Name: Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Scopri la preparazione di microcristalli di proteine di membrana in fase cubica lipidica per cristallografia seriale. Questo metodo consente la determinazione strutturale a temperatura ambiente con consumo minimo di campione e danni da radiazione trascurabili.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health concede R01 GM108635 e U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Seed Collaborative di Grant Award e NSF STC premio 1231306. Ringraziamo A. Walker per l&#39;assistenza con la preparazione del manoscritto.

1. soluzioni di filtro e lipidi Nota: Tutti i reagenti e strumenti utilizzati in questo protocollo dovrebbe essere il più pulito possibile per evitare l&#39;introduzione di contaminanti di particolato nei campioni, che possono ostruire l&#39;iniettore LCP. <ol><li> Filtrare tutte le soluzioni precipitanti e lipidi fuso attraverso filtri spin-down 5 micron. siringhe Pulire accuratamente e applicare aria compressa per asciugare. Facoltativamente, utilizzare un cappuccio clean-room portatile per evitare di intrappolare particelle di polvere o fibre durante le procedure di preparazione del campione. </li></ol> 2. Ricostituzione di MP in LCP Nota: La scelta della migliore lipidi ospitante LCP per la cristallizzazione dipende dal target MP, ed è evidente durante lipidici ospitante studi di screening di cristallizzazione 14. Monoacilgliceroli (MAG) rappresentano la classe più comune di lipidi utilizzati per LCP cristallizzazione 15. I protocolli sono basati sull&#39;utilizzo 9.9 MAG (monoolein) comeospitare lipidi, poiché questo è il lipide maggior successo al meso cristallizzazione data 16. 9.9 MAG può essere sostituito da altri lipidi ospitanti LCP o miscele di lipidi dopo aver tenuto conto delle differenze nel loro comportamento di fase. Ad esempio, nel caso di GPCRs, monoolein è tipicamente drogato con colesterolo per la stabilizzazione del recettore. Qui, utilizzare 9: 1 (w / w) 9.9 MAG: miscela di colesterolo come lipidi ospite. <ol><li> Mix bersaglio MP, che viene purificato in soluzione detergente micellare, con l&#39;appropriato lipidi ospitante LCP utilizzando due siringhe (# 1 e # 2) e un accoppiatore, come descritto in precedenza 13. </li><li> Brevemente, carico siringa # 1 con il lipide fuso e la siringa # 2 con la soluzione MP. Utilizzare un rapporto tra lipidi e soluzione MP acquosa corrispondente al livello che è appena inferiore alla capacità di idratazione massimo corrispondente lipidi ospitante LCP, ad esempio, 3: 2 v / v lipidi / soluzione MP per 9,9 MAG, 1: 1 v / v soluzione / MP lipidico per la maggior parte degli altri MAG catena corta (7.9 MAG, 9.7 MAG, etc.). </li><li> Collegare le siringhe attraverso un accoppiatore siringa e iniziare la miscelazione delle sostanze premendo i pistoni per spostare la miscela avanti e indietro tra le siringhe, finché il campione diventa omogeneo e trasparente. Preparare circa 50 microlitri del campione LCP per la raccolta di un set di dati completo con LCP-SFX. Il volume del campione finale tipicamente aumento di circa un fattore due (a ~ 100 microlitri) dopo il consolidamento del campione e titolazione dei lipidi (punto 5). </li></ol> 3. Impostazione Cristallizzazione in siringhe <ol><li> Dopo un LCP trasparente ed omogenea si forma, spostare l&#39;intero campione nella siringa # 2. Staccare siringa # 1, mantenendo l&#39;accoppiatore collegato alla siringa # 2. </li><li> Collegare un ago rimovibile (26s calibro) per altri 100 ml siringa pulita (siringa # 3) e aspirare circa 70 ml di soluzione precipitante in esso. La composizione della soluzione precipitante che innesca formazione di microcristalli ad alta densità è unico per ogni bersaglio MP e deve essere determinato prima di procedere a questi protocolli. Qui, usare una composizione soluzione precipitante ottimizzato che produce una pioggia di microcristalli del recettore A 2A (40 mM di sodio tiocianato, 100 mM citrato di sodio a pH 5, 26-28% PEG400). </li><li> Scollegare l&#39;ago dalla siringa # 3 mantenendo la ferrula di Teflon all&#39;interno della siringa. </li><li> Collegare siringhe # 2 e # 3 attraverso l&#39;accoppiatore, facendo in modo che ghiere teflon corretto posizionamento in entrambe le siringhe. Avvitare bene l&#39;accoppiatore saldamente in posizione. </li><li> Orientare le siringhe accoppiati in verticale con la siringa # 2 sul fondo e iniettare il campione LCP proteina-carico dalla siringa # 2 nella siringa # 3 lentamente e costantemente fino a quando la corda LCP tocca lo stantuffo della siringa # 3. Il volume LCP iniettato ammonterà a circa 1/10 del volume iniziale precipitante in siringa # 3 (~ 7 ml). Verificare il volume dalla scala-lettura su entrambi i SyriNGES (entrambi i pistoni devono muoversi di circa il 7 ml). </li><li> Staccare la siringa # 2. L&#39;accoppiatore Ora è collegato solo alla siringa # 3 che contiene il campione immerso nella soluzione precipitante. </li><li> Utilizzare Parafilm per sigillare completamente la siringa # 3, inclusa l&#39;interfaccia dello stantuffo della siringa, la fine del copulante apertura e il dado ago. sigillatura incompleta durante questa fase può causare condizioni precipitanti per cambiare e il campione a disidratarsi. </li><li> Ripetere i passaggi 3,3-3,7 per impostare la cristallizzazione in 6 siringhe supplementari (# 4- # 9) utilizzando un totale di ~ 50 ml di campione LCP (~ 7 ml di LCP per ogni siringa). </li><li> Conservare sigillato siringhe in un sacchetto richiudibile di plastica con uno o due tessuti di pulizia libera di fibre pre-impregnati con acqua per la protezione contro la disidratazione del campione. Sigillare le siringhe borsa e conservare in un incubatore a 20 ° durante la crescita dei cristalli. </li></ol> 4. Individuazione di cristallo <ol><li> Rimuovere le siringhe dal termostato per l&#39;immagine del LCcampioni P direttamente all&#39;interno delle siringhe (# 3- # 9) ogni 12-24 ore allo stereomicroscopio con luce cross-polarizzata. Identificare cristalli come particelle lucide, serrato o, nel caso di dimensione dei cristalli più piccoli come un bagliore uniforme dal filamento LCP. </li><li> Riportare le siringhe sigillate alla borsa, e conservare a 20 ° C per un uso futuro. </li></ol> 5. Il consolidamento del campione e titolazione con 7,9 MAG Nota: Il passo dei lipidi di titolazione qui descritta serve a due scopi: a) per assorbire la soluzione precipitante in eccesso e b) per impedire il congelamento dei lipidi a seguito di iniezione nel fascio XFEL. Quando un campione di LCP composto 9.9 MAG viene iniettato in una camera a vuoto per la raccolta di dati, l&#39;evaporazione intensiva può raffreddare il campione fino a temperature inferiori alla temperatura di transizione di fase di equilibrio (~ 18 ° C), convertendo parti del campione in una fase cristallina lamellare (Lc). Queste patch di fase Lc, quando viene colpito dal fascio, producono intenso diffr in polvereanelli azione che possono danneggiare un rivelatore sensibile 6, come il rivelatore a serie di pixel Cornell-SLAC (CSPAD). Titolazione del 9,9 campione MAG con un lipide catena più corta (9,7 MAG o 7.9 MAG) allevia questo problema, come tali miscele hanno temperature di transizione fase inferiore. Qui, descriviamo la titolazione di un LCP composta da 9,9 MAG con un 7.9 MAG. Quando vengono utilizzati più corti MAG catena (9.7 MAG, 7.9 MAG, etc.) per cristallizzazione o quando i dati di cristallografia seriali sono raccolti a pressione ambiente è ancora necessaria la titolazione in fase 5.11, ma può essere eseguita utilizzando il lipide ospitante LCP originale impiegato per cristallizzazione. <ol><li> Circa 1 ora prima dell&#39;inizio della raccolta dei dati, rimuovere siringhe con campioni C incubatore 20 °. </li><li> Selezionare 2-4 siringhe per il consolidamento del campione sulla base di un aspetto di cristallo simile e somiglianza delle condizioni di cristallizzazione. </li><li> Rimuovere con attenzione il Parafilm tenuta dalle siringhe selezionati. </li><li> Rimuoverel&#39;accoppiatore siringa e inserire un ago rimovibile pulito (26s calibro) per la prima siringa selezionato. Delicatamente e lentamente spingere il pistone in avanti per spremere il precipitante attraverso l&#39;ago in una provetta. Esercizio cautela in questa fase, perché applicando una pressione sullo stantuffo in questa fase potrebbe estrarre alcuni dei cristalli LCP carico nonché la soluzione precipitante, portando ad una perdita parziale o completa del campione. </li><li> Arrestare il pistone quando la maggior parte del precipitante è stato rimosso e l&#39;LCP ha accumulato all&#39;ingresso dell&#39;ago. </li><li> Ripetere il passaggio 5,4-5,5 con le altre siringhe selezionati. </li><li> Per consolidare i campioni LCP risultanti, collegare due siringhe insieme attraverso un accoppiatore pulito. </li><li> Premere lo stantuffo su una siringa per trasferire l&#39;intero campione da una delle siringhe ad un altro. </li><li> Staccare la siringa vuota. </li><li> Ripetere i passaggi 5,7-5,9 per consolidare tutto il materiale cristallo LCP carico dal 2-4 presiringhe dell&#39;area selezionata in una siringa. Rimuovere il più possibile precipitante. </li><li> Aggiungere ~ 5 ml di 7,9 MAG o più corto originale a catena lipidica ospite MAG ad una siringa vuota. Collegare questo siringa alla siringa con il campione consolidato attraverso un accoppiatore siringa e miscelare premendo alternativamente stantuffi delle siringhe. Ripetere finché tutta la soluzione residua viene assorbita e si forma una LCP omogeneo e trasparente. L&#39;importo finale LCP dopo la titolazione può variare 20 a 35 microlitri seconda del volume del superamento precipitante e la sua composizione. </li><li> Spostare l&#39;intero campione LCP mescolato in una siringa e staccare la siringa vuota. </li></ol> 6. Caratterizzazione di microcristalli <ol><li> Collegare un carico ago LCP-iniettore (stile del punto 3, calibro 22, un pollice di lunghezza) alla siringa con il campione consolidato. </li><li> espellere attentamente ~ 1 ml di campione LCP su un vetrino e coprire con un vetrino di vetro. Premere delicatamente sullacopertura di slittamento al panino del campione. </li><li> Prendere immagini del campione LCP in un microscopio stereo al massimo ingrandimento possibile (tipicamente 100X) utilizzando un&#39;illuminazione campo chiaro e trasversali polarizzatori. Se possibile, prendere altre immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza ai raggi UV e un SONICC (Secondo Ordine non lineare Imaging di cristalli chirali) 17 imager per confermare l&#39;esistenza di microcristalli proteine ​​del campione. </li><li> Stimare dimensione dei cristalli e la densità 10. La densità cristallo ideale per un esperimento di raccolta dati dipenderà dalla dimensione dei cristalli, il diametro del fascio di raggi X ed il diametro della vena LCP, e dovrebbe tradursi in un tasso di successo di cristallo di circa il 10-40%. </li></ol> 7. Regolazione di cristallo Densità Nota: se la densità dei cristalli trovato nel passo 6.4 è troppo alto, con un conseguente grande percentuale di colpi multipli di cristallo, i cristalli devono essere diluiti seguendo la procedura descritta di seguito per ottimizzare lacampione per la raccolta dei dati. Se la densità dei cristalli è troppo bassa per la raccolta dati efficiente in tutti i campioni preparati, quindi le condizioni di crescita dei cristalli dovrebbero essere ri-ottimizzate, poiché non vi è alcun metodo affidabile per concentrare cristalli MP in LCP. <ol><li> Preparare la quantità necessaria di LCP pulito per essere utilizzato per la diluizione imitando la composizione LCP (stessa lipidico e precipitante) del campione originale con cristalli che deve essere diluito. </li><li> Spostare tutti LCP pulito in una siringa. Staccare siringa vuota, ma lasciare l&#39;accoppiatore collegato. </li><li> Rimuovere l&#39;ago dalla siringa contenente il campione LCP con microcristalli. Collegare la siringa campione alla siringa contenente LCP pulito attraverso l&#39;accoppiatore. </li><li> Mescolare il contenuto delle siringhe spingendolo avanti e indietro attraverso l&#39;accoppiatore fino ad ottenere omogeneità. </li><li> Ripetere Sezione 6 di rivalutare la densità di microcristalli nel campione rettificato. </li></ol> 8. LCP iniettore Caricamento unND LCP-SFX Raccolta dati <ol><li> Scollegare il connettore dalla siringa con il campione e inserire un ago 1 &quot;carico alla siringa. </li><li> Trasferire 20-40 microlitri del campione nel serbatoio di un iniettore LCP. </li><li> Inserire l&#39;iniettore LCP nella camera del campione 18, avviare l&#39;iniettore, regolare la portata e raccogliere dati LCP-SFX. </li></ol> 9. L&#39;incorporazione di solubile cristalli proteici in LCP Nota: L&#39;uso di supporti ad alta viscosità, come LCP, per la consegna di cristalli di proteine ​​solubili permette di diminuire drasticamente il consumo di proteine ​​in un esperimento cristallografia seriale. In questa procedura viene descritto come incorporare cristalli di proteine ​​solubili in LCP. I cristalli possono essere ottenuti con qualsiasi tecnica, consolidata insieme in forma di sospensione in cristallo e filtrata se necessario. <ol><li> Regolare la densità dei cristalli in sospensione al fine di garantire tassi di cristallo di successo di circa il 10-40%. </li><li> Test la compatibilità della soluzione precipitante con LCP utilizzando 7.9 MAG, 9,7 MAG o una miscela 1: 1 di 7.9 MAG e 9,9 MAG come lipidi ospite. </li><li> Mescolare ~ 25 microlitri della sospensione di cristallo con ~ 25 ml di lipidi host utilizzando un mixer siringa fino a quando si forma una LCP omogenee. </li><li> Valutare dimensione dei cristalli e la densità come descritto nella Sezione 6. Caricare il campione in dell&#39;iniettore LCP e raccogliere dati come descritto nella Sezione 8. </li></ol>

<ol><li>Cherezov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Chapman, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+X-ray+protein+nanocrystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Femtosecond X-ray protein nanocrystallography.</a> Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).</li>
<li>Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+biomolecular+imaging+with+femtosecond+X-ray+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses.</a> Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).</li>
<li>DePonte, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+dynamic+virtual+nozzle+for+generation+of+microscopic+droplet+streams%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+D+Appl+Phys%22%5BJournal%5D)">Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams.</a> J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505(2008).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Fenalti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+bifunctional+peptide+recognition+at+human+%CE%B4-opioid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Strcut+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor.</a> Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors.</a> Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Angiotensin+Receptor+Revealed+by+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography.</a> Cell. 161 (4), 833-844 (2015).</li>
<li>Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+microcrystals+in+lipidic+cubic+phase+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography.</a> Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+allosteric+regulation+of+GPCRs+by+sodium+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions.</a> Science. 337 (6091), 232-236 (2012).</li>
<li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li>
<li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li>
<li>Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Lipid+and+Temperature+as+Important+Screening+Variables+for+Crystallizing+Integral+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases.+Trials+with+Diacylglycerol+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cryst+Growth+Des%22%5BJournal%5D)">Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase.</a> Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).</li>
<li>Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCaffrey%2C+M+%22Current+Topics+in+Membranes%22">Current Topics in Membranes</a>. 63, Elsevier. (2009).</li>
<li>Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoolein%3A+a+magic+lipid%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Monoolein: a magic lipid?</a> Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).</li>
<li>James, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+D+%22Injection+Methods+and+Instrumentation+for+Serial+X-ray+Free+Electron+Laser+Experiments%22">Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments</a>. , Arizona State University. 1-126 (2015).</li>
<li>Kang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+rhodopsin+bound+to+arrestin+by+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).</li>
<li>Rasmussen, S. G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+%CE%B22+adrenergic+receptor-Gs+protein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex.</a> Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).</li>
<li>Fromme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography+of+soluble+proteins+in+lipidic+cubic+phase%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase.</a> IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).</li>
<li>Sugahara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grease+matrix+as+a+versatile+carrier+of+proteins+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography.</a> Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sct+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2, 168-176 (2015).</li>
<li>Tenboer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-resolved+serial+crystallography+captures+high-resolution+intermediates+of+photoactive+yellow+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein.</a> Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).</li>
<li>Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+time-resolved+crystallography+of+photosystem+II+using+a+femtosecond+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser.</a> Nature. 513, 261-265 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

I protocolli descritti qui forniscono un quadro generale della procedura di preparazione del campione per un esperimento standard di LCP-SFX con un iniettore LCP. Sulla base della nostra esperienza, la quantità totale del campione LCP microcrystal carichi finale richiesto per raccogliere un set di dati completo è tipicamente 50-100 microlitri (Tabella 1; 25-50 ml di campione iniziale LCP proteina-carico), a seconda delle dimensioni microcrystal , la qualità e la densità. Poiché ogni 100 microlitri siringa di vetro a tenuta di gas può ospitare circa 7 ml di LCP nella forma di una stringa completamente estesa per garantire la corretta e perfino diffusione della soluzione precipitante nella LCP, almeno quattro a sette campioni in siringhe devono essere preparati per ogni esperimento LCP-SFX. Poiché il campione viene estrusa attraverso una stretta 20-50 micron di diametro capillare, è fondamentale per evitare qualsiasi materiale particolato estraneo nel campione. Le polveri e fibre che potrebbero essere occasionalmente introdotti nel LCPsoluzioni campione o precipitanti possono intasare il capillare dell&#39;iniettore e aumentare il down-tempo durante l&#39;esperimento. Pertanto, è importante filtrare i lipidi e tutte le soluzioni attraverso un filtro pori 5 micron prima di preparare campioni. Facoltativamente, una camera pulita o cappuccio portatile stanza pulita può essere utilizzato per la preparazione del campione. Questi protocolli si basano sull&#39;utilizzo di 9.9 MAG (monoolein) come lipidi host per MP cristallizzazione. Essi, tuttavia, non sono limitati a 9,9 MAG e possono essere facilmente adattate ad altri lipidi ospitanti LCP o miscele lipidiche dopo aver tenuto conto delle differenze nel comportamento di fase lipidica. La maggior parte delle strutture di parlamentari cristallizzate in LCP sono stati ottenuti utilizzando una delle riviste, con 9,9 MAG essere il rappresentante di maggior successo finora 15. Lo svantaggio principale di utilizzare 9,9 MAG per SFX è il suo passaggio alla fase cristallina lamellare sul raffreddamento sotto i 18 ° C, che spesso si verifica quando l&#39;acquisizione dei dati viene eseguita nel vuoto. il titratiavanti con 7.9 MAG descritto nella Sezione 5 del presente protocollo prevede una buona soluzione a questo problema. Nella nostra esperienza, i cristalli resistono ad una tale titolazione senza effetti negativi. Se, tuttavia, l&#39;aggiunta di 7,9 MAG o un&#39;altra MAG catena corta non è auspicabile, la titolazione può essere eseguita con 9,9 MAG. In questo caso, il gas che stabilizza il flusso di LCP durante l&#39;iniezione nel vuoto deve essere commutato da elio azoto, che può impedire la formazione di una fase lipidica cristallina nella maggior parte dei campioni, a scapito di avere un flusso campione meno stabile. La consistenza gelatinosa di LCP ha un grande vantaggio per uso come supporto informatico cristallo, in quanto permette la regolazione della portata di cristallo in una vasta gamma, adatti per la raccolta cristallografia seriale moderni fonti XFEL e sincrotrone. Adattamento del flusso di cristallo con l&#39;impulso XFEL risultati dei tassi di ripetizione in drastica riduzione nel consumo di cristallo di ordini di grandezza compared a iniezione di liquido. LCP è un mezzo trasportatore adatto a conseguire non solo i cristalli MP coltivati ​​in esso, ma anche per i cristalli di proteine ​​solubili 21. Diversi supporti informatici cristallo viscosi alternativi sono stati recentemente introdotti 22 - 24, estendendo l&#39;arsenale di strumenti e reagenti per lo svolgimento di esperimenti di cristallografia seriali. Inoltre, la cristallografia seriale con LCP come mezzo di consegna cristallo è stata dimostrata con sincrotrone convenzionali, almeno per ben diffrazione cristalli 24,25. I futuri aggiornamenti delle fonti di sincrotrone che aumentano l&#39;intensità dei raggi X da ordini di grandezza, così come i miglioramenti nelle tecnologie del rivelatore, renderanno cristallografia seriale un metodo ancora più accessibile e attraente per la determinazione della struttura. LCP-SFX ha dimostrato la sua potenza per MP determinazione strutturale. Per i sistemi biologici impegnativi (come GPCR o complessi macromolecolari) dove Large, cristalli di diffrazione di qualità sono difficili da coltivare, LCP-SFX può fornire un attraente, se non l&#39;unica opzione, valida per risolvere una struttura risoluzione atomica. Con tutti i suoi vantaggi, vale a dire, usando LCP come matrice per MP cristallizzazione e la consegna di cristallo, un basso consumo di proteine, assenza di danni da radiazioni, camera di raccolta dei dati di temperatura, le possibilità di studi risolte nel tempo 26,27 e nessun requisito di cristallo di raccolta, LCP- SFX dovrebbe svolgere un ruolo importante nel futuro della biologia strutturale.

Cristallografia a raggi X è la tecnica di maggior successo fino ad oggi per risolvere le strutture atomiche risoluzione delle proteine ​​di membrana (MP). La cristallizzazione da mesophases lipidiche, noto anche come fase cubica lipidica (LCP), o in meso cristallizzazione, rappresenta uno dei più importanti sviluppi in MP cristallografia che ha permesso la determinazione della struttura ad alta risoluzione di obiettivi impegnativi come ad esempio G recettori accoppiati a proteine ​​(GPCR ) 1. Recenti progressi nella strumenti e le tecnologie LCP hanno fatto di questa tecnica a disposizione di una vasta comunità di biologi strutturali in tutto il mondo 2. Tuttavia, in molti casi i cristalli che si formano in MP LCP sono troppo piccole per essere utilizzato anche a più avanzata beamlines microfocus sincrotrone, dove i campioni soffrono di danni da radiazione gravi e deterioramento prima del segnale sufficiente ad alta risoluzione può essere ottenuta 3. Un nuovo approccio per la raccolta dei dati cristallograficaè stato abilitato con la messa in servizio del laser a elettroni liberi a raggi X prima (XFEL). Il metodo si basa sul principio della &quot;diffrazione prima della distruzione&quot;, introdotto teoricamente 4 e poi confermata sperimentalmente su campioni biologici durante il Linac Coherent Light Source (LCLs) 3, pioniere del mondo in XFELs duri. Un XFEL genera ad alta luminosità impulsi di raggi X all&#39;interno di poche decine di femtosecondi durata che diffract da un cristallo incontaminato prima che gli atomi della proteina possono muoversi in risposta a danni da radiazioni. Negli esperimenti iniziali, microcristalli stati continuamente forniti fino all&#39;intersezione con il fascio XFEL in una corrente acquosa prodotta da un iniettore liquido 5. Questo apparato sperimentale è conosciuta come la cristallografia a femtosecondi di serie (SFX). Il principale svantaggio nell&#39;utilizzo iniettori liquidi per SFX è la loro elevata portata, che richiede pertanto decine a centinaia di milligrammi di proteina purificata per la raccolta di un set di dati completo. Con employing un iniettore speciale in grado di gestire i campioni LCP gel-like (LCP microestrusione iniettore) 6, abbiamo consegnato con successo microcristalli di diversi GPCR umani diversi coltivate in una matrice LCP e ottenuto le loro strutture ad alta risoluzione 6 - 9, con una proteina significativamente ridotto il consumo a meno di 0,3 mg per set di dati. L&#39;iniettore è costituito da un serbatoio che può contenere fino a 20, 40 o 100 ml di LCP cristallo carichi ed un capillare stretto (10-50 micron di diametro) attraverso cui il campione viene estrusa mediante applicazione di alta pressione (fino a 10.000 psi) da un pistone idraulico con una fase di pressione amplificata, guidato da un liquido da una pompa HPLC (cromatografia liquida ad alta prestazione). Il flusso di LCP uscita dell&#39;ugello capillare viene stabilizzata da un flusso parallelo di gas non reattivo (tipicamente elio o azoto). Qui forniamo dimostrazioni visive dei passaggi necessari per preparare e caratterizzare i campioniper un esperimento LCP-SFX. Ulteriori dettagli possono essere trovati nei protocolli pubblicati 10. Come esempio, useremo adenosina Un recettore 2A 11 e preparare cristalli di questa proteina in LCP per la raccolta di dati a raggi X utilizzando approccio SFX. Mentre i nostri protocolli sono compatibili con qualsiasi iniettore in grado di streaming LCP per la raccolta dei dati da parte di cristallografia seriale fonti XFEL e sincrotrone, a scopo illustrativo, useremo l&#39;iniettore LCP descritto nella Ref. 6. condizioni precipitanti ottimizzate che producono microcristalli ad alta densità in LCP dovrebbero essere identificate da high-throughput screening cristallizzazione 12,13 prima di procedere con questo protocollo. Un diagramma di flusso tipico per questo protocollo è mostrato in Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Monooleina lipidica ospite LCP (9,9 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M239</td><td>Lipidi ospitanti per la proteina da cristallizzare</td></tr><tr><td>Monooleina lipidica ospite LCP (9,9 MAG)</td><td>Sigma</td><td>M7765&nbsp;</td><td>Ospitare lipidi per la proteina da cristallizzare</td></tr><tr><td>Lipidi dell'ospite LCP monopalmitoleina (9,7 MAG)</td><td>Nu Chek Prep</td><td>M219</td><td>Lipidi ospitanti per la proteina da cristallizzare</td></tr><tr><td>Lipidi ospiti LCP 7,9 MAG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850534</td><td>Lipidi ospitanti per la tiratura per evitare la formazione di fase cristallina lamellare (Lc) durante l'iniezione del campione</td></tr><tr><td>Soluzione proteica purificata concentrata a 20-50 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Proteina bersaglio</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606-1</td><td>Utilizzato per sciogliere i lipidi</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-500ML</td><td>Utilizzato per lavare le siringhe</td></tr><tr><td>Eleven 100 &#956; l Siringhe a tenuta di gas Hamilton senza aghi</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td>Per la preparazione LCP</td></tr><tr><td>Otto accoppiatori per siringhe</td><td>Formulatrix</td><td>SKU 209526</td><td>Per la preparazione LCP</td></tr><tr><td>Ago di caricamento dell'iniettore</td><td>LCP Hamilton</td><td>7804-01 Punto stile 3, lunghezza 1 pollice</td><td>Per l'erogazione LCP e il caricamento dell'iniettore</td></tr><tr><td>Ago rimovibile</td><td>Hamilton</td><td>7768-01</td><td>Per la rimozione della soluzione precipitante</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Utilizzato per la sigillatura di siringhe</td></tr><tr><td>Fazzoletti per la pulizia delle lenti senza lanugine</td><td>Fisher</td><td>NC9592151</td><td></td></tr><tr><td>Provette filtranti centrifughe, Ultrafree-MC, 0,5 ml, Durapore 5 & micro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC3 0SV 00</td><td>Utilizzato per la filtrazione di soluzioni precipitanti e lipidi</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio, 1 pollice x 3 pollici</td><td>GoldSeal</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Due flaconi di lavaggio con punte sottili. Uno riempito con milli-Q o acqua distillata, l'altro con metanolo</td><td>VWR</td><td>89094-640</td><td>Questi vengono utilizzati per pulire le siringhe, gli aghi e l'accoppiatore. Viene utilizzato prima il metanolo, poi l'acqua.</td></tr><tr><td>Guanti</td><td>Microflex</td><td>XC-310-L</td><td>Per l'asciugatura con soffiaggio, siringhe, aghi, ghiere e accoppiatori Occhiali</td></tr><tr><td>di</td><td></td><td></td><td></td>sicurezza</tr><tr><td>Bombolette d'aria pressurizzate Deposito</td><td>per ufficio (Dust-Off)</td><td>527494</td><td>Per la pulizia delle siringhe</td></tr><tr><td>Riscaldatore a blocco secco con regolatore di temperatura digitale</td><td>Fisher</td><td>11-720-10BQ&nbsp;</td><td>Utilizzato per lo scongelamento dei lipidi</td></tr><tr><td>Centrifuga da banco</td><td>Fisher</td><td>05-413-340</td><td>Soluzioni di filatura Camera</td></tr><tr><td>bianca Mini - Cappa portatile a pressione positiva da 12 pollici con filtro HEPA</td><td>Sentry Air Systems, Inc.</td><td>SS-112-PCR</td><td>Pulizia della preparazione del campione</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio zoom dotato di polarizzatore lineare e analizzatore rotante.</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Microscopio UV per il controllo della densità dei cristalli</td></tr><tr><td></td><td>JAN Scientific</td><td>UVEX-P</td><td>Opzionale, per l'imaging dei cristalli</td></tr><tr><td>Imager SHG</td><td>Formulatrix</td><td>SONICC</td><td>Opzionale, per l'imaging dei cristalli</td></tr></tbody></table>

preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per serial femtosecondi cristallografia

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Le proteine ​​di membrana (MP) sono componenti essenziali delle membrane cellulari e bersagli farmacologici primari. drug design razionale si basa su precise informazioni strutturali, tipicamente ottenuta mediante cristallografia; tuttavia i parlamentari sono difficili da cristallizzare. I recenti progressi nella MP determinazione strutturale ha beneficiato ampiamente lo sviluppo di metodi lipidiche fase cubica (LCP) di cristallizzazione, che in genere producono ben diffrazione, ma spesso piccoli cristalli che soffrono di danni da radiazioni durante la raccolta tradizionale dei dati cristallografica a fonti di sincrotrone. Lo sviluppo di laser a elettroni liberi a raggi X di nuova generazione (XFEL) fonti che producono impulsi a femtosecondi molto luminosi ha permesso camera di raccolta dati di temperatura da microcristalli con nessuna o danni da radiazioni trascurabile. I nostri recenti sforzi di combinare la tecnologia LCP con seriale cristallografia a femtosecondi (LCP-SFX) hanno portato a strutture ad alta risoluzione di diversi G recettori accoppiati alla proteina umana, which rappresentare un bersaglio notoriamente difficile per la determinazione della struttura. Nella tecnica LCP-SFX, LCP viene reclutato come matrice per la crescita e la consegna di microcristalli MP all&#39;intersezione del torrente iniettore con un fascio XFEL per la raccolta dati cristallografica. È stato dimostrato che LCP-SFX può migliorare sostanzialmente la risoluzione di diffrazione quando solo sotto-10 micron cristalli sono disponibili, o quando l&#39;uso dei cristalli più piccoli a temperatura ambiente può superare vari problemi connessi con cristalli cryocooled più grandi, come l&#39;accumulo di difetti, alta mosaicity e artefatti cryocooling. progressi futuri in sorgenti di raggi X e le tecnologie rivelatore deve fare cristallografia di serie molto interessante e praticabile per l&#39;attuazione non solo a XFELs, ma anche a linee di luce di sincrotrone più accessibili. Qui vi presentiamo protocolli visive dettagliate per la preparazione, la caratterizzazione e la consegna di microcristalli in LCP per esperimenti di cristallografia seriali.Questi protocolli includono metodi per condurre esperimenti di cristallizzazione in siringhe, rilevare e caratterizzare i campioni cristallo, ottimizzando la densità di cristallo, caricando microcrystal LCP carico nel dispositivo iniettore ed erogare il campione alla trave per la raccolta dei dati.

Qui di seguito vengono descritti i risultati rappresentativi ottenuti con campioni preparati seguendo i protocolli di cui sopra, che ci ha permesso di raccogliere i dati di SFX e risolvere le strutture ad alta risoluzione di cinque GPCR umani: recettore della serotonina 5-HT 2B in complesso con un ergotamina agonisti 8 (PDB ID 4NC3 ), il recettore sfumate (SMO) in complesso con un ciclopamina antagonista 6 (PDB ID 4O9R), il recettore δ-oppioide in complesso con un bi-funzionale peptide ligando DIPP-NH 2 7 (PDB ID 4RWD), del recettore dell&#39;angiotensina in complesso con un bloccante ZD7155 9 (PDB ID 4YAY), e un complesso tra rodopsina e arrestina 19 (PDB ID 4ZWJ); e due test di proteine ​​solubili: lisozima (PDB ID 4ZIX) e phycocyanin (PDB ID 4ZIZ). 5-HT 2B media varie funzioni centrali e periferiche fisiologiche del neurotrasmettitore serotonina. Questo recettoreè stato utilizzato per stabilire e convalidare il metodo di LCP-SFX, confrontando la struttura temperatura ambiente ottenuto al LCLs con la struttura cryocooled risolto da microcristallografia tradizionale alla Advanced Photon Source (APS). Un totale di ~ 100 l campione LCP con microcristalli di proteine ​​(dimensione media di circa 5 micron) è stato preparato e utilizzato per la raccolta dei dati SFX, e la struttura LCP-SFX di 5HT 2B è stato risolto con successo a 2,8 A (Figura 2) 8. Ulteriori dettagli utili sulla preparazione del campione e la raccolta dei dati sono forniti nella tabella 1. recettore Smoothened (SMO) è un membro della classe F GPCR e il target molecolare del ciclopamina teratogeno, con funzioni ben dimostrato, nello sviluppo embrionale e la crescita del tumore. Inizialmente, relativamente grandi cristalli di SMO / cyclopamine con una dimensione media di 120 × 10 × 5 micron sono stati ottenuti e utilizzati per collecti datisu ad una sorgente di sincrotrone utilizzando convenzionale cristallografia goniometro-based. Tuttavia, queste grandi cristalli prodotti poveri di diffrazione ad un micro-focus linea di luce (10 micron di diametro) affette grande mosaicity (sopra 2-3 gradi), probabilmente dovuto all&#39;accumulo di difetti di crescita dei cristalli, o da effetti legati cryocooling. LCP-SFX, però, ci ha permesso di raccogliere i dati di diffrazione di qualità a LCLs da 5 micron cristalli di dimensioni a temperatura ambiente. La struttura è stata risolta mediante sostituzione molecolare ad un anisotropo 3.4, 3.2 e 4.0 Å risoluzione lungo i tre assi principali, nell&#39;individuare la posizione del cyclopamine nel legame della tasca 6 (figura 3). oppiacei alcaloide, come la morfina, di targeting del recettore μ-oppioidi (μ-OR) sono ampiamente utilizzati per la gestione del dolore severo. Tuttavia, il loro uso estensivo porta alla tolleranza acquisita e dipendenza. La co-somministrazione di morfinecon recettori δ-oppiacei (δ-OR) antagonisti ha dimostrato di prevenire gli effetti collaterali di cui sopra, promuovendo così la ricerca di composti con una funzione di δ-O-antagonisti e μ-O-agonisti misti. Abbiamo ottenuto i primi dati di diffrazione sulla δ-O in un complesso con un bi-funzionale tetra-peptide DIPP-NH 2 utilizzando cristalli cryocooled che diffratti al 3,3 A a una sorgente di raggi X di sincrotrone impiegando convenzionale strategia di raccolta dei dati goniometro-based. Questi dati hanno rivelato una densità di elettroni in parte ambiguo per il ligando peptide. Successivamente, i dati XFEL diffrazione a temperatura ambiente sono stati ottenuti e la struttura è stato determinato in 2,7 risoluzione A che mostra una densità chiaro per il ligando e recettore 7. Tale struttura ha offerto l&#39;occasione per una maggiore comprensione funzione del recettore degli oppioidi e la selettività e ha fornito preziose informazioni per lo sviluppo di nuovi analgesici. (AT1 R) è un GPCR serve come regolatore primaria della pressione sanguigna. Abbiamo la cristallizzazione per 1 R in complesso con un antagonista ZD7155 in LCP. Cristalli ottimizzate raggiunto una dimensione massima di 40 × 4 × 4 micron 3 alla miglior diffrazione raggiungendo solo ~ 4 Å a una sorgente di sincrotrone. Cambiando condizioni di cristallizzazione, abbiamo ottenuto una pioggia di cristalli più piccoli (10 × 2 × 2 micron 3), che sono stati utilizzati per ottenere la struttura temperatura ambiente a 2,9 risoluzione A utilizzando la radiazione XFEL. Un totale di 2,764,739 detector immagini sono state raccolte per fare un set di dati completo da circa 65 ml di cristallo carichi LCP pari a circa 0,29 mg di proteine ​​9. Del numero totale di fotogrammi, 457.275 sono stati identificati come colpi di cristallo, che corrisponde ad un tasso di successo del 17%, di cui 73,130 fotogrammi (16% di successi) sono stati indicizzati e integrati con successo. solPCR segnale attraverso due vie principali mediate da entrambi le proteine ​​G o arrestine. La struttura del β 2 del recettore adrenergico legato a proteine ​​G un eterotrimerico s è stato risolto a pochi anni fa 20, mentre la struttura di un GPCR in complesso con arrestin era rimasta inafferrabile. Abbiamo ottenuto piccoli cristalli di rodopsina-arrestin proteina di fusione in LCP che ha raggiunto 25-30 micron di dimensione più lunga, ma nonostante vasta ottimizzazione, diffratta solo per ~ risoluzione 7 A a fonti di sincrotrone. Utilizzando il metodo LCP-SFX, entro 12 ore di tempo macchina XFEL, abbiamo raccolto 22,262 colpi di cristallo, di cui 18,874 modelli sono stati indicizzati e integrati per anisotropi limiti di risoluzione di 3.8 Å / 3,8 A / 3,3 A 19 con successo. Rodopsina-arrestina è un complesso proteico molto impegnativo che ha resistito determinazione della struttura utilizzando approcci tradizionali. La determinazione di successo di tale struttura ha dimostrato l&#39;enorme potenziale diil metodo LCP-SFX per affrontare problemi difficili e ha fornito un&#39;opportunità unica per esaminare il meccanismo di segnalazione arrestina-sbilanciata in GPCR. Infine, oltre alla membrana cristalli di proteine ​​prodotte nella fase lipidica, la preparazione del campione e metodo di consegna è stato adattato con successo per cristalli di proteine ​​solubili, dove LCP viene utilizzato come mezzo vettore per la consegna dei cristalli, ci permette di ridurre drasticamente il consumo di proteine richiesto per la determinazione della struttura. Strutture di due proteine ​​modello, lisozima e phycocyanin, sono stati risolti a 1,89 Å e 1,75 risoluzione Å rispettivamente con questo metodo, utilizzando meno di 0,1 mg di ogni proteina 21. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Serotonina recettore 2B </td><td> recettore spianata </td><td><strong&gt; Δ-oppioidi recettore </td><td> L&#39;angiotensina II recettore di tipo 1 </td><td> Rodopsina-arrestina </td><td> lisozima </td><td> ficocianina </td></tr><tr><td> PDB ID </td><td> 4NC3 </td><td> 4O9R </td><td> 4RWD </td><td> 4YAY </td><td> 4ZWJ </td><td> 4ZIX </td><td> 4ZIZ </td></tr><tr><td> Totale campione utilizzato *, ul </td><td> 100 </td><td> 83 </td><td> 50 </td><td> 65 </td><td> 75 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proteine ​​totali utilizzati, ug </td><td> 300 </td><td> 500 </td><td> 300 </td><td> 290 </td><td> 340 </td><td> 100 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> Dimensione media di cristallo, micron </td><td> 5 × 5 × 5 </td><td> &lt;5 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 2 × 2 </td><td> 5-10 </td><td> 5 × 2 × 2 </td><td> 10 × 10 × 5 </td></tr><tr><td> Tasso di successo, % </td><td>3.6 </td><td> 7.8 </td><td> 5.9 </td><td> 17 </td><td> 0.45 </td><td> 40 </td><td> 6.5 </td></tr><tr><td> Tempo totale di raccolta dei dati, hr </td><td> 10 </td><td> 8 </td><td> 4.6 </td><td> 6.4 </td><td> 12 </td><td> 0.75 </td><td> 0.67 </td></tr><tr><td> Numero di modelli indicizzati </td><td> 32.819 </td><td> 61.964 </td><td> 36.083 </td><td> 73.130 </td><td> 18.874 </td><td> 54.544 </td><td> 6.629 </td></tr><tr><td> gruppo spaziale </td><td> C 2 2 2 1 </td><td> P 2 1 </td><td> C 2 </td><td> C 2 </td><td> P 2 1 2 1 2 1 </td><td> P 4 3 2 1 2 </td><td> H 3 2 </td></tr><tr><td> Risoluzione, Å </td><td> 2.8 </td><td> 3.2 / 3.4 / 4.0 </td><td> 2.7 </td><td> 2.9 </td><td> 3.3 / 3.8 / 3.8 </td><td> 1.89 </td><td> 1.75 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Sintesi delle statistiche di preparazione del campione e la raccolta di dati per le strutture rappresentative risolto utilizzando il metodo del LCP-SFX. La quantità di campione necessaria per un esperimento LCP-SFX dipende cristallo qualità di diffrazione, densità dei cristalli, il diametro dell&#39;ugello dell&#39;iniettore, così come la frequenza di ripetizione dimensione del fascio XFEL, intensità e polso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig1.jpg" /> Figura 1. Diagramma di flusso di una tipica procedura di preparazione del campione per la preparazione del campione LCP-SFX. Comincia con LCP cristallizzazione della proteina bersaglio in siringhe di vetro a tenuta di gas. Dopo i cristalli si ottengono, il LCP cristallo-carico è consolidato in una siringa e titolato con lipidi aggiuntivo, per Assorbimento ab la soluzione precipitante in eccesso. I cristalli sono poi caratterizzati utilizzando vari metodi di microscopia precedenti la raccolta dei dati XFEL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig2.jpg" /> Figura 2. Un risultato rappresentativo, la struttura di 5-HT 2B in complesso con ergotamina. (a) Microcristalli di 5-HT 2B / ergotamina ripreso con una modalità di microscopio a campo chiaro 8. Questo dato è stato riutilizzato da riferimento 8 con il permesso di copyright da Science. (B) microcristalli di 5-HT 2B / ergotamina ripreso utilizzando una modalità cross-polarizzato microscopio 8. Questo dato è stato riutilizzato da riferimento 8 con diritto d&#39;autoreil permesso da Science. (c) Una rappresentazione cartone animato della 2B struttura di 5-HT / ergotamina ottenuto dall&#39;approccio LCP-SFX. I lipidi che sono state costruite nel modello sono riportati nella rappresentazione bastone. L&#39;ergotamina ligando è mostrato nella rappresentazione sfere. Le linee continue indicano i confini della membrana approssimativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54463/54463fig3.jpg" /> Figura 3. Un risultato rappresentativo, la struttura di SMO in complesso con ciclopamina. Pannello sinistro, microcristalli di SMO / ciclopamina ripreso utilizzando una modalità microscopio cross-polarizzato 6. Questo dato è stato riutilizzato da riferimento 6 con il permesso di copyright da Nature Communications. Pannello di destra, un cartone animato representatisulla struttura SMO / ciclopamina ottenuto dall&#39;approccio LCP-SFX. ciclopamina Ligand è mostrato nella rappresentazione sfere. Le linee continue indicano i confini della membrana approssimativi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54463/54463fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Descriviamo le procedure per la preparazione e la consegna di microcristalli proteici di membrana in fase cubica lipidica per la cristallografia seriale su laser a elettroni liberi a raggi X e sorgenti di sincrotrone. Questi protocolli possono essere applicati anche per l'incorporazione e la somministrazione di microcristalli proteici solubili, con conseguente riduzione sostanziale del consumo di campione rispetto all'iniezione di liquidi.

Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare campioni di cristalli di proteine di membrana in fase cubica lipidica per la raccolta di dati di cristallografia seriale presso sorgenti di sincrotrone e di laser a elettroni liberi a raggi X. Questo metodo dovrebbe aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia strutturale delle proteine di membrana, come il trasporto e la trasduzione del segnale attraverso la membrana. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la determinazione della struttura di proteine di membrana nel loro ambiente lipidico nativo a temperatura ambiente, con un consumo minimo di campione e un danno radiativo trascurabile.Le persone alle prime armi con questo metodo potranno incontrare difficoltà poiché la fase cubica lipidica è un materiale gelatinoso viscoso, difficile da manipolare senza strumenti specifici e un'esperienza pregressa. Iniziare questa procedura con la reidratazione delle proteine di membrana nella fase cubica lipidica, o LCP, utilizzando la siringa numero uno e la siringa numero due, come descritto nel protocollo testuale. Una volta formata una LCP trasparente ed omogenea, trasferire l'intero campione nella siringa numero due.Scollegare la Siringa Numero Uno mantenendo il connettore collegato alla Siringa Numero Due. Collegare un ago rimovibile a un'altra siringa pulita da 100 microlitri, chiamata Siringa Numero Tre. Aspirare circa 70 microlitri della soluzione precipitante al suo interno.Scollegare l'ago dalla Siringa Numero Tre mantenendo la sferetta in teflon all'interno della siringa. Collegare la Siringa Numero Due e la Siringa Numero Tre attraverso il raccordo, assicurandosi che le sferette in teflon siano correttamente posizionate in entrambe le siringhe. Avvitare con cura il raccordo fino a quando non è ben serrato.Orientare le siringhe accoppiate verticalmente, con la Siringa Numero Due in basso, e iniettare lentamente e in modo costante il campione di LCP carico di proteina dalla Siringa Numero Due nella Siringa Numero Tre, fino a quando la stringa di LCP tocca lo stantuffo della Siringa Numero Tre. Il volume di LCP iniettato sarà pari a circa 1/10 del volume iniziale di precipitante presente nella Siringa Numero Tre. Verificare il volume mediante la lettura della scala su entrambe le siringhe.Quindi, scollegare la Siringa Numero Due. L'accoppiatore è ora collegato solo alla Siringa Numero Tre, che contiene il campione immerso nella soluzione precipitante. Utilizzare il Parafilm per sigillare completamente la Siringa Numero Tre, inclusa l'interfaccia tra lo stantuffo e la siringa, l'estremità aperta dell'accoppiatore e il dado dell'ago.Una sigillatura incompleta durante questo passaggio può provocare variazioni nelle condizioni del precipitante e la disidratazione del campione. Ripetere le operazioni di iniezione del campione LCP contenente la proteina per impostare la cristallizzazione in altre sei siringhe, utilizzando complessivamente circa 50 microlitri di campione LCP. Conservare le siringhe sigillate in un sacchetto di plastica richiudibile con uno o due fazzoletti privi di fibre, precedentemente inzuppati con acqua, per proteggere il campione dalla disidratazione.Chiudere la busta e conservare le siringhe in un incubatore a 20 gradi Celsius durante la crescita dei cristalli. Per il rilevamento dei cristalli, rimuovere le siringhe dall'incubatore ed emettere i campioni di LCP direttamente all'interno delle siringhe ogni 12-24 ore, osservandoli al microscopio stereoscopico con luce polarizzata incrociata. Identificare i cristalli come particelle lucenti strettamente impacchettate oppure, nel caso di dimensioni cristalline più piccole, come un bagliore uniforme del filamento di LCP.Riporre le siringhe sigillate nel sacchetto e conservare a 20 gradi Celsius per un uso futuro. Il passaggio di titolazione del lipide è necessario per assorbire l'eccesso di soluzione precipitante e per prevenire il congelamento del lipide durante l'iniezione nel fascio a raggi X a laser ad elettroni liberi. Circa un'ora prima dell'inizio della raccolta dati, rimuovere le siringhe contenenti i campioni dall'incubatrice a 20 gradi Celsius.Selezionare da due a quattro siringhe per la consolidazione del campione in base all'aspetto simile dei cristalli e alla somiglianza delle condizioni di cristallizzazione. Rimuovere con attenzione il sigillo in Parafilm dalle siringhe selezionate. Rimuovere il raccordo per siringa e applicare un ago removibile pulito alla prima siringa selezionata.Spingere delicatamente e lentamente lo stantuffo in avanti per espellere il precipitante attraverso l'ago in un tubo da microcentrifuga. Prestare attenzione in questo passaggio; applicare una pressione elevata sullo stantuffo può espellere insieme alla soluzione del precipitante anche parte del LCP contenente i cristalli, causando una perdita parziale o totale del campione. Fermare lo stantuffo quando la maggior parte del precipitante è stata rimossa e il LCP si è accumulato all'ingresso dell'ago.Eseguire questo procedimento per le altre siringhe selezionate. Per consolidare i campioni di LCP risultanti, collegare due siringhe tra loro mediante un raccordo pulito. Premere lo stantuffo di una siringa per trasferire l'intero campione da una siringa all'altra.Scollegare la siringa vuota. Ripetere questo passaggio per consolidare tutto il materiale LCP carico di cristalli in una singola siringa. Rimuovere il maggior quantitativo possibile di precipitante.Aggiungere circa cinque microlitri di 7.9 MAG o del lipide ospite MAG a catena più corta originale in una siringa vuota. Collegare questa siringa a quella contenente il campione consolidato tramite un connettore per siringhe e mescolare alternando la pressione sui pistoni delle siringhe. Ripetere l'operazione finché tutta la soluzione residua non è stata assorbita e si è formato un LCP omogeneo e trasparente.Spostare l'intero campione LCP miscelato in una siringa e scollegare la siringa vuota. Applicare un ago per caricamento dell'injector LCP alla siringa contenente il campione consolidato. Espellere con attenzione circa un microlitro del campione LCP su un vetrino e coprirlo con un coprioggetto di vetro.Premere delicatamente sul vetrino per schiacciare il campione. Acquisire immagini del campione LCP al microscopio stereoscopico con l'ingrandimento più elevato possibile, utilizzando un'illuminazione a campo chiaro e polarizzatori incrociati. Se possibile, acquisire ulteriori immagini utilizzando un microscopio e un sistema di acquisizione a fluorescenza UV per confermare la presenza di microcristalli proteici nel campione.Stimare la dimensione e la densità dei cristalli. La densità ideale dei cristalli per un esperimento di raccolta dati dipenderà dalle dimensioni dei cristalli, dal diametro del fascio di raggi X e dal diametro del flusso di LCP, e dovrebbe produrre un tasso di impatto sui cristalli compreso tra il 10 e il 40%. Infine, caricare l'injectore LCP ed eseguire la cristallografia seriale a femtosecondi con LCP, o raccolta dati LCP SFX, come descritto nel protocollo testuale. Qui sono mostrati microcristalli del recettore della serotonina in complesso con ergotamina, acquisiti mediante microscopio in modalità campo chiaro e mediante microscopio in modalità luce polarizzata incrociata.La struttura del complesso tra il recettore della serotonina e l'ergotamina è stata ottenuta mediante l'approccio LCP SFX. Qui vengono mostrati microcristalli del recettore smoothant in complesso con la ciclopamina, immaginati utilizzando una modalità di microscopio con luce incrociata polarizzata. La struttura del complesso tra il recettore e la ciclopamina è stata ottenuta mediante l'approccio LCP SFX.Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in meno di due ore se eseguita correttamente. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura di proteine di membrana, con lievi modifiche può essere applicato anche ad altre proteine. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla scoperta di farmaci; infatti, strutture ad alta risoluzione forniscono ottimi modelli per le interazioni standard tra proteine lignanee e aiutano nella progettazione di farmaci più efficaci.

preparation-delivery-protein-microcrystals-lipidic-cubic-phase-for

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimica

Qui è descritta la procedura implementata nel gruppo membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale per impostare manualmente le prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesophases lipidico.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

I protocolli di descrivere le fasi essenziali per ottenere cristalli di diffrazione qualità di una proteina di membrana a partire dalla ricostituzione della proteina in una fase lipidica cubi (LCP), trovando condizioni iniziali con LCP-FRAP pre-cristallizzazione analisi, la creazione di processi di cristallizzazione LCP e cristalli di raccolta .

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

Viene presentato un protocollo per la cristallografia a raggi X utilizzando microcristalli di proteine. Sono stati confrontati due esempi che analizzano microcristalli in vivo dopo la purificazione o in cellulo .

Microcristallografia dei cristalli proteici e<em&gt; In Cellulo</em&gt; Diffrazione

Qui presentiamo un protocollo per la produzione controllata di microcristalli di proteina. Il processo utilizza un dispositivo automatico che permette la manipolazione controllata di diversi parametri di cristallizzazione. La cristallizzazione della proteina avviene mediante aggiunta automatizzata e controllata di soluzioni di cristallizzazione durante il monitoraggio e indagare la distribuzione di raggio delle particelle nella gocciolina di cristallizzazione.

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

Il successo di un esperimento di cristallografia risolti in tempo ai femtosecondi seriale dipende dalla consegna efficiente dei campioni. Qui, descriviamo protocolli per ottimizzare l'estrusione di microcristalli bacteriorhodopsin da un iniettore di micro-estrusione ad alta viscosità. La metodologia si basa sull'omogeneizzazione del campione con un romanzo accoppiatore di tre vie e la visualizzazione con una telecamera ad alta velocità.

Miglioramento di estrusione ad alta viscosità di microcristalli per Time-resolved Serial Femtosecond cristallografia a raggi x laser

L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare come preparare campioni di cristallografia seriale per la raccolta dei dati su un iniettore ad alto viscoso, Lipidico, recentemente commissionato al sincrotrone australiano.

Protocollo di iniezione lipidico per le misurazioni della cristallografia seriale presso il sincrotrone australiano

Lo scopo di questo articolo è quello di dare allo spettatore una solida comprensione di come trasformare il loro protocollo di diffusione del vapore di piccoli volumi, per la crescita di grandi cristalli proteici singoli, in un metodo di microcristallizzazione batch di grandi volumi per la cristallografia seriale.

Ottimizzazione della crescita dei cristalli di endotiapepsina per esperimenti di cristallografia seriale

Il protocollo presentato descrive un approccio semplice per lo screening delle condizioni di cristallizzazione delle proteine e la crescita dei cristalli utilizzando una piastra di dialisi ad alto rendimento a 96 pozzetti. L'uso di tubi dializzatori per la crescita su larga scala di microcristalli è dimostrato anche per la cristallografia seriale e le applicazioni MicroED.

Cristallizzazione delle proteine ad alto rendimento tramite microdialisi

Questo protocollo descrive una configurazione per la cristallizzazione del trasportatore di steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 viene ricostituito in bicelle per la cristallizzazione a goccia sospesa. Il protocollo non richiede materiali o substrati specializzati, il che lo rende accessibile e facile da adattare in qualsiasi laboratorio per determinare la struttura della proteina attraverso la cristallografia a raggi X.

Cristallizzazione ABCG5/G8 in ambiente bicellare lipidico per cristallografia a raggi X

Scopri la preparazione di microcristalli di proteine di membrana in fase cubica lipidica per cristallografia seriale. Questo metodo consente la determinazione strutturale a temperatura ambiente con consumo minimo di campione e danni da radiazione trascurabili.

Preparazione e consegna di microcristalli proteina nella fase cubica lipidica per Serial femtosecondi Cristallografia

Esplora altri video