Name: Rilevamento del pH-dipendente attività di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Scopri come caratterizzare l'attività pH-dipendente della chaperone HdeB di Escherichia coli in condizioni acide. Questo metodo permette di studiare i meccanismi di protezione proteica nei batteri enterici.

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Ringraziamo il Dr. Claudia Cremers per lei consigli utili su saggi chaperone. Ken Wan è riconosciuto per la sua assistenza tecnica nella purificazione HdeB. Questo lavoro è stato sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute (a JCAB) e il National Institutes of Health sovvenzione RO1 GM102829 a JCAB e Ujj-UD è supportato da una borsa di ricerca post-dottorato fornita dalla German Research Foundation (DFG).

1. Espressione e purificazione di periplasmic HdeB NOTA: HdeB è stato espresso in E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10, e purificato dal periplasma su polimixina lisi. <ol><li> Preparare una cultura durante la notte di E. coli che ospitano il plasmide pTrc- hdeB 10 a 30 ml di LB contenente 200 mg / ml di ampicillina (LB Amp). Seminare quattro 1 L culture di LB Amp e crescere a 37 ° C e 200 rpm fino a raggiungere OD 600nm di 0,7. Quindi, aggiungere 300 mM IPTG per indurre l&#39;espressione di HdeB e diminuire la temperatura di crescita a 30 ° C. </li><li> Dopo 5 ore di espressione proteica a 30 ° C, raccogliere le cellule per centrifugazione a 8.000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare il pellet con 100 ml di tampone A (50 mM Tris / HCl, 50 mM NaCl, pH 7,5) e centrifugare le cellule di nuovo a 8000 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Successivamente, risospendereil pellet cellulare in 80 ml di tampone A contenente 1 mg / ml di solfato di polimixina. Per efficiente rottura della membrana esterna, mescolare delicatamente la sospensione per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Per rimuovere la frazione citoplasmatica e detriti cellulari, centrifugare la sospensione per 20 min a 15.000 xg a 4 ° C. Ciò si traduce in ~ 60 ml surnatante contenente la HdeB solubile. </li><li> Dializzare supernatante contenente l&#39;estratto periplasmic overnight contro il volume 150x di tampone B (20 mM Tris / HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8,0) con una membrana di dialisi con 6 kDa MW cut-off. Concentrare le proteine ​​a 15 ml utilizzando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 3 kDa. Filtrare la soluzione proteica utilizzando un filtro da 0,2 micron pori. </li><li> Applicare la proteina su una colonna di cromatografia a scambio anionico (volume colonna 5 ml) che è stata equilibrata con 5 volumi di colonna di buffer B con una portata di 2,5 ml / min. Una volta che la proteina è caricato sulla colonna, lavare la colonna con tampone B per 10 min auna portata di 2,5 ml / min. Eluire HdeB con un gradiente lineare da 0 a 0,5 M NaCl in tampone B per un periodo di 50 min con una portata di 2,5 ml / min 6. </li><li> Identificare frazioni contenenti HdeB utilizzando un 15% SDS-PAGE. Mescolare 20 ml del campione con 5 ml 5x ridotto tampone di caricamento SDS. Carico 10 microlitri sul gel ed eseguire in tampone Tris-glicina (14,4 g / L glicina, 2,9 g / L Tris, 1 g / L di sodio dodecil solfato, pH 8,3). Attivare il gel a 150 V finché la banda di bromofenolo ha migrato vicino al fondo del gel (~ 45 min). </li><li> Pool tutte le frazioni HdeB contenenti, dializzare a 4 ° C overnight contro tampone di conservazione HdeB 4 L (50 mM Tris / HCl, 200 mM NaCl, pH 8,0), e concentrare la proteina di circa 300 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare cut-off di 3 kDa. Determinare la concentrazione di HdeB a 280 nm utilizzando il coefficiente di estinzione 280nm ε = 15.595 M -1 cm -1. Preparare aliquote di 100 microlitri e senza flashze le aliquote in azoto liquido. NOTA: HdeB può essere conservato a -70 ° C per almeno 6 mesi. </li></ol> 2. Chaperone attività Assay Utilizzando termicamente Unfolding malato deidrogenasi (MDH) NOTA: L&#39;influenza di HdeB purificato sull&#39;aggregazione di dispiegamento termicamente porcine mitocondriale malato deidrogenasi (MDH) a diversi valori di pH è stata monitorata come descritto di seguito. Tutte le concentrazioni di proteine ​​elencate si riferiscono alla concentrazione monomerica. <ol><li> Per preparare MDH, dializzare MDH a 4 ° C overnight contro 4 L tampone C (50 potassio fosfato mM, 50 mM NaCl, pH 7,5) e concentrare la proteina a circa 100 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 30 kDa. NOTA: è necessaria la dialisi attento della MDH MDH come viene fornito come soluzione di solfato di ammonio. </li><li> Per rimuovere aggregati, centrifugare la proteina per 20 minuti a 20.000 xga 4 ° C. Determinare la concentrazione MDH da assorbanza a 280 nm (ε &lt;sub&gt; 280 nm = 7,950 M -1 cm -1). Preparare 50 aliquote microlitri di MDH e flash-congelare le aliquote per la conservazione. </li><li> Mettere 1 ml di quarzo cuvetta in uno spettrofotometro a fluorescenza dotato di supporti del campione a temperatura controllata e agitatore. Impostare λ ex / em a 350 nm. </li><li> Aggiungere volumi adeguati di pre-riscaldato (43 ° C) tampone D (150 mm potassio fosfato, 150 mM NaCl) ai valori desiderati di pH (qui: pH 2.0, pH 3,0, pH 4.0 e pH 5,0) alla provetta e set la temperatura nel supporto cuvetta a 43 ° C. Il volume totale è di 1.000 ml. </li><li> Aggiungere 12,5 mM HdeB (o in alternativa lo stesso volume di tampone di conservazione HdeB per il controllo del buffer) al buffer, seguita dall&#39;aggiunta di 0,5 mM MDH. Inizia il monitoraggio dispersione della luce. Incubare la reazione per 360 secondi per consentire sufficiente svolgersi della MDH. </li><li> Sollevare il pH a 7 con l&#39;aggiunta di 0,16-0,34 volume di 2 M K senza buffer 2 HPO 4 e continuare recondo dispersione della luce per un altro 440 sec. </li><li> Impostare la portata di MDH aggregazione registrata in assenza del chaperone in un punto temporale definito dopo neutralizzazione (qui dopo 500 secondi, quando è stata osservata la massima diffusione della luce di MDH) al 100%. Normalizzare l&#39;attività di HdeB al segnale dispersione della luce della MDH in assenza di HdeB a ciascun valore pH indicato. </li></ol> 3. Rilevamento di HdeB-LDH formazione del complesso da Analytical Ultracentrifugazione (AUC) NOTA: sedimentazione esperimenti di velocità di HdeB da solo o in complesso con dispiegarsi termicamente lattato deidrogenasi (LDH) sono state eseguite utilizzando un&#39;ultracentrifuga analitica. <ol><li> Per preparare LDH, dializzare LDH a 4 ° C overnight contro 4 L tampone C (50 mM di fosfato di potassio, 50 mM NaCl, pH 7,5) e concentrare la proteina a circa 200 micron usando unità filtro centrifugo con un peso molecolare di cut-off di 30 kDa. NOTA: la dialisi attento di LDH è richiesto come LDH viene fornito come soluzione di solfato di ammonio. </li><li> Per rimuovere aggregati, centrifuga LDH per 20 minuti a 20.000 xga 4 ° C. Determinare la concentrazione LDH da assorbanza a 280 nm (ε 280 nm = 43.680 M -1 cm -1). Preparare 50 aliquote microlitri di LDH e flash-congelare le aliquote per la conservazione. </li><li> Incubare 3 mM LDH in presenza e assenza di 30 mM HdeB in tampone D (pH 4 e 7, rispettivamente) per 15 min a 41 ° C. NOTA: L&#39;incubazione di LDH alle più alte temperature provoca la sua completa aggregazione, e nessun effetto chaperone di HdeB possono essere osservati. </li><li> Lasciate che i campioni raffreddare a temperatura ambiente. Poi, i campioni di carico in cellule che contengono il settore di serie a forma di centrotavola a 2 canali con 1,2 cm Lunghezza percorso. Caricare le cellule nel ultracentrifuge ed equilibrare a 22 ° C per almeno 1 ora prima di sedimentazione. </li><li> campioni Spin a 22 ° C e 167.000 xg nel rispettivo rotore per 12 ore, e monitorare l&#39;sedimentation della proteina continuo a 280 nm. Come precedentemente dimostrato, il rapporto segnale-rumore è migliorata quando l&#39;intensità della luce trasmessa di ogni canale è misurata anziché assorbanza. Ciò migliora anche la qualità del successivo montaggio dei dati. </li><li> Condurre analisi dei dati con SEDFIT (versione 15.01b dicembre 2015), con il continuo c (s) la distribuzione del modello 17. Un tutorial che descrive come utilizzare SEDFIT può essere trovato in riferimento 18. <ol><li> Impostare il livello di confidenza per la ME (massima entropia) regolarizzazione a 0,7. </li></ol></li><li> Calcolare la densità del buffer così come la viscosità utilizzando SEDNTERP 19. Per stimare la quantità di proteine ​​client aggregata, confrontare gli integrali di LDH sedimentato in pH 4 a pH 7 come riferimento. NOTA: L&#39;integrazione delle trame di distribuzione sedimentazione può essere fatto direttamente in SEDFIT. Software alternativo per analizzare i dati di velocità di sedimentazione può essere trovato in una recente revisione di 20. &lt;/ Li&gt; </ol> 4. Monitoraggio MDH inattivazione e riattivazione in presenza di HdeB NOTA: L&#39;influenza di HdeB purificato il ripiegamento di pH spiegato MDH stata determinata monitorando l&#39;attività MDH sulla neutralizzazione. <ol><li> Incubare 1 mM MDH in tampone D ai valori desiderati di pH (qui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) per 1 ora a 37 ° C in assenza o presenza di 25 mM HdeB. Quindi, spostare la temperatura a 20 ° C per 10 min. NOTA: Nessuna refolding MDH è stata osservata anche in presenza di HdeB quando MDH stata incubata a temperature superiori a 37 ° C. </li><li> Per avviare ripiegamento di acido denaturato MDH, neutralizzare i campioni a pH 7 per aggiunta di 0,13-0,42 volume di 0,5 M sodio fosfato, pH 8,0. </li><li> Dopo incubazione per 2 ore a 20 ° C, determinare l&#39;attività MDH monitorando la diminuzione di NADH a 340 nm 9. NOTA: MDH catalizza la riduzione NADH-dipendente dell&#39;ossalacetato in L-malato. <ol&gt; <li> Mescolare 50 ml di reazione incubazione con 950 microlitri di tampone (50 mM sodio fosfato, pH 8,0, 1 mM ossalacetato, e 150 pM NADH). NOTA: La concentrazione finale di MDH nel tampone dovrebbe essere 44 nM. </li><li> Monitorare la variazione di assorbanza con uno spettrofotometro, dotato di un blocco di controllo di temperatura Peltier impostato a 20 ° C. </li><li> Segnala l&#39;attività MDH rispetto al 44 nM nativo MDH che è stato mantenuto a pH 7,0. </li></ol></li></ol> 5. Effetto della sovraespressione HdeB su E. coli di sopravvivenza in condizioni di stress acido NOTA: E. coli MG1655 DNA genomico è stato isolato utilizzando un protocollo pubblicato 21. <ol><li> Amplificare hdeB da E. coli MG1655 mediante PCR usando primer hdeB - BamH I-rev GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT e hdeB - EcoR I-FW GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA TCT CTC C. </li><li> Impostare la reazione di PCR in 50 microlitri come segue: 10 microlitri di buffer 5x polimerasi, 200 micron dNTP, 0,5 micron di primer JUD2, 0,5 micron di primer JUD5, 150 ng DNA genomico MG1655, 0,5 microlitri DNA polimerasi, aggiungere DDH 2 O a 50 ml. </li><li> Eseguire l&#39;amplificazione di hdeB come segue: Fase 1: 5 min a 95 ° C, 1 ciclo; step 2: 30 sec a 95 ° C, 30 sec a 55 ° C, 30 sec a 72 ° C, 40 cicli; Fase 3: 10 min a 72 ° C. </li><li> Clone risultante frammento di PCR nei siti EcoR I e BamH I del plasmide pBAD18 utilizzando metodi standard per sito di restrizione clonazione. Purificare il plasmide utilizzando un kit di purificazione plasmide secondo le istruzioni del produttore. Verificare il plasmide risultante dal sequenziamento 10. </li><li> Trasformare il plasmide che esprime HdeB o le pBAD18 controllo vettoriale vuoti in ceppo BB7224 (Δ rpoH) (genotipo: F -, λ -, E14 -, [araD139] B / r [6; (ARGF-lac) 169 flhD5301 Δ (Fruk-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (Sm R) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 ZHF :: Tn 10 (Tc S) suhX401 deoC1 Arad + rpoH :: kan +; 16) usando le cellule chimicamente competenti. NOTA: Questo ceppo è sensibile alla temperatura. </li><li> Dopo 45 sec shock termico a 42 ° C e prima della placcatura, incubare le cellule a 30 ° C e 200 rpm. Eseguire singola colonia striscia-out dei cloni positivi e incubare una notte a 30 ° C. Preparare una coltura durante la notte in 50 ml LB Amp e coltivare le cellule a 200 rpm e 30 ° C. </li><li> Diluire culture overnight 40 volte in 25 ml LB Amp e crescere i batteri in presenza di 0,5% arabinosio (Ara) a 30 ° C e 200 rpm a un 600nm OD = 1.0 per indurre l&#39;espressione della proteina HdeB. </li><li> Per gli esperimenti variazione del pH, usare LBAmp + Ara per diluire le cellule a OD 600nm di 0,5 e regolare ai rispettivi valori di pH (qui: pH 2.0, pH 3.0 e pH 4,0) con l&#39;aggiunta di volumi adeguati su 5 M HCl. </li><li> Dopo che i punti di tempo indicato (pH 2, 1 min; pH 3, 2.5 min; pH 4, 30 min), neutralizzare gli culture aggiunta dei volumi adeguati su 5 M NaOH. </li><li> Monitorare la crescita delle colture neutralizzati in coltura liquida per 12 ore a 30 ° C utilizzando misurazioni OD. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare

<html> Per studiare il meccanismo di attivazione e funzione chaperone di HdeB, grandi quantità di HdeB devono essere espresse e purificate. Un certo numero di sistemi di vettori di espressione sono disponibili per la produzione di alti livelli di una proteina bersaglio, comprese PTRC o pBAD vettori, entrambi i quali sono stati utilizzati in questo studio. I promotori sono facilmente accessibili per E. coli RNA polimerasi e l&#39;espressione permettere così fortemente upregulated di HdeB in qualsiasi E. coli....

Un ambiente naturale comune in cui gli agenti patogeni microbici sperimentano proteine condizioni dispiegarsi acido-indotta è lo stomaco dei mammiferi (intervallo di pH 1-4), il cui pH acido serve come una barriera efficace contro gli agenti patogeni di origine alimentare 1. Proteine dispiegarsi e aggregazione, che è causato da protonazione catena laterale di aminoacidi, colpisce processi biologici, danni strutture cellulari e alla fine provoca la morte delle cellule 1,2. Poiché il pH del periplasma batterico equilibra quasi istantaneamente con il pH ambientale dovuto alla diffusione libera di protoni attraverso la membrana esterna porosa, proteine di membrana periplasmatiche ed interne di batteri Gram-negativi sono i componenti cellulari più vulnerabili in condizioni acido-stress 3. Per proteggere il loro proteoma periplasmic contro il Rapid danni da acido-mediata, batteri Gram-negativi utilizzano gli accompagnatori periplasmatiche acido attivato HdeA e HdeB. HdeA è un chaperone condizionalmente disordinati <sup&gt; 4,5: A pH neutro, HdeA è presente come, dimero chaperone-inattiva piegato. C&#39;era una variazione del pH pH inferiore a 3, la funzione di accompagnatore HdeA è rapidamente attivato 6,7. L&#39;attivazione di HdeA richiede profondi cambiamenti strutturali, tra cui la sua dissociazione in monomeri, e parziale che si svolgevano dei monomeri 6-8. Una volta attivato, HdeA si lega alle proteine ​​che si svolgono in condizioni acide. Si previene efficacemente la loro aggregazione sia durante l&#39;incubazione a pH basso così come su pH di neutralizzazione. Al ritorno a pH 7,0, HdeA facilita il ripiegamento delle proteine cliente in forma di ATP-indipendenti e converte di nuovo nella sua dimerica, conformazione chaperone-inattiva 9. Allo stesso modo, il chaperone HdeB omologa è anche chaperone-inattivo a pH 7,0. A differenza HdeA, tuttavia, l&#39;attività di accompagnatore HdeB raggiunge il suo massimo apparente a pH 4.0, condizioni in cui HdeB è ancora in gran parte piegata e dimerici 10. Inoltre, abbassando ulteriormente le Caus pHes l&#39;inattivazione di HdeB. Questi risultati suggeriscono che, nonostante la loro ampia omologia, HdeA e HdeB differiscono nella loro modalità di attivazione funzionale che permette loro di coprire un ampio intervallo di pH con la loro funzione protettiva chaperone. Un altro accompagnatore che è stato implicato nella resistenza agli acidi di E. coli è il citoplasmatica Hsp31, che sembra stabilizzarsi proteine clienti ripiegate fino a condizioni neutre vengono ripristinati. La modalità d&#39;azione preciso di Hsp31, tuttavia, è rimasto enigmatico 12. Dato che altri batteri enteropatogeni come Salmonella mancano dell&#39;operone hdeAB, è molto probabile che potrebbero esistere altri accompagnatori periplasmatiche ancora non identificati che sono coinvolti nella resistenza agli acidi di questi batteri 11. I protocolli qui presentati consentono di monitorare l&#39;attività chaperone pH-dipendente di HdeB in vitro e in vivo 10 e possono essere applicati per investigare altri accompagnatoriquali Hsp31. In alternativa, la complessa rete di fattori di trascrizione che controllano l&#39;espressione di hdeAB può potenzialmente essere studiata con il test di stress in vivo. Per caratterizzare la funzione delle proteine chaperone in vivo, diverse configurazioni sperimentali possono essere applicati. Una via è quella di applicare proteine ​​dispiegarsi condizioni di stress e fenotipicamente caratterizzare ceppi mutanti che o iperesprimono il gene di interesse o portare una delezione del gene. Studi di proteomica possono essere condotti per identificare quali proteine non è più aggregato in condizioni di stress quando il chaperone è presente, o l&#39;influenza di un accompagnatore su un enzima specifico può essere determinato in condizioni di stress utilizzando saggi enzimatici 14-16. In questo studio, abbiamo scelto di iperespressione HdeB in un ceppo rpoH cancellazione, a cui manca il fattore sigma shock termico 32. RpoH controlla l&#39;espressione di tutti i principali E. accompagnatori coli e la sua eliminazione è noto per aumentare sensitivity a condizioni di stress ambientali che causano la proteina dispiegarsi 15. Il vivo l&#39;attività di chaperone di HdeB è stata determinata monitorando la sua capacità di sopprimere la sensibilità pH del ceppo Δ rpoH. Complessivamente, i protocolli qui presentati forniscono un approccio veloce e semplice per caratterizzare l&#39;attività di un chaperone acido attivato in vitro e nel contesto in vivo.

<table><tbody><tr><td>NEB10-beta E. coli cellule</td><td>New England Biolabs</td><td>C3019I</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-301-3</td><td></td></tr><tr><td>LB Miscela di brodo, Lennox</td><td>LAB Express</td><td>3003</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C50</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826-5kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Polimixina B solfato&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>100565</tr><tr><td>0,2 &micro; Filtro per siringa sterile a pori</td><td>m Corning</td><td>431218</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q HP (CV 5 ml)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-1153-01</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean TGX, 15%</td><td>Bio-Rad</td><td>4561046</td><td></td></tr><tr><td>Malato deidrogenasi (MDH)</td><td>Roche</td><td>10127914001</td><td></td></tr><tr><td>Potassio fosfato (monobasico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Potassio fosfato (bibasico)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>F-4500 spettrofotometro a fluorescenza</td><td>Hitachi</td><td>FL25</td><td></td></tr><tr><td>Oxaloacetate</td><td>Sigma</td><td>O4126-5G</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>N8129-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>Sigma</td><td>S9390-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma</td><td>S397-500</td><td></td></tr><tr><td>Lattato deidrogenasi (LDH)</td><td>Roche</td><td>10127230001</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Proteome Lab XL-I analitico Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td><a href='https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal.portal?_nfpb=true&_windowLabel=UCM_RENDERER&_urlType=render& wlpUCM_RENDERER_path=%252Fwsr%252Fresearch-and-discovery%252Fproducts-and-services%252Fcentrifugation%252Fproteomelab-xl-a-xl-i%252Findex.htm#2/10//0/25/1/0/asc/2/392764////0///0/%2Fwsrportal%2Fwsr%2Fresearch-and-discovery%2Fproducts-and-services%2Fcentrifugation%2Fproteomelab-xl-a-xl-i%2Findex.htm/'>392764</a></td><td></td></tr><tr><td>Centrotavola, 12 mm, Epon Charcoal-filled</td><td>Beckman Coulter</td><td>306493</td><td></td></tr><tr><td>AN-50 Ti Rotor, analitico, 8 posti</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Plus Miniprep Kit</td><td>Promega</td><td>A1470</td><td>utilizzato per la purificazione dei plasmidi (Protocollo 5.1)</td></tr><tr><td>L-arabinosio</td><td>Gold Biotechnology</td><td>A-300-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>DOT Scientific Inc</td><td>DSG36050-1000</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta cellulare a fluorescenza</td><td>Hellma Analytics</td><td>119004F-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleotidi</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 ml 3K NMWL</td><td>Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-26XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>393127</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro Varian Cary 50</td><td>Agilent Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra/Por 1 membrana per dialisi MWCO: 6 kDa</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132650</td><td></td></tr><tr><td>Unità filtranti ultra centrifughe Amicon 30K</td><td>Millipore</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>bp166-500</td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclatore a 96 pozzetti</td><td>Thermo Fisher</td><td>4375786</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento del ph-dipendente attività di<em&gt; escherichia coli</em&gt; chaperone hdeb<em&gt; in vitro</em&gt; e<em&gt; in vivo</em

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

I batteri sono spesso esposti ai cambiamenti ambientali, come ad esempio le alterazioni di pH, la temperatura, lo stato redox, l&#39;esposizione alla luce o forza meccanica. Molte di queste condizioni causare proteine ​​dispiegarsi nella cella e avere un impatto negativo sulla sopravvivenza dell&#39;organismo. Un gruppo di, chaperon molecolari indipendenti specifici di stress hanno dimostrato di svolgere un ruolo essenziale per la sopravvivenza di queste condizioni di stress. Mentre completamente piegata e chaperone-inattivo prima dello stress, queste proteine ​​rapidamente svolgersi e diventare chaperone-attiva in condizioni di stress particolari. Una volta attivato, questi chaperon condizionatamente disordinati legano ad un gran numero di differenti proteine ​​di aggregazione-inclini, prevenire la loro aggregazione e direttamente o indirettamente facilitare proteina ripiegamento su ritorno a condizioni di non-stress. L&#39;approccio principale per ottenere una comprensione più dettagliata del meccanismo della loro attivazione e cliente riconoscimento comporta la purificazione e subsequent caratterizzazione di queste proteine mediante saggi in vitro chaperone. Follow-up in saggi di stress in vivo sono assolutamente essenziali per confermare in modo indipendente l&#39;ottenuto dei risultati in vitro. Questo protocollo descrive in vitro e in vivo metodi per caratterizzare l&#39;attività chaperone di E. coli HdeB, un chaperone acido attivato. Misure di light scattering stati usati come una comoda lettura per la capacità di HdeB per prevenire l&#39;aggregazione indotta da acido di un consolidato proteine client modello, MDH, in vitro. esperimenti ultracentrifugazione analitici sono stati applicati per rivelare la formazione di complesso tra HdeB e la sua LDH proteine ​​cliente, di fare luce sulla sorte di proteine ​​clienti al loro ritorno a condizioni di non-stress. saggi di attività enzimatica della proteine ​​clienti sono stati condotti per monitorare gli effetti della HdeB sul pH indotta inattivazione del cliente e la riattivazione. Infine, studi di sopravvivenza sono stati usati per Monitor l&#39;influenza della funzione di accompagnatore di HdeB in vivo.

HdeA e HdeB sono omologhi E. proteine coli, noto per proteggere le proteine periplasmatiche contro condizioni di stress acido 10. Il nostro lavoro ha rivelato che simile a HdeA, HdeB funziona anche come un acido attivato chaperone molecolare. Tuttavia, a differenza di funzioni HdeA, HdeB ad un pH che è ancora potenzialmente battericida, ma significativamente superiore al pH ottimale di HdeA 6,9,10,22. Per studiare il pH ottimale di attività chapero...

Questo studio descrive le tecniche biofisiche, biochimiche e molecolari per caratterizzare l&#39;attività chaperone di Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri accompagnatori acido-protettivi come HdeA e può essere modificato a lavorare per altri accompagnatori e condizioni di stress.

Rilevamento del pH-dipendente attività di<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

L'obiettivo generale di questi saggi di chaperonina in vivo e in vitro è caratterizzare l'attività dipendente dal pH della chaperonina Escherichia coli HdeB in condizioni di pH acido. Le chaperonine attivate dall'acido hanno un unico compito: devono proteggere le proteine dallo svolgimento e dal degrado indotti dall'acidità. Questa funzione è particolarmente importante per i batteri enterici, che devono sopravvivere all'ambiente acido dello stomaco per colonizzare con successo l'intestino.I metodi che presentiamo qui permettono di identificare e caratterizzare chaperoni attivati dall'acidità e di definire le condizioni di pH che portano alla loro attivazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come caratterizzare i chaperoni, come HdeB, sia in vitro che in vivo, il che aiuta a decifrare il meccanismo della loro attivazione. Questi metodi sono stati applicati con successo ad altri chaperoni protettivi in condizioni acide, come HDA, e possono essere ulteriormente modificati per essere utilizzati con altri chaperoni e/o condizioni di stress.Viene monitorata l'influenza di HdeB purificato sull'aggregazione della malato deidrogenasi mitocondriale p

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Abbiamo recentemente riportato un nuovo approccio per generare sonde DNAzyme fluorogenici che possono essere applicati per impostare un semplice, "mix-e-leggere" test di fluorescenza per la rilevazione batterica. Queste sonde di DNA specifiche catalizzare il clivaggio di un cromoforo-modificato DNA-RNA chimerico substrato in presenza della miscela grezza extracellulare (CEM) prodotta da un batterio specifico, così traducendo rilevamento batterica nella generazione del segnale di fluorescenza.

Rilevazione di batteri utilizzando DNAzimi fluorogenici

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Valutazione dell'attività batterica di chaperone tramite lo spiegamento termico di una proteina modello

Fonte: Dahl, J., et al. Rilevamento dell'attività dipendente dal pH di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra l'uso di colture ricombinanti di E. coli per valutare l'effetto protettivo di un accompagnatore attivato da acido durante lo stress acido. Il monitoraggio della crescita batterica rivela una maggiore sopravvivenza nelle colture che esprimono accompagnatori rispetto ai controlli, evidenziando il ruolo degli accompagnatori nella...

Valutazione del ruolo protettivo di un chaperone attivato da acido nell'E. coli sotto stress acido

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Viene presentato un protocollo per la produzione, la purificazione e l'uso di vescicole di membrana esterna confezionate con enzimi (OMV) che forniscono una maggiore stabilità enzimatica per l'implementazione in diverse applicazioni.

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