Rilevamento del pH-dipendente attività di Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro e In Vivo

L'obiettivo generale di questi saggi chaperone in vivo e in vitro è quello di caratterizzare l'attività pH-dipendente dell'chaperone HdeB di Escherichia coli in condizioni di pH acido. Gli chaperoni attivati dall'acido hanno un solo compito da svolgere, devono proteggere le proteine dal dispiegamento e dalla degradazione delle proteine indotte dagli acidi. Questa funzione è particolarmente importante per i batteri enterici, che devono sopravvivere all'ambiente acido dello stomaco se vogliono colonizzare con successo l'intestino.

I metodi che presentiamo qui consentono di identificare e caratterizzare gli chaperoni attivati dagli acidi e di definire le condizioni di pH che portano alla loro attivazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come caratterizzare gli chaperoni, come l'HdeB in vitro e in vivo, che ti aiuta a decifrare il meccanismo della sua attivazione. Questi metodi sono stati applicati con successo per altri chaperoni protettivi dagli acidi, come l'HDA, e possono essere ulteriormente modificati per funzionare con altri chaperoni e/o condizioni di stress.

Viene monitorata l'influenza dell'HdeB purificata sull'aggregazione della malato deidrogenasi mitocondriale suina a diversi valori di pH. MDH dializzato a quattro gradi Celsius durante la notte contro quattro litri di tampone C.Quindi concentrare la proteina a circa 100 micromolari utilizzando unità di filtro centrifughe con un cutoff di peso molecolare di 30 kilodalton. Per rimuovere gli aggregati, centrifugare la proteina per 20 minuti a 20.000 volte G a quattro gradi Celsius.

Determinare la concentrazione di MDH mediante assorbanza a 280 nanomolari. Quindi preparare 50 micro litri di aliquote di MDH e congelare le aliquote per la conservazione. Posizionare una cuvetta di quarzo da un millilitro in uno spettrofotometro fluorescente dotato di portacampioni e agitatori a temperatura controllata.

Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione e ammissione a 350 nanometri. Aggiungere alla cuvetta i volumi appropriati di tampone D preriscaldato ai valori di pH desiderati. Il volume totale è di 1.000 microlitri.

Impostare la temperatura nel supporto della cuvetta a 43 gradi Celsius. Aggiungere 12,5 micromolari di HdeB al tampone, seguiti dall'aggiunta di 0,5 micromolari di MDH. Inizia a monitorare la diffusione della luce.

Incubare la reazione per 360 secondi per consentire un dispiegamento sufficiente di MDH. Aumentare il pH a sette aggiungendo un volume da 0,16 a 0,34 di due molari di fosfato dipotassico non tamponato e continuare a registrare la diffusione della luce per altri 440 secondi. Analizzare i dati come descritto nel protocollo di testo.

Trasformare il plasmide che esprime HdeB o il controllo del vettore MD, PBAD 18, nel ceppo BB7224 Delta RPOH utilizzando cellule chimicamente competenti. Questa varietà è sensibile alla temperatura e deve essere coltivata a 30 gradi Celsius. Dopo 45 secondi di shock termico a 42 gradi Celsius e prima della placcatura, incubare le celle a 30 gradi Celsius e 200 giri/min.

Eseguire la serie di singole colonie di cloni positivi e incubare durante la notte a 30 gradi Celsius. Preparare una coltura notturna in 50 millilitri di LB con ampicillina e coltivare le cellule a 200 giri/min e 30 gradi Celsius. Diluire durante le colture notturne 40 volte in 25 millilitri di LB con ampicillina.

Far crescere i batteri in presenza dello 0,5% di arabinosio a 30 gradi Celsius e 200 RPM a una densità ottica di 600 nanometri, o OD 600 pari a 1,0, per indurre l'espressione della proteina HDEB. Per gli esperimenti di spostamento del pH, utilizzare LB con ampicillina e arabinosio per diluire le cellule a un OD 600 di 0,5. Regolare i rispettivi valori di pH aggiungendo volumi appropriati di acido cloridrico a cinque molari.

Dopo i punti temporali indicati, neutralizzare le colture aggiungendo i volumi appropriati di idrossido di sodio a cinque molari. Monitora la crescita delle colture neutralizzate e della coltura liquida per 12 ore a 30 gradi Celsius utilizzando misurazioni OD. Per studiare il pH ottimale dell'attività chaperone di HdeB in vitro, l'MDH nativo è stato diluito in un tampone preriscaldato del pH indicato in presenza, o assenza, o HdeB.

Dopo 360 secondi di incubazione, l'aggregazione di MDH a 43 gradi Celsius è stata innescata attraverso la neutralizzazione. In presenza di HdeB, il segnale di diffusione della luce è significativamente diminuito dopo la neutralizzazione da pH quattro, indicando che HdeB impedisce l'aggregazione di MDH. Le misure di aggregazione sono molto sensibili alle variazioni di temperatura o al contenuto di tampone.

Per eliminare i risultati falsi positivi, è stata studiata l'influenza del buffer di archiviazione chaperone sull'aggregazione dei client. Il buffer di archiviazione HdeB non ha avuto alcun effetto sull'aggregazione MDH. Per studiare gli effetti dell'HdeB in vivo, sono stati condotti saggi di sopravvivenza pH-dipendenti utilizzando il ceppo di delezione RPOH sensibile alla temperatura.

Questa varietà è priva della maggior parte degli chaperoni ed è quindi più suscettibile a temperature elevate, pH bassi o stress ossidati. La sovraespressione dell'HdeB in condizioni di pH neutro non ha mostrato alcun effetto sul tasso di crescita del ceppo, che è cresciuto in modo comparabile al ceppo di controllo che ospita il vettore vuoto, PBAD 18. Al contrario, sono state riscontrate chiare differenze nella loro capacità di riprendere la crescita dopo i trattamenti a pH tre o a pH quattro, con il ceppo che sovraesprime HdeB che mostra un recupero migliorato in modo riproducibile dal trattamento a pH basso rispetto al ceppo di controllo.

Una volta padroneggiata, la purificazione può essere eseguita in tre giorni, il saggio di scattering in vitro in un giorno e i test di sopravvivenza in vivo in due giorni se eseguiti correttamente. Quando fai questi esperimenti, assicurati di considerare attentamente il tuo progetto sperimentale, sia per quanto riguarda il tipo di proteine client, le loro concentrazioni e le condizioni tampone che utilizzi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che aiuta a ottenere una comprensione più dettagliata del meccanismo di attivazione del chaperone e dei suoi effetti in un contesto in vivo.

E non dimenticare che studiare il pH ottimale di un chaperone protettivo acido può essere piuttosto impegnativo. Questo perché il comportamento di aggregazione della proteina cliente che utilizzi probabilmente cambierà anche con il pH. Quindi, assicurati di scegliere sistemi tampone adatti sia per il chaperone che per la proteina cliente.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come i saggi di spin down tramite pagina SCS, possono essere eseguiti nella soppressione mediata da chaperone autoquantificato dell'aggregazione dei client.