Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni di cristalli di proteine di membrana in fase cubica lipidica per la raccolta di dati di cristallografia seriale presso sorgenti di sincrotrone e di laser a elettroni liberi a raggi X. Questo metodo dovrebbe aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale delle proteine di membrana, come il trasporto e la trasduzione del segnale attraverso la membrana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la determinazione della struttura di proteine di membrana nel loro ambiente lipidico nativo a temperatura ambiente, con un consumo minimo di campione e un danno radiativo trascurabile.

Le persone alle prime armi con questo metodo potranno incontrare difficoltà poiché la fase cubica lipidica è un materiale gelatinoso viscoso, difficile da manipolare senza strumenti specifici e un'esperienza pregressa. Iniziare questa procedura con la reidratazione delle proteine di membrana nella fase cubica lipidica, o LCP, utilizzando la siringa numero uno e la siringa numero due, come descritto nel protocollo testuale. Una volta formata una LCP trasparente ed omogenea, trasferire l'intero campione nella siringa numero due.

Scollegare la Siringa Numero Uno mantenendo il connettore collegato alla Siringa Numero Due. Collegare un ago rimovibile a un'altra siringa pulita da 100 microlitri, chiamata Siringa Numero Tre. Aspirare circa 70 microlitri della soluzione precipitante al suo interno.

Scollegare l'ago dalla Siringa Numero Tre mantenendo la sferetta in teflon all'interno della siringa. Collegare la Siringa Numero Due e la Siringa Numero Tre attraverso il raccordo, assicurandosi che le sferette in teflon siano correttamente posizionate in entrambe le siringhe. Avvitare con cura il raccordo fino a quando non è ben serrato.

Orientare le siringhe accoppiate verticalmente, con la Siringa Numero Due in basso, e iniettare lentamente e in modo costante il campione di LCP carico di proteina dalla Siringa Numero Due nella Siringa Numero Tre, fino a quando la stringa di LCP tocca lo stantuffo della Siringa Numero Tre. Il volume di LCP iniettato sarà pari a circa 1/10 del volume iniziale di precipitante presente nella Siringa Numero Tre. Verificare il volume mediante la lettura della scala su entrambe le siringhe.

Quindi, scollegare la Siringa Numero Due. L'accoppiatore è ora collegato solo alla Siringa Numero Tre, che contiene il campione immerso nella soluzione precipitante. Utilizzare il Parafilm per sigillare completamente la Siringa Numero Tre, inclusa l'interfaccia tra lo stantuffo e la siringa, l'estremità aperta dell'accoppiatore e il dado dell'ago.

Una sigillatura incompleta durante questo passaggio può provocare variazioni nelle condizioni del precipitante e la disidratazione del campione. Ripetere le operazioni di iniezione del campione LCP contenente la proteina per impostare la cristallizzazione in altre sei siringhe, utilizzando complessivamente circa 50 microlitri di campione LCP. Conservare le siringhe sigillate in un sacchetto di plastica richiudibile con uno o due fazzoletti privi di fibre, precedentemente inzuppati con acqua, per proteggere il campione dalla disidratazione.

Chiudere la busta e conservare le siringhe in un incubatore a 20 gradi Celsius durante la crescita dei cristalli. Per il rilevamento dei cristalli, rimuovere le siringhe dall'incubatore ed emettere i campioni di LCP direttamente all'interno delle siringhe ogni 12-24 ore, osservandoli al microscopio stereoscopico con luce polarizzata incrociata. Identificare i cristalli come particelle lucenti strettamente impacchettate oppure, nel caso di dimensioni cristalline più piccole, come un bagliore uniforme del filamento di LCP.

Riporre le siringhe sigillate nel sacchetto e conservare a 20 gradi Celsius per un uso futuro. Il passaggio di titolazione del lipide è necessario per assorbire l'eccesso di soluzione precipitante e per prevenire il congelamento del lipide durante l'iniezione nel fascio a raggi X a laser ad elettroni liberi. Circa un'ora prima dell'inizio della raccolta dati, rimuovere le siringhe contenenti i campioni dall'incubatrice a 20 gradi Celsius.

Selezionare da due a quattro siringhe per la consolidazione del campione in base all'aspetto simile dei cristalli e alla somiglianza delle condizioni di cristallizzazione. Rimuovere con attenzione il sigillo in Parafilm dalle siringhe selezionate. Rimuovere il raccordo per siringa e applicare un ago removibile pulito alla prima siringa selezionata.

Spingere delicatamente e lentamente lo stantuffo in avanti per espellere il precipitante attraverso l'ago in un tubo da microcentrifuga. Prestare attenzione in questo passaggio; applicare una pressione elevata sullo stantuffo può espellere insieme alla soluzione del precipitante anche parte del LCP contenente i cristalli, causando una perdita parziale o totale del campione. Fermare lo stantuffo quando la maggior parte del precipitante è stata rimossa e il LCP si è accumulato all'ingresso dell'ago.

Eseguire questo procedimento per le altre siringhe selezionate. Per consolidare i campioni di LCP risultanti, collegare due siringhe tra loro mediante un raccordo pulito. Premere lo stantuffo di una siringa per trasferire l'intero campione da una siringa all'altra.

Scollegare la siringa vuota. Ripetere questo passaggio per consolidare tutto il materiale LCP carico di cristalli in una singola siringa. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di precipitante.

Aggiungere circa cinque microlitri di 7.9 MAG o del lipide ospite MAG a catena più corta originale in una siringa vuota. Collegare questa siringa a quella contenente il campione consolidato tramite un connettore per siringhe e mescolare alternando la pressione sui pistoni delle siringhe. Ripetere l'operazione finché tutta la soluzione residua non è stata assorbita e si è formato un LCP omogeneo e trasparente.

Spostare l'intero campione LCP miscelato in una siringa e scollegare la siringa vuota. Applicare un ago per caricamento dell'injector LCP alla siringa contenente il campione consolidato. Espellere con attenzione circa un microlitro del campione LCP su un vetrino e coprirlo con un coprioggetto di vetro.

Premere delicatamente sul vetrino per schiacciare il campione. Acquisire immagini del campione LCP al microscopio stereoscopico con l'ingrandimento più elevato possibile, utilizzando un'illuminazione a campo chiaro e polarizzatori incrociati. Se possibile, acquisire ulteriori immagini utilizzando un microscopio e un sistema di acquisizione a fluorescenza UV per confermare la presenza di microcristalli proteici nel campione.

Stimare la dimensione e la densità dei cristalli. La densità ideale dei cristalli per un esperimento di raccolta dati dipenderà dalle dimensioni dei cristalli, dal diametro del fascio di raggi X e dal diametro del flusso di LCP, e dovrebbe produrre un tasso di impatto sui cristalli compreso tra il 10 e il 40%. Infine, caricare l'injectore LCP ed eseguire la cristallografia seriale a femtosecondi con LCP, o raccolta dati LCP SFX, come descritto nel protocollo testuale. Qui sono mostrati microcristalli del recettore della serotonina in complesso con ergotamina, acquisiti mediante microscopio in modalità campo chiaro e mediante microscopio in modalità luce polarizzata incrociata.

La struttura del complesso tra il recettore della serotonina e l'ergotamina è stata ottenuta mediante l'approccio LCP SFX. Qui vengono mostrati microcristalli del recettore smoothant in complesso con la ciclopamina, immaginati utilizzando una modalità di microscopio con luce incrociata polarizzata. La struttura del complesso tra il recettore e la ciclopamina è stata ottenuta mediante l'approccio LCP SFX.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in meno di due ore se eseguita correttamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura di proteine di membrana, con lievi modifiche può essere applicato anche ad altre proteine. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta di farmaci; infatti, strutture ad alta risoluzione forniscono ottimi modelli per le interazioni standard tra proteine lignanee e aiutano nella progettazione di farmaci più efficaci.