Conteggio di cellule staminali neurali L'utilizzo clonali Assays

L'obiettivo generale di questa procedura è enumerare la frequenza delle cellule staminali neurali in una popolazione data mediante la formazione e la differenziazione di neurosfere in condizioni clonali. Questo metodo ha importanti applicazioni nel campo delle cellule staminali neurali, come la valutazione di marcatori candidati per le cellule staminali neurali, la purificazione delle cellule staminali neurali e la distinzione tra cellule staminali neurali e progenitori neurali. I vantaggi di questo metodo sono che richiede 13 giorni per essere eseguito, un periodo più breve rispetto ai metodi attuali per enumerare la frequenza delle cellule staminali neurali, ed è effettuato in condizioni clonali.

Per iniziare questa procedura, al primo giorno, preparare il mezzo di crescita per le NSC mescolando il mezzo DMEM F12 con B27, EGF, BFGF e penicillina-streptomicina. Successivamente, dissociare le neurosfere di topo E14.5 in un millilitro di mezzo di crescita per le NSC e un millilitro di idrossido di sodio 0,05 N per sette minuti a temperatura ambiente. Pipettare le cellule su e giù occasionalmente per mantenerle in sospensione, quindi aggiungere un millilitro di acido cloridrico 0,05 N per neutralizzare l'alcali.

In seguito, eseguire un conteggio cellulare utilizzando la colorazione con blu di tripano e un emocitometro. Successivamente, seminare singole cellule di neurosfera di topo E14.5 a una densità di 50 cellule per millilitro o inferiore in 100 microlitri di mezzo di crescita per NSC in una piastra a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per una settimana per generare neurosfere clonali.

Per coltivare neurosfere al fine di ottenere il mezzo condizionato, al terzo giorno dissociare le neurosfere di topo E14.5 e seminare le cellule singole a una densità di 20.000 cellule per millilitro in 10 millilitri di mezzo di crescita per NSC in una piastra da coltura di 10 centimetri. Incubare quindi le cellule a 37 gradi Celsius, 5%CO2 per cinque giorni per generare neurosfere coltivate in massa. All'ottavo giorno preparare la soluzione per il coating mescolando 700 microlitri di poli-L-lisina allo 0,01%, 70 microlitri di laminina, aggiungere un milligrammo per millilitro e 6.230 microlitri di PBS.

Successivamente, ricoprire una piastra da coltura da 10 centimetri con sette millilitri di soluzione di poli-L-lisina laminina per due ore a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta sierologica da 10 millilitri, trasferire tutte le neurosfere coltivate in massa in un tubo conico da 15 millimetri. Centrifugare le neurosfere a 171 ×g per un minuto a temperatura ambiente e rimuovere completamente il soprannatante.

In seguito, preparare il mezzo di differenziamento per le NSC combinando il mezzo DMEM F12 con B27 e siero fetale bovino (FBS). Aggiungere 10 millilitri di mezzo di differenziamento per le NSC alle neurosfere e pipettare su e giù alcune volte per risospendere le neurosfere. Quindi aspirare la poli-L-lisina laminina dalla piastra da coltura da 10 centimetri e lavare una volta con 10 millilitri di PBS.

Trasferire tutte le neurosfere nella piastra da coltura da 10 centimetri rivestita con poli-L-lisina e laminina, quindi incubarle per tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5% CO₂ affinché le neurosfere aderiscano alla piastra. All'ottavo giorno, contare al microscopio il numero di neurosfere formate in ciascun pozzetto, quindi rivestire ciascun pozzetto di una piastra con coprivetrino a 50 pozzetti con 10 microlitri di soluzione di rivestimento con poli-L-lisina e laminina per due ore a 37 gradi Celsius. Successivamente, preparare tre provette coniche da centrifuga da 50 millilitri contenenti ciascuna 30 millilitri di PBS.

Utilizzando pinze sterili, rimuovere la coprivetrino con camera da 50 pozzetti rivestita, immergere la coprivetrino con camera nel primo tubo di PBS, seguito dal secondo e poi dal terzo tubo di PBS per rimuovere la soluzione di rivestimento. Successivamente, aspirare qualsiasi liquido residuo dai pozzetti della coprivetrino con camera. Trasferire delicatamente tutto il mezzo e le neurosfere da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti a una singola piastra da coltura di 10 centimetri.

Assicurarsi di prelevare un singolo neurosfera ogni volta impostando la colonna della pipetta su due microlitri; sotto il microscopio, selezionare una neurosfera campione utilizzando una micropipetta P10 dotata di una punta da 10 microlitri. Le neurosfere possono essere prelevate sotto il microscopio, posizionate in una cappa a flusso laminare o su un bancone. Successivamente, trasferire la neurosfera al centro di una pozzetta di una piastrina con coprivetrino rivestito da 50 pozzette.

Ripetere le procedure fino a quando ogni pozzetto del coprivetrino con camere non contiene una neurosfera. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di mezzo di differenziamento per le NSC in ogni pozzetto del coprivetrino con camere. Posizionare il coprivetrino con camere in una piastra da coltura da 10 centimetri.

Si possono posizionare fino a due coprivetri con camera in una piastra da 10 centimetri. Pipettare PBS lungo i bordi della piastra per evitare l'essiccamento del mezzo di differenziamento delle NSC. Incubare il coprivetro con camera tutta la notte a 37 gradi Celsius, 5%CO2.

Al nono giorno, trasferire il mezzo condizionato proveniente dai neurosfere coltivati in massa in un tubo conico da 15 millilitri per centrifuga. Utilizzando una siringa sterile da 20 millilitri, far passare il mezzo condizionato attraverso un filtro da 0,2 micrometri per rimuovere eventuali cellule o detriti. Successivamente, trasferire il mezzo condizionato filtrato nuovamente nella piastra da coltura da 10 centimetri.

Successivamente, utilizzando pinze sterili, posizionare delicatamente il cover slip con camera sul mezzo condizionato in maniera capovolta, in modo che le neurosfere campione siano rivolte verso il basso. Incubare il cover slip con camera per tre giorni a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Al giorno 12, rimuovere delicatamente il cover slip con camera dalla piastra di coltura da 10 centimetri utilizzando pinze sterili.

Immergere delicatamente il coprivetrino in PBS per rimuovere il mezzo condizionato. Successivamente, staccare la guarnizione di silicone dal coprivetrino, operando con delicatezza e lentezza per evitare di rompere il coprivetrino. Prendere nota del lato su cui sono aderiti i neurosfere differenziati.

Successivamente, pipettare un millimetro di paraformaldeide al 4% su un pezzo di pellicola di paraffina tagliato delle dimensioni del cover slip. Posizionare delicatamente il cover slip sulla pellicola di paraffina con le neurosfere rivolte verso il basso a contatto con la paraformaldeide e fissare le neurosfere per 20 minuti a temperatura ambiente. In questo caso, singole neurosfere sono state selezionate e differenziate in un cover slip con camera da 50 pozzetti per tre giorni.

Questa è un'immagine rappresentativa di una neurosfera tripotente colorata con DAPI e immunoistochimicamente marcata per GFAP, TUJ1 e O4. Questa immagine mostra la sovrapposizione di DAPI, GFAP, TUJ1 e O4. Questo protocollo viene utilizzato per valutare la capacità di LeX, un noto marcatore delle NSC, di arricchire le NSC. Questo grafico mostra la percentuale di neurosfere unipotenti, bipotenti e tripotenti generate da cellule positive a LeX e da cellule negative a LeX. Le cellule positive a LeX generano significativamente più neurosfere tripotenti rispetto alle cellule negative a LeX.

Questa tabella mostra che la frequenza delle cellule staminali neurali (NSC) delle cellule positive a LeX e negative a LeX è stata calcolata come prodotto tra NFU e la percentuale di neurosfere tripotenti. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come le neurosfere possano essere coltivate e differenziate in condizioni clonali per enumerare la frequenza delle cellule staminali neurali. Durante l'esecuzione di questo metodo, è importante utilizzare mezzi di crescita e di differenziazione appena preparati e una soluzione di rivestimento appena preparata per garantire condizioni ottimali di crescita e differenziazione per le neurosfere.

Una volta padroneggiato, questo metodo può essere eseguito in 13 giorni, un periodo più breve rispetto ai metodi attuali per enumerare la frequenza delle cellule staminali neurali. Questo metodo potrebbe essere utilizzato insieme ai metodi correnti, come il saggio di formazione di colonie neurali, per arricchire le cellule staminali più giovani e identificare un marcatore definitivo delle cellule staminali neurali.