Name: -High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri la piattaforma di criohistologia ad alto rendimento per l'analisi di tessuti mineralizzati. Questo metodo automatizzato consente l'imaging multiplo su vetrini seriali, riducendo la variabilità e migliorando l'efficienza per i biologi muscoloscheletrici.

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Gli autori desiderano riconoscere le seguenti fonti di finanziamento: NIH R01-AR063702, R21-AR064941, K99-AR067283 e T90-DE021989.

<ol><li>Schofield, P. N., Vogel, P., Gkoutos, G. V., Sundberg, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+elephant%3A+histopathology+in+high-throughput+phenotyping+of+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Exploring the elephant: histopathology in high-throughput phenotyping of mutant mice.</a> Dis Model Mech. 5 (1), 19-25 (2012).</li>
<li>Adissu, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+reveals+correlative+and+unique+phenotypes+in+a+high-throughput+mouse+phenotyping+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+and+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Histopathology reveals correlative and unique phenotypes in a high-throughput mouse phenotyping screen.</a> Disease Models and Mechanisms. 7 (5), 515-524 (2014).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Ayadi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+large-scale+phenotyping+initiatives%3A+overview+of+the+European+Mouse+Disease+Clinic+%28EUMODIC%29+and+of+the+Wellcome+Trust+Sanger+Institute+Mouse+Genetics+Project%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.Genome%22%5BJournal%5D)">Mouse large-scale phenotyping initiatives: overview of the European Mouse Disease Clinic (EUMODIC) and of the Wellcome Trust Sanger Institute Mouse Genetics Project.</a> Mamm.Genome. 23 (9-10), 600-610 (2012).</li>
<li>Utreja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+matrix+response+of+temporomandibular+cartilage+to+mechanical+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthr+Cartil%22%5BJournal%5D)">Cell and matrix response of temporomandibular cartilage to mechanical loading.</a> Osteoarthr Cartil. 24 (2), 335-344 (2016).</li>
<li>Dyment, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gdf5+progenitors+give+rise+to+fibrocartilage+cells+that+mineralize+via+hedgehog+signaling+to+form+the+zonal+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.Biol%22%5BJournal%5D)">Gdf5 progenitors give rise to fibrocartilage cells that mineralize via hedgehog signaling to form the zonal enthesis.</a> Dev.Biol. 405 (1), 96-107 (2015).</li>
<li>Lalley, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+biomechanical+and+biological+outcomes+in+the+MRL%2FMpJ+murine+strain+following+a+full-length+patellar+tendon+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury.</a> J.Orthop.Res. 33 (11), 1693-1703 (2015).</li>
<li>Breidenbach, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablating+hedgehog+signaling+in+tenocytes+during+development+impairs+biomechanics+and+matrix+organization+of+the+adult+murine+patellar+tendon+enthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Ablating hedgehog signaling in tenocytes during development impairs biomechanics and matrix organization of the adult murine patellar tendon enthesis.</a> J.Orthop.Res. 33 (8), 1142-1151 (2015).</li>
<li>Ushiku, C., Adams, D., Jiang, X., Wang, L., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+Bone+Fracture+Repair+in+Mice+Harboring+GFP+Reporters+for+Cells+within+the+Osteoblastic+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Long Bone Fracture Repair in Mice Harboring GFP Reporters for Cells within the Osteoblastic Lineage.</a> J.Orthop.Res. 28 (10), 1338-1347 (2010).</li>
<li>Matthews, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+asMA-labeled+progenitor+cell+commitment+identifies+notch+signaling+as+an+important+pathway+in+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Bone+Miner.Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of asMA-labeled progenitor cell commitment identifies notch signaling as an important pathway in fracture healing.</a> J.Bone Miner.Res. 29 (5), 1283-1294 (2014).</li>
<li>Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Jiang, X., Huang, J., Adams, D. J., Rowe, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+knee+fibrocartilage+to+joint+destabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Response of knee fibrocartilage to joint destabilization.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (6), 996-1006 (2015).</li>
<li>Grcevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fate+mapping+identifies+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo fate mapping identifies mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells. 30 (2), 187-196 (2012).</li>
<li>Hong, S. H., Jiang, X., Chen, L., Josh, P., Shin, D. G., Rowe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Automated+Static%2C+Dynamic+and+Cellular+Bone+Histomorphometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Computer-Automated Static, Dynamic and Cellular Bone Histomorphometry.</a> J Tissue Sci Eng. Suppl 1, 004(2012).</li>
<li>Matthews, B. G., Torreggiani, E., Roeder, E., Matic, I., Grcevic, D., Kalajzic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteogenic+potential+of+alpha+smooth+muscle+actin+expressing+muscle+resident+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteogenic potential of alpha smooth muscle actin expressing muscle resident progenitor cells.</a> Bone. 84, 69-77 (2016).</li>
<li>Hagiwara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+stability+dictates+the+differentiation+pathway+of+periosteal+progenitor+cells+in+fracture+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.Orthop.Res%22%5BJournal%5D)">Fixation stability dictates the differentiation pathway of periosteal progenitor cells in fracture repair.</a> J.Orthop.Res. 33 (7), 948-956 (2015).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+GFP+expression+in+murine+bone%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of GFP expression in murine bone.</a> J.Histochem.Cytochem. 53 (5), 593-602 (2005).</li>
<li>Nissanov, J., Bertrand, L., Tretiak, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+distortion+reduction+using+tape+support%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.Res.Tech%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning distortion reduction using tape support.</a> Microsc.Res.Tech. 53 (3), 239-240 (2001).</li>
<li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues%2C+whole-animals%2C+insects+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.Histol.Cytol%22%5BJournal%5D)">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch.Histol.Cytol. 66 (2), 123-143 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Qui abbiamo presentato una dettagliata protocollo cryohistology di co-localizzare e quantificare diverse misure biologiche allineando le immagini provenienti da vari cicli di colorazione / immagini su una singola sezione. Il metodo descritto usando l&#39;cryotape è particolarmente utile in quanto mantiene la morfologia di difficile tessuti sezione (ad esempio, osso mineralizzato e della cartilagine). Inoltre, il tessuto sezionato viene fatto aderire saldamente al vetrino, consentendo più cicli di colorazione / ...

La ricerca biologica richiede spesso fenotipizzazione efficiente, che è frequentemente associata con una sorta di analisi istologica 1-3. Questa necessità è ancora più evidente con progetti ambiziosi per interrompere ogni gene nel genoma murino 4. Queste analisi istologiche possono variare da valutare la morfologia delle cellule e / o le caratteristiche anatomiche di espressione mappatura di specifici geni o proteine ​​alle singole celle. Infatti, uno dei contributi fondamentali istologia al campo della genomica è la possibilità di associare un segnale molecolare specifico per una regione o cella specifica tipologia. I metodi tradizionali di istologia, in particolare per i tessuti muscolo-scheletrici, sono spesso in termini di tempo e laborioso, che richiede a volte settimane per riparare, Decalcificare, sezione, macchia, e l&#39;immagine del campione poi analizzare le immagini tramite interpretazione umana. Analizzando i segnali molecolari multipli, sia tramite immunoistochimica, in situ hybridizatione, o colorazioni speciali, richiede più sezioni e anche campioni multipli per eseguire in modo appropriato. Inoltre, queste risposte multiple non possono essere co-localizzate alla stessa cella e talvolta non possono essere co-localizzato ad una regione specifica all&#39;interno di un dato campione. Come il campo della genomica e epigenomics muove nell&#39;era digitale, il campo istologico deve seguire l&#39;esempio di fornire efficiente e di alta produttività, e l&#39;analisi automatizzata di una varietà di segnali molecolari all&#39;interno di una singola sezione istologica. Infatti, vi è una domanda per il miglioramento delle tecniche istologiche che possono associare segnali molecolari multipli a cellule specifiche all&#39;interno di un dato campione. Recentemente, abbiamo pubblicato un nuovo metodo cryohistological high-throughput per valutare diverse misure di risposta all&#39;interno di una data sezione di tessuto mineralizzato 5-14. Il processo prevede la stabilizzazione del cryosection con cryotape congelati, aderendo alla sezione registrata rigidamente ad un vetrino da microscopio, elo svolgimento di diversi cicli di colorazione e di imaging su ogni sezione. Questi cicli di immagini vengono quindi allineati manualmente o tramite computer automazione prima analisi di immagine (Figura 1). Qui, vi presentiamo protocolli dettagliati di questo processo e fornire esempi in cui queste tecniche hanno migliorato la nostra comprensione dei diversi processi biologici.

<table><tbody><tr><td>10% formalina tamponata neutra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Molteplici fornitori disponibili. Tossico. Può essere sostituito con paraformaldeide al 4%.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Criostampi</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand #22-363-554</td><td>Possono essere utilizzate diverse dimensioni a seconda del tessuto</td></tr><tr><td>Cryomatrix</td><td>Thermo Scientific</td><td>6769006</td><td>Può essere sostituito con altre criomatrici. Tuttavia, le resine a base di PVA/PEG hanno funzionato meglio nelle nostre mani.</td></tr><tr><td>2-metil-butano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M32631</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica Biosystems</td><td>3050s</td><td>Può essere sostituito con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Disco per campioni</td><td>Leica Biosystems</td><td>14037008587</td><td>Può essere sostituito con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Lame per criostato</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051835</td><td>Possono essere sostituite con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Sezione Criotape</td><td>Lab</td><td>Cryofilm 2C</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica a rulli</td><td>Sciences</td><td>62800-46</td><td>Può essere sostituito con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio plastico Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Sciences 71890-01</td><td>Può essere sostituito con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio in vetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>3051</td><td>Sostituibili con altre marche/modelli.</td></tr><tr><td>Adesivo ottico Norland, 61</td><td>Adesivo ottico Norland ottico</td><td>, 61</td><td></td></tr><tr><td>Luce nera UV</td><td>General Electric</td><td>F15T8-BLB</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Sigma Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Chitosan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3646</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>Microsfere InSpeck rosse</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14787</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere InSpeck verdi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>I-14785</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1255</td><td>Molteplici fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0875&nbsp;</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Alizarin complexone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3882&nbsp;</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Demeclociclina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6140&nbsp;</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>ELF 97 substrato giallo fluorescente di fosfatasi acida</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>E-6588</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62247</td><td>Più fornitori disponibili. Può essere sostituito con Hoechst 33342 o altri coloranti nucleari.</td></tr><tr><td>TO-PRO-3 (Cy5 controcolorante nucleare)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37108</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>Acetato di sodio anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889 Fornitori</td><td>multipli disponibili.</td></tr><tr><td>tartrato di sodio bibasico diidrato&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6521</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Nitrito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2252</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15504</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>MgCl2 esaidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Fast Red TR Salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8764</td><td>Fornitori multipli disponibili. Può anche essere sostituito con altri kit di substrati come Vector Blue (Vector Laboratories, Cat# SK-5300)</td></tr><tr><td>Naphthol AS-MX&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4875</td><td>Fornitori multipli disponibili.</td></tr><tr><td>N,N dimetilformammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D158550</td><td>Vari fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Blu di toluidina O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3260</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>Axio Scan.Z1</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>Axio Scan.Z1</td><td>Possono essere utilizzati anche altri scanner lineari o piastrellati.</td></tr><tr><td>Set di filtri DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>Set di filtri CFP 49000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49001</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri GFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49020</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri YFP</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49003</td><td></td></tr><tr><td>Set di filtri personalizzati gialli (ELF 97)</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>costume; HQ409sp, HQ555/30m, 425dxcr</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Set di filtri</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49004</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 Set di filtri</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td>49009</td><td></td></tr><tr><td>CryoJane Tape Transfer System</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-10</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>CryoJane Tape Windows</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62800-72</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr><tr><td>CryoJane Diapositive adesive Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>62800-4X</td><td>Più fornitori disponibili.</td></tr></tbody></table>

-high throughput, multi-image cryohistology di mineralizzati tessuti

High-Throughput, Multi-Image Cryohistology of Mineralized Tissues

C'è un crescente bisogno di fenotipizzazione e istopatologia efficienti di una varietà di tessuti. Questa necessità di fenotipizzazione è evidente con gli ambiziosi progetti per distruggere ogni gene nel genoma del topo. La comunità di ricerca ha bisogno di mezzi rapidi ed economici per fenotipizzare i tessuti attraverso l'istologia. Le analisi istologiche dei tessuti scheletrici sono spesso dispendiose in termini di tempo e semi-quantitative nella migliore delle ipotesi, e richiedono regolarmente l'interpretazione soggettiva dei vetrini da parte di individui addestrati. Qui, presentiamo un paradigma crioistologico per una fenotipizzazione efficiente ed economica di tessuti mineralizzati. In primo luogo, presentiamo un nuovo metodo di criosezione stabilizzata su nastro che preserva la morfologia dei tessuti mineralizzati. Queste sezioni vengono quindi fatte aderire rigidamente ai vetrini e riprodotte ripetutamente per diversi cicli di colorazione. Le immagini risultanti vengono quindi allineate manualmente o tramite software per computer per produrre pile composite di diverse immagini stratificate. Il protocollo consente la co-localizzazione di numerosi segnali molecolari a cellule specifiche all'interno di una data sezione. Inoltre, questi segnali fluorescenti possono essere quantificati oggettivamente tramite software per computer. Questo protocollo supera molte delle carenze associate all'istologia dei tessuti mineralizzati e può fungere da piattaforma per la fenotipizzazione ad alto rendimento e ad alto contenuto dei tessuti muscoloscheletrici in futuro.

Un flusso di lavoro generale per l&#39;High-Throughput, Multi-Image Cryohistology Figura 1 rappresenta lo schema generale utilizzato per questa tecnica. Esso comprende diversi passi dalla fissazione attraverso vari cicli di imaging e, infine, l&#39;allineamento immagine / analisi. Il processo può richiedere un minimo di una settimana per andare dalla fissazione del campione attraverso 4 giri d...

In questo manoscritto, presentiamo una piattaforma di crioistologia semi-automatizzata ad alta produttività per produrre immagini composite allineate di misure di risposta multipla da diversi cicli di imaging fluorescente su sezioni congelate di tessuti mineralizzati.

-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

There is an increasing need for efficient phenotyping and histopathology of a variety of tissues. This phenotyping need is evident with the ambitious ...

L'obiettivo di questa tecnologia è fornire strumenti istologici in grado di integrare sistemi modello complessi in modo ad alto rendimento, indipendente dall'osservatore e completamente digitale, che sia al contempo economico e significativo per i biologi del sistema muscolo-scheletrico. L'istologia, sebbene fondamentale per la maggior parte dei ricercatori biologici, è spesso laboriosa e non quantitativa. È quindi necessario sviluppare tecniche istologiche che consentano un'analisi efficiente, ad alto rendimento e automatizzata.Con la nostra piattaforma di criostoria, il ricercatore può associare multipli segnali molecolari a cellule specifiche all'interno di un campione dato, attraverso l'analisi e la colorazione della stessa diapositiva ripetutamente in maniera ad alto rendimento. A dimostrare la procedura saranno il dottor Xi Jiang e Li Chen, assistenti di ricerca nel mio laboratorio, che hanno guidato lo sviluppo e l'esecuzione di queste tecniche. Per iniziare la procedura, rimuovere il campione dal formalina, dissezionare e rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso e trasferirlo in saccarosio al 30%, preparato in PBS 1x.Incubare i campioni nel saccarosio per 12-24 ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, riempire uno stampo criogenico con del mezzo criogenico e posizionare i campioni nello stampo. Quindi, allineare i campioni nello stampo in modo che il piano di taglio della regione di interesse sia parallelo al fondo dello stampo.Successivamente, posizionare lo stampo criogenico su un pezzo di ghiaccio secco fino a quando uno strato sottile di mezzo di inclusione criogenica non si congela, fissando così i campioni in posizione. Poi, riempire il volume rimanente dello stampo criogenico con il mezzo di inclusione criogenica, mantenendo lo stampo sul pellet di ghiaccio secco. Successivamente, posizionare lo stampo criogenico in un contenitore contenente 2-metilbutano preraffreddato con ghiaccio secco.Una volta che i campioni sono completamente congelati, rimuovere lo stampo criogenico e eliminare l'eccesso di 2-metilbutano. Avvolgere lo stampo criogenico nella pellicola di cellophane e conservarlo a meno 20 gradi Celsius o a meno 80 gradi Celsius. In questa procedura, trasferire il blocco del campione dal congelatore a un criostato impostato tra meno 20 e meno 25 gradi Celsius.Successivamente, rimuovere il blocco dallo stampo criogenico e tagliare il mezzo di inclusione criogenica in eccesso con una lametta. Poi, aggiungere del mezzo di inclusione criogenica sul disco del campione e posizionare il blocco in modo che la superficie del disco sia parallela alla superficie inferiore del blocco. Attendere che il mezzo di inclusione criogenica si congeli.Successivamente, posizionare il disco del campione sulla testa del campione e regolare la testa in modo che la lama tagli in parallelo alla superficie del blocco di campione. Quindi, tagliare pezzi di cryotape per coprire la regione di interesse e preraffreddarli nel criostato. Successivamente, ridurre il blocco fino a un livello compreso nella regione di interesse, continuando ad effettuare le regolazioni necessarie.Una volta raggiunta la regione di interesse e quando è possibile effettuare una sezione, rimuovere eventuali trucioli dalla superficie del blocco. Successivamente, staccare il supporto non adesivo dal cryotape afferrando il nastro dalle linguette argentee dorate non appiccicose. Quindi posizionare il nastro sul blocco con il lato adesivo rivolto verso il basso.Applicare pressione sul nastro criogenico utilizzando il rullo ed eseguire un taglio mediante la ruota di taglio automatica o manuale del criostato. Successivamente, posizionare il campione con il lato del tessuto rivolto verso l'alto su un vetrino in plastica all'interno del criostato. Rimuovere il vetrino in plastica dal criostato e lasciare sciogliere il mezzo di inclusione criogenico, in modo che il campione aderisca alla superficie del vetrino.Ripetere il sezionamento per le sezioni seriali o altre aree di interesse. Al termine, posizionare le sezioni in una scatola per vetrini e conservarle a quattro, meno 20 o meno 80 gradi Celsius, a seconda della durata della conservazione richiesta e delle misure di risposta successive. Per eseguire il metodo con adesivo indurente sotto luce UV, etichettare innanzitutto il vetrino microscopico.Applicare una goccia di adesivo ottico attivato da UV su due vetrini e utilizzare il bordo di un vetrino per stendere uno strato sottile di adesivo sulla superficie dei vetrini. Quindi, tagliare la linguetta in argento-oro e posizionare la sezione con il nastro rivolta verso l'alto sullo strato adesivo del primo vetrino. Applicare la sezione con un movimento rotolante da un bordo all'altro per minimizzare la formazione di bolle intrappolate sotto il nastro.In seguito, rimuovere la sezione adesiva dal primo vetrino, quindi posizionarla sullo strato adesivo del secondo vetrino, avendo cura di evitare la formazione di bolle. Una volta posizionato il numero appropriato di sezioni per l'esperimento specifico su ciascun vetrino, eliminare l'eccesso di adesivo dalle aree circostanti. Successivamente, esaminare attentamente le sezioni per verificare la presenza di bolle o fibre al di sotto del nastro adesivo.Quindi posizionare i vetrini sotto la luce nera UV per cinque-dieci minuti per incrociare il legame dello strato adesivo. In questo passaggio, preparare la soluzione del marcatore di riferimento sciogliendo 50 microlitri di microsfere verdi e 50 microlitri di microsfere rosse in 100 microlitri di acqua. Conservare la soluzione al buio a quattro gradi Celsius.Quindi immergere la punta di una pipetta nella soluzione di microsfere e applicare una goccia di tale soluzione su ciascuna sezione, adiacente alla regione di interesse. Successivamente, asciugare i vetrini a temperatura ambiente e proteggerli dalla luce coprendoli con della stagnola per 30 minuti, se si procede con l'elaborazione dei vetrini nello stesso giorno. In caso contrario, collocare i vetrini in una scatola per vetrini a quattro gradi Celsius.Dopo la colorazione delle sezioni, montare i coprioggetti sui vetrini utilizzando un mezzo di montaggio acquiescente. Per eseguire l'acquisizione delle immagini, caricare i vetrini nei vassoi del microscopio e inserire i vassoi nello stack del microscopio per la scansione di vetrini. Quindi, fare clic sull'elenco dei profili nel software del microscopio per caricare un profilo per ogni vetrino con il tempo di esposizione appropriato per ciascun fluorocromo.Fare clic sul pulsante Avvia scansione di anteprima per acquisire un'immagine di anteprima di ogni vetrino. Il software assegnerà automaticamente un nome file leggendo i codici a barre posizionati sulle etichette dei vetrini. In alternativa, è possibile assegnare manualmente un nome file a ciascun vetrino.Impostare le regioni di interesse entrando nella procedura guidata di rilevamento del tessuto, disegnando ciascuna regione con lo strumento di disegno, apportando le eventuali regolazioni necessarie e salvandole per i successivi cicli di acquisizione delle immagini. Una volta configurato ciascun vetrino, avviare la scansione facendo clic sul pulsante Avvia scansione. Al termine di ogni ciclo di acquisizione, immergere i vetrini in un barattolo Coplin riempito con PBS 1x fino a quando i coprioggetti si staccano dai vetrini, prima del successivo passaggio di colorazione.Al termine di tutti i cicli di acquisizione, esportare le immagini di ogni singolo canale come file TIF o JPG per il montaggio e l'analisi delle immagini. In questa figura, una sezione di femore di un topo di tre mesi è stata colorata con calceina blu ed è stata acquisita per visualizzare il minerale accumulato, mostrato in bianco, e i marcatori di mineralizzazione, mostrati in verde e rosso nel primo ciclo di acquisizione. Successivamente, i vetrini sono stati acquisiti per l'attività di TRAP, visibile in giallo nel secondo ciclo, e per l'attività di AP, visibile in rosso nel terzo ciclo di acquisizione.Infine, i vetrini sono stati colorati con blu di toluidina nel quarto ciclo. I marcatori di riferimento sono stati acquisiti durante ogni ciclo di acquisizione, incluso il ciclo cromogenico, e sono stati allineati utilizzando un software personalizzato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un tempo inferiore a quello necessario per decalcificare un campione tipico.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre immagini ad alto contenuto di alta qualità di tessuti mineralizzati, che speriamo possano essere utilizzate più ampiamente dalla comunità muscoloscheletrica.

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Viene presentata una strategia per analizzare quantitativamente i dati istologici nel midollo osseo. La microscopia confocale di cellule marcate in fluorescenza in sezioni di tessuto produce immagini bidimensionali, che vengono analizzate automaticamente. Le analisi di co-localizzazione di diversi tipi di cellule vengono confrontate con i dati provenienti da immagini simulate, fornendo informazioni quantitative sulle interazioni cellulari.

Automated quantificazione di cellule ematopoietiche - Interazioni cellule stromali in istologici Immagini di Undecalcified Bone

Questo lavoro presenta un nuovo protocollo di elaborazione e di imaging per un'analisi trasversale di tessuto tridimensionale che consente di sfruttare appieno le modalità di imaging confocale. Questo protocollo conserva l'antigenicità e rappresenta un sistema robusto per analizzare l'istologia cutanea e potenzialmente altri tipi di tessuti.

Supporto orizzontale intero: un protocollo di elaborazione e imaging novello per le sezioni trasversali tessute spesse e tridimensionali della pelle

Questo protocollo mira alle cellule specifiche nel tessuto per immagini a risoluzione nanometrica usando un microscopio elettronico a scansione (SEM). Un numero elevato di sezioni di serie da materiale biologico resina-incastonato prima è imaged in un microscopio chiaro per identificare la destinazione e quindi in modo gerarchico in SEM.

Imaging multimodale gerarchica delle sezioni di serie per l'individuazione di specifici obiettivi cellulari all'interno di grandi volumi

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Questo metodo descrive l'uso del modello murino R26R-Confetti (Coriandoli) per studiare i tessuti mineralizzati, coprendo tutte le fasi dalla strategia di allevamento all'acquisizione di immagini. Incluso è un protocollo generale che può essere applicato a tutti i tessuti molli e un protocollo modificato che può essere applicato ai tessuti mineralizzati.

Clonal Genetic Tracing utilizzando il mouse Corfetti per studiare i tessuti mineralizzati

Descriviamo un metodo di colorazione rapida per eseguire l'imaging multispettrale sui tessuti congelati.

Un metodo rapido per l'imaging della fluorescenza multispettrale delle sezioni dei tessuti congelati

Questo protocollo presenta una pipeline completa per analizzare campioni ottenuti da cuori umani che abbracciano le scale microscopiche e macroscopiche.

Pipeline per lo studio anatomico tridimensionale multiscala del cuore umano

La combinazione di IBEX (iterative bleaching-extends-multiplexity) e di un saggio commerciale di marcatura dei nucleotidi (Click-iT EdU) consente il rilevamento e la categorizzazione dei tipi di cellule in divisione in processi altamente dinamici in sezioni fisse di tessuto murino congelato. Inoltre, una nuova pipeline di elaborazione delle immagini open source fornisce l'acquisizione e l'analisi delle immagini ad alto rendimento.

Flusso di lavoro di imaging e analisi ad alto rendimento per la valutazione dei fenotipi delle cellule cutanee e degli stati di proliferazione nei campioni di tessuto

La retina mostra una complessa organizzazione spaziale attraverso la sua struttura laminare. Le moderne tecniche di trascrittomica spaziale e sequenziamento richiedono sezioni di tessuto &lt; 20 μm di spessore, limitandone l'applicabilità nella ricerca retinica. Questo metodo di criosezione appena congelato produce sottili sezioni en face della retina di topo preservando le relazioni spaziali planari, consentendo una mappatura molecolare completa tra le lamine.

En face Criosezione della retina di topo per analisi molecolare spaziale ad alta dimensione

Questo protocollo include un flusso di lavoro passo dopo passo per campioni vascolari calcificati: gestione dei tessuti, decalcificazione, validazione dell'RNA, rilevamento dei livelli di calcificazione e strategie di selezione della regione di interesse sul Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). L'obiettivo è presentare un metodo completo per preservare la morfologia del tessuto vascolare e l'RNA per un'analisi trascriromica spaziale affidabile.

Preparazione e elaborazione delle arterie calcificate con morfologia e RNA preservati per la profilazione spaziale digitale

Questo protocollo standardizza la criotomografia elettronica (crio-ET) per tessuti spessi integrando il congelamento ad alta pressione (HPF) con il metodo waffle, il sollevamento criogenico del fascio di ioni a fuoco (crio-FIB) e l'acquisizione parallela a simmetria dose, producendo lamelle uniformemente sottili e campioni vitrificati per analisi riproducibili in situ nell'ippocampo del topo.

Flusso di lavoro di crio-tomografia elettronica per tessuti spessi dimostrato nell'ippocampo del topo

Scopri la piattaforma di criohistologia ad alto rendimento per l'analisi di tessuti mineralizzati. Questo metodo automatizzato consente l'imaging multiplo su vetrini seriali, riducendo la variabilità e migliorando l'efficienza per i biologi muscoloscheletrici.

-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

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