Z-2421</td><td>&nbsp; CAS 54447-68-6</td></tr><tr><td>Cloruro di ossalile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O8801</td><td>CAS 79-37-8</td></tr><tr><td>Propargylamine cloridrato 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50919</td><td>CAS 15430-52-1</td></tr><tr><td>Ioduro di rame (I)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3140</td><td>CAS 7681-65-4</td></tr><tr><td>Ascorbato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0000039</td><td>CAS 134-03-2</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr>Laboratori di spettro<td>della membrana per dialisi</td><td>, Inc.</td><td>Membrana per</td><td>dialisi 132725 Spectra/POR 3&nbsp; Tubi RC standard MWCO: 3,5 kD</td></tr></tbody></table>

la sintesi di rgd-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

L'uso dei polimeri come biomateriali ha fornito vantaggi significativi nelle applicazioni terapeutiche. In particolare, la possibilità di modificare e funzionalizzare catene polimeriche con composti in grado di migliorare la biocompatibilità, le proprietà meccaniche o la vitalità cellulare consente la progettazione di nuovi materiali per affrontare nuove sfide in campo biomedico. Con le strategie di funzionalizzazione dei polimeri, la click chemistry è un potente strumento per migliorare la compatibilità cellulare e le proprietà di somministrazione dei farmaci dei dispositivi polimerici. Allo stesso modo, la necessità fondamentale della biomedicina di utilizzare strumenti sterili per evitare potenziali effetti collaterali avversi, come la tossicità o la contaminazione dell'ambiente biologico, dà origine a un crescente interesse per la strategia assistita da microonde.
La combinazione della click chemistry e del metodo assistito da microonde è adatta per produrre idrogel biocompatibili con le funzionalità desiderate e prestazioni migliorate nelle applicazioni biomediche. Questo lavoro mira a sintetizzare idrogel funzionalizzati con RGD. RGD (acido arginilglicilaspartico) è un tripeptide in grado di imitare le proteine di adesione cellulare e legarsi ai recettori della superficie cellulare, creando un microambiente ospitale per le cellule all'interno della rete polimerica 3D degli idrogel. La funzionalizzazione di RGD avviene attraverso la cicloaddizione 1,3-dipolare di Huisgen. Alcuni gruppi carbossilici PAA sono modificati con una porzione alchinica, mentre l'RGD è funzionalizzato con l'acido azido come residuo terminale della sequenza peptidica. Infine, entrambi i prodotti sono utilizzati in una reazione a clic catalizzata dal rame per legare in modo permanente il peptide al PAA. Questo polimero modificato viene utilizzato con carbomer, agarosio e polietilenglicole (PEG) per sintetizzare una matrice di idrogel. La struttura 3D si forma a causa di una reazione di esterificazione che coinvolge i gruppi carbossilici da PAA e carbomero e i gruppi ossidrilici da agarosio e PEG attraverso la policondensazione assistita da microonde. L'efficienza del meccanismo di gelificazione garantisce un alto grado di funzionalizzazione RGD. Inoltre, la procedura per caricare composti terapeutici o strumenti biologici all'interno di questa rete funzionalizzata è molto semplice e riproducibile.

Il derivato PAA alchino viene efficacemente sintetizzato da acido poliacrilico e propargylamine, come mostrato in Figura 1 dove n etichette monomeri i cui gruppi carbossilici reagire con l&#39;ammina. L&#39;identità del prodotto è confermata mediante spettroscopia 1 H-NMR. La Figura 5 mostra la 1 H-NMR Spettro di PAA modificato con triplo legame. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54445/5...

Presentiamo un protocollo per la sintesi di idrogel funzionalizzati con RGD come dispositivi per la somministrazione di cellule e farmaci. La procedura prevede la cicloaddizione alchino-azidica (CuAAC) catalizzata dal rame tra l'acido poliacrilico modificato con alchino (PAA) e un derivato RGD-azide. Gli idrogel sono formati utilizzando la policondensazione assistita da microonde e le loro proprietà fisico-chimiche sono studiate.

La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è sintetizzare idrogeli per applicazioni nell'ingegneria tissutale in modo molto semplice. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'ingegneria tissutale, come la possibilità di mantenere un'elevata vitalità cellulare in sistemi di coltura cellulare tridimensionali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, grazie a una reazione rapida, possiamo modificare facilmente i sistemi a base di idrogel per migliorarne la capacità di mantenere le cellule vive.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle lesioni del midollo spinale poiché le cellule caricate all'interno dell'impalcatura possono ricostruire il tessuto danneggiato. Questo metodo può fornire informazioni significative sulle terapie cellulari in medicina rigenerativa e sulle loro implicazioni in numerose metodologie. Può inoltre essere applicato in diversi altri sistemi, come l'osso, il cuore e la cartilagine.Per sintetizzare il derivato RGD-azide, sciogliere 50 milligrammi di RGD in un millilitro di idrossido di sodio uno molare. Quindi sciogliere 24 milligrammi di 4-azidobutanoyl cloruro in due millilitri di tetraidrofurano. Aggiungere tutta la soluzione di RGD alla soluzione di 4-azidobutanoyl cloruro a zero gradi Celsius, goccia a goccia.Riportare a temperatura ambiente e agitare durante la notte. Aggiungere un millilitro di HCl uno molare. Rimuovere il solvente sotto pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.Caratterizzare il prodotto ottenuto mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica, sciogliendo il campione in ossido di deuterio o D2O. Per eseguire la modifica dell'alkine del PAA, sciogliere 200 milligrammi di una soluzione di PAA al 35% in peso in 15 millilitri di acqua distillata. Aggiungere 15,4 milligrammi di cloridrato di propargilammina.Quindi sciogliere 42,8 milligrammi di HOBt in 14 millilitri di una soluzione di acetonitrile e acqua distillata in rapporto uno a uno, riscaldando a 50 gradi Celsius. Aggiungere tutta la soluzione di HOBt alla soluzione di PAA a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere 53,6 milligrammi di EDC alla miscela di reazione.Usare HCl 1 M per aggiustare il pH a 5,5 e agitare il sistema di reazione tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, sciogliere 11,2 grammi di cloruro di sodio in due litri di acqua distillata. Quindi aggiungere 200 microlitri di HCl al 37% in peso. Dializzare la soluzione utilizzando una membrana con un cutoff di peso molecolare di 3,5 chilodalton. Eseguire la dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi ogni giorno con due litri di acqua distillata appena preparata contenente 200 microlitri di HCl al 37% in peso/peso.Conservare la soluzione finale a meno 80 gradi Celsius. Caratterizzare il polimero funzionalizzato mediante spettroscopia di risonanza magnetica nucleare protonica, sciogliendo il campione in D2O. Per sintetizzare il polimero PAA-RGD, sciogliere 78 milligrammi di PAA modificato con alchino in 10 millilitri di acqua distillata.Quindi sciogliere 25 milligrammi del derivato RGD-azide in cinque millilitri di tetraidrofurano. Aggiungere tutta la soluzione di RGD alla soluzione polimerica. Successivamente, aggiungere 2,2 milligrammi di ioduro rameico.E 2,2 milligrammi di ascorbato di sodio. Sottoporre la miscela risultante a riflusso durante la notte a 60 gradi Celsius sotto agitazione. Raffreddare la miscela a 25 gradi Celsius.Per eseguire la dialisi della soluzione, sciogliere 11,2 grammi di cloruro di sodio in due litri di acqua distillata e aggiungere 200 microlitri di HCl al 37 percento in peso. Eseguire la dialisi per tre giorni. Cambiare la soluzione di dialisi ogni giorno con due litri di acqua distillata appena preparata contenente 200 microlitri di HCl al 37% in peso.Quindi, posizionare la soluzione finale a meno 80 gradi Celsius. Caratterizzare e conservare il polimero PAA-RGD ottenuto come fatto per i suoi costituenti. Mescolare 40 milligrammi di carbomero e 10 milligrammi di PAA funzionalizzato in nove millilitri di soluzione salina fosfato tamponata a temperatura ambiente fino a completa dissoluzione.Aggiungere 400 milligrammi di PEG alla soluzione e continuare a mescolare per 45 minuti. Arrestare il mescolamento e lasciare decantare il sistema per 30 minuti. Successivamente, utilizzare idrossido di sodio 1 M per aggiustare il pH a 7,4.Aggiungere a cinque millilitri della miscela ottenuta 25 milligrammi di polvere di agarosio. Irradiare il sistema con radiazione a microonde a 500 watt per 30 secondi fino a un minuto fino all'ebollizione. E riscaldare elettromagneticamente la soluzione a 80 gradi Celsius.Lasciare la miscela esposta a temperatura ambiente fino a quando la temperatura scende a 50 gradi Celsius. Aggiungere quindi cinque millilitri di PBS per ottenere una soluzione in rapporto volumetrico uno a uno. Preparare una piastra a 12 pozzetti contenente cilindri di acciaio con un diametro di 1,1 centimetri.Prelevare aliquote di 500 microlitri dalla soluzione e posizionarle in ciascun cilindro di acciaio. Lasciare la piastra a riposo per 45 minuti fino al completamento della gelificazione del sistema. Rimuovere i cilindri utilizzando pinze in acciaio inossidabile per ottenere gli idrogeli.Vedere il protocollo testuale per la caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche degli idrogeli funzionalizzati con RGD. Il Carbomer 974P, il PAA-RGD e il PEG, insieme all'agarosio, partecipano a una policondensazione statistica casuale dopo irradiazione a microonde. I gruppi ossidrilici contenuti nel PEG e nell'agarosio reagiscono con i gruppi carbossilici presenti nel Carbomer 947P e nel PAA-RGD per formare idrogeli ACPEG-RGD.Considerando le proprietà reologiche, il modulo di stoccaggio si è rivelato circa un ordine di grandezza superiore rispetto al modulo di perdita, indicando un materiale di tipo elastico piuttosto che viscoso. Inoltre, è chiaramente visibile che il comportamento dell'idrogel è dominato, a valori di deformazione ridotti, dal modulo elastico. La microscopia elettronica a scansione mostra la morfologia di un campione di idrogel funzionalizzato con RGD e di un idrogel senza funzionalizzazione.Entrambi gli idrogeli hanno rivelato di possedere una struttura altamente intrecciata di pori interconnessi, con alcuni pori più grandi contenenti pori più piccoli e alcune reti fibrose sulle pareti dei pori. Le proprietà simili indicano che la presenza di RGD non altera la rete polimerica. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada alla ricerca nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare la stabilità di questi sistemi di coltura cellulare in diverse altre malattie.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come funzionalizzare gli idrogeli. Migliorandone la capacità di mantenere cellule staminali vitali.

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Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.

La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

Questo video illustrerà un metodo rapido e efficiente per metacrilato poli (glicole etilenico), consentendo polimerizzazioni a catena e sintesi idrogel. Si dimostrerà come introdurre in modo simile funzionalità metacrilammide in peptidi, dettaglio metodi analitici comuni per valutare l'efficienza funzionalizzazione, fornire suggerimenti per la risoluzione dei problemi e le modifiche avanzate, e dimostrare le tecniche tipiche di caratterizzazione idrogel.

Forno a microonde assistita Funzionalizzazione di poli (etilene glicole) e On-resina Peptidi per l&#39;uso a polimerizzazione a catena ed idrogel Formazione

Descriviamo un processo sequenziale per la formazione mediata dalla luce e il successivo patterning biochimico di matrici sintetiche di idrogel per applicazioni di coltura cellulare tridimensionale. Viene dimostrata la costruzione e la modifica di idrogel con la chimica fotoclick citocompatibile. Inoltre, vengono presentate tecniche semplici per quantificare e osservare i modelli e determinare la vitalità cellulare all'interno di questi idrogel.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Protocolli sono descritti per la realizzazione di idrogeli degradabile Hydrogel basati su idrazone cross-linking di oligomeri polimerici sulla scala di massa, microscala e su scala nanometrica, quest'ultimo per preparazione di nanoparticelle di gel e di nanofibre.

Fabbricando degradabile Hydrogel idrogeli su scale di lunghezza Multiple tramite estrusione reattiva, microfluidica, auto-assemblaggio ed elettrofilatura

Diversi metodi per manipolare architettura tridimensionale in idrogel a base di proteine vengono valutate qui rispetto alla proprietà del materiale. Le reti di macroporosa sono funzionalizzate con un peptide di cella-adesivo, e loro fattibilità in coltura cellulare viene valutata utilizzando due linee cellulari di modello diverso.

Facile manipolazione delle architetture in idrogel a base di proteine per applicazioni della coltura delle cellule

In questo metodo, usiamo fotopolimerizzazione e tecniche di chimica clicca per creare modelli di proteina o peptide sulla superficie di idrogeli di polietilenglicole (PEG), fornendo immobilizzata bioattivi segnali per lo studio delle risposte cellulari in vitro .

Patterning bioattivi proteine o peptidi su idrogel utilizzando fotochimica per applicazioni biologiche

Modelli di cultura doppio strato attuali non consentono per studi funzionali in vitro che imitano microambienti in vivo . Utilizzando polietilene glicole e un metodo di applicazione di modelli di ossido di zinco, questo protocollo descrive lo sviluppo di una membrana basale biomimetici ultrasottile con rigidità sintonizzabile, porosità e composizione biochimica che imita molto attentamente in vivo matrici extracellulari.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

Questo protocollo descrive la sintesi e la formulazione di biomateriali idrogel iniettabili, supramolecolari polimeri-nanoparticella (PNP). Vengono dimostrate le applicazioni di questi materiali per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule.

Idrogel supramolecolari supramolecolari iniettabili per applicazioni di somministrazione di cellule e farmaci

Il protocollo qui presentato mostra la sintesi di un forte idrogel adesivo gelatina o-nitrosobenzaldeide (gelatina-NB). La gelatina-NB ha una capacità di adesione tissutale rapida ed efficiente, che può formare una forte barriera fisica per proteggere le superfici delle ferite, quindi dovrebbe essere applicata al campo della biotecnologia per la riparazione delle lesioni.

Sintesi di idrogel adesivo forte, gelatina O-nitrosobenzaldeide

Qui, presentiamo due protocolli per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in matrici di idrogel su macroscala senza la necessità di una fase liquida esterna.

Metodi per incorporare reazioni di sintesi proteica cellulo-free in idrogel su macroscala

Scopri la sintesi di idrogeli funzionalizzati con RGD per applicazioni di ingegneria tissutale utilizzando CuAAC e poliaddensazione assistita da microonde. Questo metodo migliora la vitalità cellulare e supporta terapie rigenerative.

La sintesi di RGD-funzionalizzati idrogeli come strumento per applicazioni terapeutiche

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